E4orf4 Bağlı Hücre Ölümü üzerine Nakavt Etkilerinin Gen Ekspresyonu ve Ölçüm Şartlı Nakavt için Hücre hatları hazırlanması

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ACF bir veya SNF iki H yıkımının E dört veya dört indüklenmiş hücre ölümü üzerindeki etkisini gözlemlemektir. Bu, ACF bir veya SNF iki H srna ekspresyonunun doksisiklin ilavesiyle şartlı olarak aktive edildiği hücre hatlarının üretilmesiyle elde edilir ve bu da ikinci adım olarak ACF bir veya SNF iki H proteini seviyelerinin düşmesine neden olur. Elde edilen hücre hatlarının hücreleri, ACF bir veya SNF iki H ekspresyonunu azaltmak için doksisiklin ile muamele edilir veya tedavi edilmeden bırakılır.

Daha sonra, S-H-R-N-A'ya dirençli ACF bir veya SNF iki H.In olan veya olmayan hücrelerde dört veya dört eksprese edilir, ACF bir veya SNF iki H'nin E üzerindeki etkisini araştırmak için dört veya dört indüklenmiş hücre ölümü sonuçları elde edilir, ACF bir veya SNF iki H seviyesinin E üzerindeki etkisini gösteren dört veya dört toksisite JY testi kullanılarak apoptotik morfolojiye sahip çekirdeğin sayımına dayalı olarak elde edilir. Bu tekniğin, RNA'ların geçici transfeksiyonu gibi diğer yöntemlere göre en büyük avantajı, tüm hücrelerin S-H-R-N-A'yı eksprese etmesi ve geleneksel plazmit ile birlikte eksprese eden hücrelerin yüzdesinin daha yüksek olmasıdır. Bu yöntem, 4 0 4'ün hücre ölümüne neden olmasının altında yatan mekanizmalar hakkında bilgi sağlar, ancak diğer protik proteinlerin çalışmasına da uygulanabilir.

Ana Lafe'ye ek olarak, laboratuvarımdan bir araştırmacı bu prosedürün bölümlerini gösterecek: İndüklenebilir hücre hatları oluşturma prosedürüne başlamak için plaka T-Rex 2 9 3 hücreleri yaklaşık beş çarpı 10 ila 10 santimetre başına altı hücre tetrasiklin içermeyen serum içeren sekiz mililitre DMEM'de plaka ve beş mikrogram mililitre blaster ile plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve Ertesi gün% 5 karbondioksit. Transfeksiyondan önce ortamı sekiz mililitre taze ortamla değiştirin. Transfeksiyon için plazmit, bir tetrasiklin ile indüklenebilir H bir promotörü tarafından tahrik edilen ACF bir veya SNF iki H-S-H-R-N-A'yı kodlayan P superior neo artı GFP plazmidinin yanı sıra GFP'yi kaynaştıran neomisin direnç geni ve kurucu bir PGK promotörü tarafından tahrik edilir.

500 mikrolitre 150 milimolar sodyum klorür ve girdaba 10 mikrogram plazmit DNA ekleyin. Daha sonra, 500 mikrolitre 150 milimolar sodyum klorür ve girdap içeren başka bir tüpe mikrogram DNA başına iki mikrolitre jet PY reaktifini ekleyin. Jet pie çözeltisini DNA'ya ekleyin ve girdap yaparak iyice karıştırın.

15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. 15 dakika sonra, DNA komplekslerini% 70 ila 80 birleşme içeren 10 santimetrelik plakalara nazikçe pipetleyin. T-Rex 2 9 3 hücre ertesi gün bir karışım.

Ortamı, bu örnekte daha önce olduğu gibi, mililitre başına 500 mikrogram G dört 18 içeren seçici bir ortamla değiştirin. Önümüzdeki iki hafta boyunca hücreleri izleyin. Seçici ortamı, koloniler ortaya çıkana kadar her üç ila dört günde bir benzer bir taze ortamla değiştirin.

Kolonileri gözle tanımlayın ve renkli bir işaretleyici kullanarak konumlarını plakanın altında işaretleyin. Mikroskop altında kolonilerin iyi ayrıldığını doğrulayın. Koloniler, mikroskop olmadan görüntülenebilecek kadar büyük olduklarında izole edilebilir.

Bu prosedürün başarısı için, koloni izolasyonu sırasında iyi ayrılmış kolonilerin seçilmesi önemlidir. Steril bir başlıkta, ortamı plakadan aspire edin. PBS ile nazikçe durulayın ve kalan tüm sıvıyı iyice aspire edin.

Hücreler plakadan ayrılana kadar tekrar tekrar evcilleştirerek plakadaki bir koloniye EDTA'da% 0.25'lik üç mikrolitre açma ekleyin. Hücreleri 24 oyuklu bir plakadaki bir kuyucukta seçici ortama aktarın. Bunu plakadaki diğer birkaç koloni için tekrarlayın.

Hücreleri kuyuyu doldurana kadar 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte büyütün. Daha sonra, her bir orijinal koloniden gelen hücreleri, her biri ayrı bir 12 oyuklu plakada üç oyuğa bölün ve ertesi gün gece boyunca inkübe edin. Bir plakadaki ortamı, çift damıtılmış suda hazırlanan bir stok çözeltisinden mililitre doksisiklin başına bir mikrogram içeren ortamla değiştirin.

Bir kontrol plakasındaki ortamı doksisiklin içermeyen ortamla değiştirin. Hücreleri 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte 72 saat inkübe edin. Bir tedavi edilmiş ve bir işlenmemiş kuyudan alınan hücreler daha sonra ACF'nin verimliliğini belirlemek için western blot analizi için hasat edilir, bir veya SNF iki H'nin yıkılması, temsili bir sonuç burada gösterilmiştir.

Bu leke SNF iki H ve alfa tübülin antikorları ile boyandı. İkincisi, klonlardan ikisini kontrol eden bir yükleme kontrolü görevi görür. Dört numara ve beş numara, doksisiklin indüksiyonu üzerine SNF iki H'de güçlü bir azalma gösterdi ve bu nedenle, bir sonraki segmentte gösterilecek olan nakavt deneyinde kullanılmak üzere seçildi.

Üçüncü plakadaki işlenmemiş hücreler, seçilen hücre hattını genişletmek için kullanılacak ve bu hücrelerin alikotları daha sonra dondurulacaktır. 10 santimetrelik plakalarda seçici ortamda ACF bir veya SNF iki H plaka hücresinin yıkılmasını indüklemek için daha fazla kullanım için, plakaların yarısına mililitre başına bir mikrogramda doksisiklin ekleyin ve 37 santigrat derece,% 5 karbondioksiti 48 ila 72 saat inkübe edin. Her bir plaka grubu, her nokta için DPI tahlili için iki kopya ve her bir numunenin batı blot analizi için bir plaka dahil olmak üzere 12 altı santimetrelik plaka için hücreleri sağlamalıdır.

İndüksiyondan 48 ila 72 saat sonra, tripsin burun, her bir hücre grubundan hücreler ve bunları saydıktan sonra, doksisiklin ile veya doksisiklin olmadan aynı ortamda altı santimetre plaka başına 1.5 kez 10 ila altı hücre plakalanır. Hücreleri ertesi gün gece boyunca 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte inkübe edin, hücreleri transfekte edin. Belirtildiği gibi.

Hem tedavi edilmemiş hem de doksisiklin ile muamele edilmiş hücreler dört şekilde üç kopya halinde transfekte edilir. Biri boş bir plazmid ve GFP'yi ifade eden bir plazmit, ikisi boş plazmid ile, ayrıca SHRA'ya dirençli ACF'yi ifade eden bir vektör, bir GFP veya SNF, iki HGFP, üçü E, dört veya dört kodlayan bir plazmit ve GFP'yi ifade eden bir plazmit ve E'yi kodlayan plazmit ile dördü, dördü de. Ve transfeksiyonu takiben SHRA'ya dirençli ACF, bir GFP veya SNF, iki HGFP ifade eden vektör, tüm plakaları gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe eder.

Hücrelerin transfeksiyonunu takip eden gün, ACF bir veya SNF iki H'nin verimli bir şekilde yere serildiğini ve E, dört veya dört tanesinin farklı numunelerde eşit olarak ifade edildiğini belirlemek için Western blot analizi için numune başına bir plakadan proteinleri çıkarın. Kalan 16 plaka DPI testi için kullanılacaktır. Ortamı DPI tahlili için amaçlanan plakalardan aspire edin ve hücreleri PBS ile nazikçe yıkayın Kimyasal bir başlıkta.

Hücrelerin üzerini örtmek için PBS'de hazırlanan %4'lük paraformaldehitten bir mililitre ekleyin, oda sıcaklığında çalkalamadan 15 dakika inkübe edin. Para formaldehiti aspire edin ve PBS ile oda sıcaklığında beş dakika çalkalayarak yıkayın. Üçüncü PBS yıkamasından sonra toplam üç yıkama için yıkamayı iki kez daha tekrarlayın: Etanol eksi 20 derecede tutuldu ve eksi 20 santigrat derecede en az bir saat inkübe edin.

Etanolü aspire edin ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, her seferinde oda sıcaklığında beş dakika çalkalayın, ardından oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir kez,% 0.5 BSA ve% 0.05 20 veya P-B-S-B-T içeren PBS ile yıkayın. Ayrıca spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için çalkalama ile. Hücreleri% 10 keçi serumu içeren bir mililitre P-B-S-B-T tamponunda oda sıcaklığında çalkalarken 20 dakika boyunca bloke edin.

Daha sonra hücreleri her yıkamada beş dakika P-B-S-B-T'de iki kez yıkayın. Hücreleri birincil antikor, bu durumda bir E dört veya dört spesifik antikor ile bir mililitre P-B-S-B-T içinde bir oda sıcaklığında çalkalarken bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra iki kez P-B-S-B-T'de ve bir kez% 0.1 BSA içeren PBS'de her yıkamada beş dakika yıkayın.

Daha sonra, hücrelere uygun ikincil floresan etiketli antikor ve mililitre başına 0.5 mikrogram içeren bir mililitre PBS% 0.1 BSA ekleyin. Son DPI konsantrasyonu, karanlıkta oda sıcaklığında çalkalarken 40 dakika inkübe edilir. Son olarak, PBS ile beş dakika yıkayın.

Kuyuyu aspirasyonla kurutun ve tam kuruma elde etmek için plakaları bir saat ila gece boyunca baş aşağı tutun ve flora Mount G solüsyonu kullanarak hücrelerin üzerine alüminyum folyo montaj kapağı kızakları ile örtün. Plakaları saymaya hazır olana kadar karanlıkta dört santigrat derecede tutun. Protokolde tarif edilen çeşitli tedavilere tabi tutulan apoptotik çekirdek hücreleri, transfekte edilmiş hücrelerin çekirdeklerini görselleştirmek için E dört veya dört spesifik antikor ve DPI ile sabitlendi ve boyandı.

Bu şekil, E'yi dört veya dört eksprese eden hücrelerin bir örneğini göstermektedir ve GFP panel A, tek başına kontrol GFP protein ekspresyonunu gösterir ve panel B, E'yi dört veya dört ekspresyon DAPI leke çekirdeğini panel C'de gösterir ve birleştirilmiş görüntüler panel D'de gösterilir. Kırmızı oklar, apoptotik çekirdek olarak sayılmayan düzensiz şekillere sahip çekirdekleri işaretler, yıldız işareti, mitotik çekirdekleri veya DAPI tarafından görselleştirilen yoğunlaştırılmış veya parçalanmış çekirdeklerin sayısını yeni bölen çekirdekleri işaretler. Testin optimal nesnelliğini korumak için transfekte edilmiş hücre popülasyonu içinde apoptotik morfolojiye sahip çekirdeklerin yüzdesini hesaplamak için boyama sayıldı.

Çeşitli numunelerdeki apoptotik nükleoların sayımı, sayan kişinin numune kimliğinin farkında olmadığı kör bir şekilde gerçekleştirildi Bu grafikte temsili bir sonuç gösterilmektedir. E dört veya dört eksprese eden hücrelerde daha yüksek nükleer anormallik yüzdeleri gözlendi, bu da T dört veya dördünün hücre ölümünü indüklediğini doğruladı. Nükleer anormalliklerin en yüksek yüzdesi, ACF bir seviyelerinin SHR ile azaltıldığı ve aracılı bir yıkımın olduğu E, dört veya dört eksprese eden hücrelerde gözlendi, bu da ACF'nin bir yıkımının E'yi, dört veya dört, Inge hücre ölümünün hücrelerde E'yi dört veya dört toksisiteyi artırdığını gösteriyor.

Düşük ACF seviyelerinin ifade edilmesi, Western blot'ta görüldüğü gibi E dört veya dört seviyelerinde bir artıştan kaynaklanmadı. Bu prosedürü gerçekleştirirken, DPI ile apoptotik nüklet stentinin tavsiye edilen sayımını kolaylaştırmayı ve bu nüklein tanımlanması için katı kriterler uygulamayı unutmamak önemlidir. Bu prosedüre ek olarak, bu prosedürü takiben DA pse'nin sonuçlarını doğrulamak için clon genic tahliller gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Ek soruları cevaplamak için koimmünopresipitasyon testleri gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Örneğin, araştırılan proteinler arasında fiziksel bir etkileşim olup olmadığı.