Name: E4orf4 Bağlı Hücre Ölümü üzerine Nakavt Etkilerinin Gen Ekspresyonu ve Ölçüm Şartlı Nakavt için Hücre hatları hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Keşfedin, doxycycline ile indüklenebilir shRNA kullanarak ACF1 veya SNF2h nakavtı sağlayan memeli hücre hatları oluşturma yöntemini. Bu protokol, E4orf4 kaynaklı hücre ölümünde kromatin remodelleme faktörlerinin rolünü incelemek için uygulanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser Alman-İsrail İşbirliği Projesi (DIP) çerçevesinde Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından İsrail Bilim Vakfı (Hibe 399/11), tarafından ve Araştırma Rappaport Aile Enstitüsü tarafından (kısmen) desteklenmiştir Tıp Bilimleri.

1. Indüklenebilir Hücre Hatları Üretimi <ol><li> İstenen bir hücre hatlarının hazırlanması için kullanılan tüm hücreleri öldüren ilaç G418 asgari konsantrasyonu bulmak için gereken deney öncesinde. Bu amaç için, deney sırasında kullanılan ve G418 artan konsantrasyonlarda (her bir ml için 0-1.000 mg) eklemek olacaktır ortam içinde konfluense% 70 az birkaç çift plaka plaka içinde tercih edilen hücreler. Etkin bir şekilde hücrelerini öldürür en az G418 konsantrasyonunu belirlemek için günlük hücreleri izler. Hücre ölümüne, 3-7 gün içinde görülmüştür. </li><li> Bu shRNA ifade plazmidi üzerinde çalışılan genin ekspresyonu için bir ölçüde azaltabilir geçici transfeksiyon deneylerinde tarafından doğrulanması için tavsiye edilir hücre çizgileri üretimi işleminden önce. Bu, etkin bir şekilde transfekte edilebilir herhangi bir hücre hattı içinde yapılabilir. </li><li> DMEM ortamı (% 10 Tet sy içeren 8 ml, 10 cm tabak başına 6 5x10 etrafında bir hücre yoğunluğunda plaka T-REx-293 hücrelerikök onaylı FBS, 2mM L-glutamin, ml penisilin başına 100 birim ve ml streptomisin başına 0.1 mg, ml blasticidin başına 5 mg). 37 gece boyunca inkübe plakaları ° C,% 5 CO2. </li><li> Ertesi gün, transfeksiyondan önce 8 ml taze ortam ile orta değişir. </li><li> Bir tetrasiklin H1-indüklenebilir promotör, hem de GFP birleşmesini ve bir kurucu PGK promotör tarafından yönlendirilen neomisin-direnç geni tarafından tahrik pSuperior.neo + GFP plasmidi (Şekil 1) kodlama ACF1 veya SNF2h shRNA 10 ug kullanılarak hücrelere transfekte. NaCl 150 mM ile 500 ul DNA ekleyin. Ug DNA başına 2 ul 150 mM NaCI ve 500 ul bir başka alikotu ile jetPIE reaktif ekleyin. DNA jetPIE çözüm ekleyin ve vorteks iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Yavaşça 70-80% konfluent hücreleri içeren 10 cm plakalar üzerine DNA kompleksleri Pipeti. Inkübatör plakaları dönün. </li><li> Ertesi gün olarak (bir seçici ortam ile DMEM ortamı orta değiştirmek) ml G418 başına ek 500 mikrogram içeren yukarıda tarif. </li><li> Önümüzdeki iki hafta hücreleri izlemek ve koloniler görünür ve bir mikroskop olmadan görsellenebilir kadar her 3-4 günde bir benzer taze ortam ile seçici besiyeri değiştirin için. </li><li> Kolonilerin izolasyonu önce, seçici besiyeri ile 24 kuyucuğu hazırlamak. </li><li> Gözle koloniler tanımlamak ve bir renkli bir işaretleyici kullanılarak plaka alt kısmında da yer işaretleyin. Koloniler de ayrıldığı mikroskop altında doğrulayın. </li><li> Steril kaput ise, hafifçe ılık PBS ile yıkayın ve de tüm kalan sıvı aspire, plaka orta aspire. Tripsin / EDTA plaka üzerinde tek bir koloni 0.25% 3 ul ekleyin. Hücreleri ayırmak ve 24-kuyu plaka kuyu birine eklemeniz kadar art arda tripsin pipet. Plaka üzerinde birçok koloniler için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> 37 hücreleri büyümek ° C,% 5 CO 2 kuyunun doldurana kadar. Daha sonra elde edilen hücreleri bölmeüç kuyu, ayrı bir 12-plaka her ve gece inkübe içine orijinal kolonilerin her. </li><li> Ertesi gün, çift damıtılmış su (her bir ml için 1-5 mg) &#39;de hazırlanan bir stok çözeltiden doksisiklin ml başına 1 ug ihtiva eden orta ile bir levha halinde orta değiştirin. Doksisiklin olmadan orta bir kontrol plaka orta değiştirin. 37 de 72 saat boyunca hücreler inkübe ° C,% 5 CO2. </li><li> Protein ekstreleri ve ACF1 veya SNF2h devirme verimi belirlemek için Western blot analizi hazırlanması için her bir hücre klonu da tedavi uygulanan bir ikinci ve bir hücre hasat. Bir yükleme kontrol olarak hizmet veren, aynı zamanda alfa-tübülin antikorlarının olarak ACF1 veya SNF2h antikorlar kullanın. Iyi üçüncü hücreler kullanarak, doksisiklin çalışmalar devam protein düzeyinde en az% 50 azalma sağlamıştır bulunan seçilmiş hücre klonlarının genişleme için, tedavi edilmediği. Daha sonra kullanmak için% 90 FBS,% 10 DMSO içinde, bu hücrelerin alikotları dondurun. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Nakavt ve Transfeksiyon İndüksiyon <ol><li> 10 cm tabaklar içinde seçici ortam içinde Levha hücreler. Yarım tabak ml başına 1 mikrogram de doksisiklin ekleyin ve 37 inkübe ° C, 48-72 saat (bkz. Şekil 4) için% 5 CO 2. </li><li> 48-72 saat sonra, hücreler her bir grup hücre Trypsinize saymak üzere ve aynı ortam içinde 6 cm tabak başına plaka 1.5x10 6 hücreleri, birlikte ya da doksisiklin olmadan. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 gece boyunca hücreler inkübe edin. Plan çok bölüm 2.1 &#39;dan plakaların her grup her bir nokta için DAPI tahlil için iki çiftleri yanı sıra her bir numune Western blot analizi için bir plaka (bkz. Şekil 4) içeren 6 cm oniki levhaları için hücreler sağlayacaktır. </li><li> Bir vektör 4 ug ile birlikte, bir 1 ug boş plazmid veya plazmid kodlama E4orf4 özdeş bir miktarı: Ertesi gün plazmid aşağıdaki kombinasyonları ile 6 cm tabaklar içinde hücreleri transfekteACF1-GFP ya da GFP-ifade eden SNF2h sessiz mutasyonlar, veya karşılık gelen boş vektör ve 1 ug plasmid GFP ifade eden (Şekil 4) 3 ug sokulması ile hücre klonları içinde shRNA karşı dirençli hale. Transfeksiyon karışımı hazırlamak için yukarıda tarif edildiği gibi reaktif jetPIE (5 ug DNA başına 10 ul) kullanın. Her örnek için, üç tabak için bir transfeksiyon karışımı hazırlayın. </li><li> Oda sıcaklığında jetPIE reaktif ile bir DNA 15 dakika inkübasyondan sonra, yavaşça üç 6 cm tabak üzerine her bir transfeksiyon karışımı DNA kompleksleri eşit miktarlarda, pipet ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 gece boyunca inkübe edilir. </li></ol> 3. Transfekte Hücreler DAPI Assay <ol><li> Ertesi gün, ACF1 veya SNF2h verimli nakavt edildiğini ve E4orf4 farklı örneklerdeki eşit ifade olduğunu belirlemek için Western blot analizi için numune başına bir plaka proteinler ayıklayın. </li><li> DAPI yönelik plakalar orta aspiretahlil, PBS ile yavaşça plakaları yıkama ve hücreler kapak PBS içinde hazırlanmış% 4 paraformaldehid 1 ml ekleyin. Bu kimya ile hücrelerin çözelti paraformaldehit ve tedavi hazırlanması kimyasal bir başlık içinde yapılmalıdır. Sallayarak olmadan oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. </li><li> Paraformaldehit ile 5 dakika aspire her zaman için oda sıcaklığında sallanan, üç kere PBS ile yıkayın. En az 1 saat boyunca -20 ° C, -20 ° C ile inkübe tutulur% 80 etanol ekleyin. Plakalar, bunlar etanol buharlaştırma ve kurutma önlemek için iyi bir sızdırmaz sürece birkaç gün boyunca -20 ° C&#39;de etanol altında tutulabilir. </li><li> Etanol aspire ve PBS ile iki kere yıkayın hücrelerini ve bir kez PBS-BT (PBS,% 0.5 BSA ve% 0.05 Tween-20 içeren) ile, her biri 5 dakika süre için oda sıcaklığında sallanan. </li><li> Oda sıcaklığında sallanan ise non-spesifik antikor bağlayıcı önlemek için, 20 dakika boyunca% 10 keçi serumu ihtiva eden 1 ml PBS-tampon BT hücrelerin bloke eder. Sonra t yıkayınPBS içinde iki kere BT-o hücreleri, her biri 5 dakika yıkama. </li><li> Oda sıcaklığında sallanan ise 1 saat boyunca 1 ml PBS-BT birincil antikor ile hücreler (bu durumda bir E4orf4-spesifik antikor) inkübe edin. Sonra, PBS-BT içinde iki kere yıkayın ve bir defa PBS içinde% 0.1 BSA, 5 dak, her yıkama içeren. </li><li> Karanlıkta oda sıcaklığında, 40 dakika sallama süre için uygun ikincil floresan-etiketli antikor ve DAPI ml nihai konsantrasyon başına 0.5 ug içeren PBS-% 0.1 BSA, 1 ml hücre inkübe edin. Ardından 5 dakika süreyle PBS ile yıkayın aspirasyonu ile iyice kurumasını ve tam kurumanın elde etmek gecede ek bir saat baş aşağı plakaları tutmak. Daha sonra Fluoromount-G çözeltisi kullanarak, hücreler üzerine kapak slaytlar monte edilebilir. 4 at tabak tutun ° C karanlıkta apoptotik çekirdekler saymak için hazır olana kadar. </li><li> Tarafsız bir şekilde yapılabilir böylece çeşitli örneklerde apoptotik nükleus sayma, yeni numaralar tarafından çeşitli levhalar tanımlamak için bir meslektaşım değildir. </li><li> Bir u altında hücreler görselleştirmek400X (hava) veya 630X (immersiyon yağı olarak) bir büyütme pright floresan mikroskop. Her örnek ifade çeşitli proteinler için lekeli ve transfekte hücre popülasyonu içindeki DAPI boyanarak gözlemlenmiştir özet ya da parçalanmış çekirdeklerin sayısını edilir transfekte hücreler tanımlayın. Birkaç alanları izlemek ve en az 200 transfekte hücreler toplam saymak. </li><li> Transfekte hücre popülasyonu içindeki apoptotik morfolojiye sahip çekirdeklerin yüzdesini hesaplayın. Çiftleri ile, deney tekrarlayın 2-3 kez, çeşitli örnekler arasındaki değişikliklerin istatistiksel anlamlılık hesaplamak için. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Gen ekspresyonunun şartlı devirme başarılı olmuştur ki içinde elde kolonilerin verim ilgili gen bağlı olarak değişir. Bizim eller, biz SNF2h için ACF1 ve 18 takım arasından 6 için test 12 üzerinden 7 başarılı koloniler elde edilmiştir. Şekil 2 shSeçilen hücre klonu (Şekil 2A) ve aynı zamanda, tek bir koloni (Şekil 2B) temsili bir plaka ows. Şekil 3, 72 saat için doksisiklin varlığı ya da yokluğu içinde yetiştirilen hücreler çeşitli klonlar elde edilen proteinler ile hazırlanmış bir temsilci blot göstermektedir. Blot bir yükleme kontrol olarak görev SNF2h ve alfa-tubulin antikorları ile boyandı. İki klon (sayısı 4 ve 5) doksisiklin indüksiyon üzerine SNF2h seviyelerinde güçlü bir azalma gösterdi. Şunu belirtmek gerekir ki, her ne kadar pSuperior.neo hücre hatları, neo-GFP füzyon proteinini kodlayan üretimi için kullanılan plazmid + GFP (Şekil 1), stabil hücre hatları da yeşil floresan çok düşük olduğu ve diğer GFP füzyon proteinlerinin ekspresyonu bu hücrelerin içine geçici olarak tanıttı kolayca arkaplanı yeşil floresans yukarıda tespit edilebilmiştir. Deneylerin şematik mea için hücre klonları içinde yürütülenemin ACF1 veya E4orf4 ile indüklenen hücre ölümü üzerindeki SNF2h devirme etkisi Şek. 4. Doksisiklin muamele ile gen ekspresyonu demonte için gereken zaman düzeyleri azaltılması gerekir proteinin stabilitesi bağlı olarak değişebilir. ACF1 ve SNF2h için, 72 saat tedavi protein düzeyinde etkin demonte için gerekli oldu. Şekil 5, E4orf4 ve GFP ifade eden ve bir sıkıştırılmış ya da morfolojisi ile parçalanmış DAPI-lekeli çekirdekleri ortaya çıkması ile kendini gösteren hücre ölümü geçiren hücrelerin bir örneği gösterilmiştir. Şekil 6, doksisiklin ile endüklenen ACF1 portatif bir yol olduğunu gösteren bir temsili deneyin sonuçlarını gösterir E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü (Şekil 6A) bir artış görülmektedir. Bu artış E4orf4 düzeyleri (Şekil 6B) bir artış sonucu vermedi. Ayrıca, doksisiklin ile endüklenen hücrelerin ACF1 restorasyon seviyeleri E4orf4 toksisitesinde artışa azaldığı<html> uninduced hücreleri (Şekil 6) gözlendi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1.jpg" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1highres.jpg"/> Şekil 1. Plazmid pSuperior.neo + GFP haritası. Haritası shRNA ifade ve neo-GFP füzyon proteini PGK organizatörü sürüş ifade sürüş tetrasiklin indüklenebilir H1 organizatörü gösterir. Haritayı OligoEngine pSuperior manuel uyarlanmıştır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4442/4442fig2.jpg" /> Şekil 2. Bir plaka neomisin dirençli kolonilerin tanımlanması. Görüntü koloniler (A) ihtiva eden ve bir tek koloni (B) gösterilmektedir. Koloniler neomisin içeren bir seçici ortam içinde kültürlenmesi ile 14 gün için hücreler elde edildi. ys &quot;&gt; <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig3.jpg" /> Şekil 3,. Neomisin varlığında seçilmiş çeşitli koloniler seçilmiş koloniler halinde devirme verim incelenmesi. Hücreler çift kuyu içinde ekildi. Her bir numunenin iyi bir doksisiklin (+) ile indüklendi ve bir de edilmiş ve trete edilmemiştir (-). Proteinler, 72 saat sonrası indüksiyon ekstre edilmiş ve SDS-PAGE üzerinde kromatograflanmıştır. Western Blot SNF2h ve alfa-tubulin (bir yükleme kontrol olarak görev) karşı antikorlar ile ardarda lekeli ve isteyerek ve kontrol hücrelerinde SNF2h seviyelerini gösterir oldu. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4442/4442fig4.jpg" /> Şekil 4. Tipik knockdown-DAPI tahlil denemenizi planlama. Deney Ardışık adımları ACF1 veya SNF2h demonte, ACF1 veya SNF2h ifadeyi geri veya bir emp tanıtmak için bir transfeksiyon ulaşmak için doksisiklin tedavisi de dahil olmak üzere, gösterilirty vektör ve hücre içine E4orf4 ya karşılık gelen boş bir vektör tanıtmak ve sonuçların analizi. Doksisiklin ile tedavi edilen plakalar kırmızı renkle gösterilmiştir (Dox) ve kontrol plakaları mavi renkle işaretlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4442/4442fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4442/4442fig5.jpg" /> Şekil 5,. Şekil 4&#39;te gösterildiği üzere çeşitli tedavi uygulandı DAPI tahlil ile E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü saptanması. Hücreler sabit ve Transfekte edilmiş hücrelerin çekirdeklerinin görselleştirmek için E4orf4-spesifik antikorlar ve DAPI ile boyandı. Bu, belirli bir resim, bir örnek içeren E4orf4 ve kontrol GFP protein alınmıştır. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) Birleştirilmiş görüntü. Beyaz oklar işareti GFP ve apoptotik morfolojileri ile çekirdekler içeren E4orf4 transfekte hücreler. Kırmızı oklarapoptotik çekirdekler olarak sayılmaz düzensiz şekillere sahip çekirdekler işaretleyebilirsiniz. Sadece bölünmüş Asteriskler işareti mitotik çekirdekleri veya çekirdekler. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig6.jpg" /> Şekil 6. ACF1 devirme E4orf4 ile uyarılan hücre ölümünü artırır. (A), bir tetrasiklin indüklenebilir promotör dan ACF1-shRNA eksprese eden T-Rex-293-türevi hücre hattı hücreleri doksisiklin (+ Dox) ya da sol tedavi edilmemiş (-Dox) ile oluşturuldu. Üç gün sonra, hücreler plazmid sessiz girişiyle shRNA dayanıklı hale getirildi boş bir vektör veya GFP etiketli ifade plazmid ACF1, birlikte E4orf4 (+ E4orf4) veya boş bir vektör (-E4orf4) ifade ile transfekte edildi mutasyonlar. Hücreleri yirmi dört saat E4orf4 antikorları ile transfeksiyon ve lekeli sonra ve DAPI ile tespit edildi. Hücre ölümü Asenkron yukarıda tarif edilen yöntemi ve DAPI yüzdesi o ile ölçüldüözet ya da parçalanmış nükleuslu f transfekte hücreler tespit edildi. Üç temsilcisi deney gösterilir çoğaltır ve hata çubukları standart sapma temsil eder. (B) paralel plaka hücreleri Western blot analizi için hasat edildi. Leke E4orf4, GFP ve ACF1 antikorları ile boyandı. Endojen ACF1 ve ACF1-GFP iki ayrı panel gösterilmiştir.

<ol><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+suppression+of+tumorigenicity+by+virus-mediated+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference.</a> Cancer. 2, 243-247 (2002).</li>
<li>Czauderna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+shRNA+expression+for+application+in+a+prostate+cancer+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model.</a> Nucleic acids research. 31, e127(2003).</li>
<li>Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditional+vectors+for+hairpin+siRNA+knockdowns%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns.</a> Nucleic acids research. 31, e77(2003).</li>
<li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+suppression+of+cellular+genes%3A+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of%22%5BJournal%5D)">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> Journal of. 77, 8957-8961 (2003).</li>
<li>Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenovirus+E4orf4+protein+targets+PP2A+to+the+ACF+chromatin-remodeling+factor+and+induces+cell+death+through+regulation+of+SNF2h-containing+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes.</a> Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).</li>
<li>Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+by+adenovirus+E4orf4+protein+is+cell+line-specific+and+is+mediated+by+the+death+receptor+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway.</a> J. Virol. 75, 789-798 (2001).</li>
<li>Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+type+5+E4+open+reading+frame+4+protein+induces+apoptosis+in+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells.</a> J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).</li>
<li>Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+E4orf4+protein+interacts+with+both+Ba+and+B%27+subunits+of+protein+phosphatase+2A%2C+but+E4orf4-induced+apoptosis+is+mediated+only+by+the+interaction+with+Ba%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba.</a> Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).</li>
<li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).</li>
<li>Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E4orf4%2C+a+novel+adenovirus+death+factor+that+induces+p53-independent+apoptosis+by+a+pathway+that+is+not+inhibited+by+zVAD-fmk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk.</a> J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).</li>
<li>Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenovirus+E4orf4+protein+induces+growth+arrest+and+mitotic+catastrophe+in+H1299+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells.</a> Oncogene. 28, 390-400 (2009).</li>
<li>Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -C., Robert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+E4+open+reading+frame+4-induced+apoptosis+involves+dysregulation+of+Src+family+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases.</a> J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Belirli gen ekspresyon Nakavt düzenleyici yolaklar bir protein katkısı soruşturma için önemli bir yaklaşımdır. Elzem genlerin ifade bünye knockdown olumsuz hücre çoğalmasını etkiler bu yana, yaptıkları çalışmada geçici siRNA&#39;lar giriş veya sabit koşullu devirme sistemleri uygulama ya gerektirebilir. Burada tarif shRNAs bir ilaca bağlı ifade etme yeteneğine sahip kararlı hücre çizgileri üretimi, bir çok hücre hatları etkili olmayabilir geçici Transfeksiyonlar üzerinde bir avantaj sağlar, ve tekrarlanan bir hazırlık g...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Yüksek glukoz DMEM </td><td> Gibco </td><td> 41965 </td><td></td></tr><tr><td> Tet sistemi onaylı FBS </td><td> Clontech </td><td> 631106 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Kalem Strep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.25 tripsin-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> T-Rex-293 hücreleri </td><td> Invitrogen </td><td> R710-07 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma </td><td> A1720 </td><td></td></tr><tr><td> blasticidin </td><td> InvitRogen&#39;a </td><td> R210-01 </td><td></td></tr><tr><td> plazmid pSuperior.neo + GFP </td><td> OligoEngine </td><td> VEC-PBS-0007/0008 </td><td></td></tr><tr><td> jetPIE </td><td> Polyplus transfeksiyon </td><td> 101-40 </td><td></td></tr><tr><td> doksisiklin </td><td> Sigma </td><td> D9891 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehid </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoromount-G </td><td> SouthernBiotech </td><td> 0100-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

e4orf4 bağlı hücre Ölümü üzerine nakavt etkilerinin gen ekspresyonu ve Ölçüm Şartlı nakavt için hücre hatları hazırlanması

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Memeli hücrelerinde gen ekspresyonu Fonksiyonel inaktivasyonu çeşitli yollar 1,2 ilgilendiren bir protein katkı çalışma için çok önemlidir. Kurucu zaman devirme 3-5 uzun bir süre için hücreler tarafından iyi tolere edilmez Bununla birlikte, gen ekspresyonunun şartlı devirme durumlarda gerekir. Burada ACF kromatin remodeling faktör altbirimden koşullu knockdown izin hücre hatlarının hazırlanması için bir protokol açıklar. Bu hücre hatları adenovirüs E4orf4 proteini tarafından 6 hücre ölümü indüksiyonu için ACF katkısının belirlenmesi kolaylaştırmak. ACF kromatin yeniden faktörü ACF1 ve SNF2h alt birimleri için kısa firkete RNA kodlayan diziler aynı zamanda neomisin direnç geni için bir geni içeren bir plazmid içinde bir doksisiklin-indüklenebilir promotör yanında klonlandı. Neomisin dirençli hücre klonları izole edilmiş ve G418 varlığında seçilmiştir. Sonuçta elde edilen hücre hatları ile uyarıldığındadoksisiklin tedavi, ve bir kez ACF1 SNF2h ya da ekspresyon düzeyleri azalmıştır, hücre bir plazmid kodlama E4orf4 veya boş vektör ile transfekte edildi. ShRNA yapıların belirli etkisini teyit etmek için, ACF1 veya SNF2h protein seviyeleri sessiz mutasyon dahil edilmesi ile shRNA karşı dirençli hale getirildi ifade eden bir plasmidin ACF1 veya SNF2h ile kotransfeksiyonu ile WT düzeylerine geri alındı. Çeşitli örneklerde hücre ölümünü teşvik etmek için E4orf4 yeteneği transfekte edilmiş bir hücre popülasyonunda apoptoz morfolojiye sahip çekirdeklerin görünüm frekans 7-9 ölçüldüğü bir DAPI tahlil ile belirlenmiştir. Yapıcı devirme hücre öldürücü olabilir burada açıklanan protokol durumlarda bunların protein partnerleri tarafından hücre ölümü indüksiyonu için çeşitli proteinlerin işlevsel katkı belirlenmesi için kullanılabilir.

E4orf4 ile uyarılan hücre ölümüne ACF kromatin yeniden faktör katkı ölçüldü. Protokol doksisiklin tedavi ACF alt birimleri ACF1 ve SNF2h koşullu devirme neden olduğu hücre klonlarının seçimi içermektedir, ve indüklenebilir hücre hatlarında E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü ölçmek için DAPI tahlil kullanımı.

E4orf4 Bağlı Hücre Ölümü üzerine Nakavt Etkilerinin Gen Ekspresyonu ve Ölçüm Şartlı Nakavt için Hücre hatları hazırlanması

Memeli hücrelerde gen ekspresyonunun fonksiyonel olarak inaktive edilmesi, ilgilenilen bir proteinin çeşitli süreçlere olan katkısının incelenmesi açısından kritik öneme sahiptir...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ACF1 veya SNF2H nakavtunun E4 veya f4 ile indüklenen hücre ölümü üzerindeki etkisini gözlemlemektir. Bu, ACF1 veya SNF2H srna ekspresyonunun doksisiklin eklenmesiyle koşullu olarak aktive edildiği ve ikinci bir adım olarak ACF1 veya SNF2H protein seviyelerinin azalmasıyla sonuçlanan hücre hatlarının oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Elde edilen hücre hatlarındaki hücreler, ACF1 veya SNF2H ekspresyonunu azaltmak için doksisiklin ile muamele edilir veya tedavi edilmeden bırakılır.Ardından, E4orf4; shRNA dirençli ACF1 veya SNF2H olan veya olmayan hücrelerde eksprese edilir. ACF1 veya SNF2H'nin E4orf4 tarafından indüklenen hücre ölümü üzerindeki etkisini araştırmak amacıyla, JY analizi kullanılarak apoptotik morfolojiye sahip çekirdeklerin sayılmasına dayalı olarak ACF1 veya SNF2H seviyelerinin E4orf4 toksisitesi üzerindeki etkisini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin RNA'ların geçici transfeksiyonu gibi diğer yöntemlere karşı temel avantajı, tüm hücrelerin shRNA eksprese etmesi ve geleneksel plazmid ile birlikte ko-ekspresyon gerçekleştiren hücre yüzdesinin daha yüksek olmasıdır. Bu yöntem, E4orf4 tarafından indüklenen hücre ölümünün altında yata

preparation-cell-lines-for-conditional-knockdown-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu prosedür, hücre hatları transfect ve gerçek zamanlı PCR ile gen ekspresyonu takip etmek zor içine siRNA tanıtmak için hızlı ve kolay bir iş akışını açıklar. Otomatik bir hücre sayıcı kullanımı, çok iyi elektroporasyon plaka ve otomatik elektroforez istasyonu pahalı robot işleme gerek kalmadan hızlı ve güvenilir sonuçlar sağlar.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

Burada bir insan esiRNA kütüphane ilgili genler hücre bölünmesi için yüksek verimli bir ekran kullanın. Biz nasıl bir esiRNA ekranlarının yanı sıra, sonuçları nasıl analiz etmek ve doğrulamak için kurmak ve yürütmek göstermektedir.

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Biz hızla belirlemek ve fare embriyonik kök hücre bakım ve kendini yenileme düzenleyen genlerin karakterize bir floresan reporter assay açıklar.

Fare Embriyonik Kök Hücre Bakım ve Kendini yenileme Regulate Genler Okumak Oct4GiP Reporter Assay

Kaynak: Kubala, M. H. &amp; DeClerck, Y. A. Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, Tet-indüklenebilir lentiviral shRNA sistemi kullanılarak koşullu nakavt (knockdown) kanser hücre hatlarının oluşturulmasını göstermektedir. Viral transduksiyon, antibiyotik seçimi ve doksisiklin ile indüklenen gen susturma adımları ana hatlarıyla açıklanmaktadır.

Tetrasiklin Duyarlı bir Lentiviral shRNA Ekspresyon Sistemi Kullanarak Koşullu Knockdown Hücrelerin Oluşturulması

Bu iletişim kuralı olarak bir düzeni kanser hücre satırları ve sonraki kullanımı, işlevsel bir Tet-ON sistemi kurmak için özellikle monosit/makrofajlar tümör microenvironment için işe alım içinde tümör hücre kaynaklı proteinlerin rolü eğitimi için hizmet vermektedir.

Monosit/makrofajlar tümör Microenvironment için işe alım çalışmaya kanser hücre hatlarında gen ifadesinin koşullu nakavt

Bu kanser yönetimi yüksek karşılanmamış bir tıbbi ihtiyaç olduğu hedeflenen terapötik ajanlar, Edinsel direnç mekanizmaları araştıran bir zaman ve cost effective vitro protokoldür.

Sürücü yolları için seyir elde hedefe yönelik tedavi direnci: ilaca dirençli Subclone üretimi ve duyarlılık Gene Knock-down tarafından geri yükleme

Bir gen gen işlev eğitim ilgi overexpressing bir istikrarlı hücre kültürünü kuran istikrarlı transfection-toplama tek klonlar tarafından via retroviral enfeksiyon transfecting sonra yapılabilir. İşte bu şekilde oluşturulan HT29-DR3 hücre hatları tarafından hangi ölüm reseptör 3 (DR3) antimitotics kaynaklı apoptosis katkıda mekanizmaları aydınlatmak göstermektedir.

Anti-mitotik Therapeutics apoptotik yanıtı değerlendirmek için DR3 Overexpressing hücre satırları oluşturma

Burada, kullanıcının eIF4F karmaşık dinamiklerinin ilaç kaynaklı pertürbasyonunu tarama formatlarında değerlendirmesini sağlayacak canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme

Burada , in vitro DC farklılaşması için stabil nakavt hücre hatları elde etmek için shRNA'nın lentiviral transdüksiyonunu kullanarak dendritik hücrenin (DC) gelişiminde rol oynayan potansiyel transkripsiyon faktörlerini taramak için bir protokol sunuyoruz.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücre Hattı In vitrounda Kısa Saç Tokası RNA Aracılı Gen Knockdown ile Dendritik Hücre Gelişiminin İncelenmesi Çalışması

Keşfedin, doxycycline ile indüklenebilir shRNA kullanarak ACF1 veya SNF2h nakavtı sağlayan memeli hücre hatları oluşturma yöntemini. Bu protokol, E4orf4 kaynaklı hücre ölümünde kromatin remodelleme faktörlerinin rolünü incelemek için uygulanır.

E4orf4 Bağlı Hücre Ölümü üzerine Nakavt Etkilerinin Gen Ekspresyonu ve Ölçüm Şartlı Nakavt için Hücre hatları hazırlanması

Daha fazla video keşfet