Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Burada, küçük müdahale eden sentetik RNA (siRNA), kimyasal bileşik ve Mycobacterium tuberculosis mutant kütüphanelerinin Yüksek verimli / Yüksek içerikli ekranları için geçerli olan fenotipik bir test açıklıyoruz. Bu yöntem, otomatik konfokal mikroskopi kullanılarak floresan etiketli konak hücre içinde floresan etiketli Mycobacterium tuberculosis'in tespitine dayanır.

Bu prosedürün genel amacı, konak gen susturma veya küçük moleküllerin mycobacterium tuberculosis, hücre içi replikasyon üzerindeki etkisi gibi fenotip modülatörlerinin etkisini ölçmektir. Bu, önce küçük moleküllerin ve 384 oyuklu plakanın dağıtılması veya hücrelerin irna ile kesilmesi ve kompleks haline getirilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, hücreleri mikobakteri tüberkülozu veya G-F-P-M-T-B eksprese eden yeşil floresan proteini ile enfekte etmek, hücreleri küçük molekül içeren kuyucuklara eklemek ve mikroplakayı beş gün boyunca inkübe etmektir.

RNAi yaklaşımı için, hücreleri RNAi transfect kompleksi içeren kuyucuklar üzerine ekleyin. Mikroplakayı üç gün boyunca inkübe edin ve daha sonra hücreleri G-F-P-M-T-B eksprese eden mikobakteri tüberkülozu ile enfekte edin. Hücreleri boyadıktan sonra, son adım, otomatik bir konfokal mikroskop kullanarak plakaları okumaktır.

Sonuç olarak, G-F-P-M-T-V hücre içi büyümedeki değişiklikleri ölçmek için otomatik floresan mikroskobu ve ardından görüntü tabanlı analiz kullanılır. Koloni oluşturan uni avcılık gibi mevcut yöntemin bu tekniğinin temel avantajı, uzun kuluçka süresinden tasarruf etmesi ve daha fazla verime izin vermesidir. Bu prosedürü gösteren Christophe Keval veya SONG ve araştırma ekibimden üç doktora sonrası araştırmacı olacak.

SI RNA kütüphane taraması ve bileşikler kütüphane taraması protokolleri, MYCOBACTERIUM tuberculosis H 37 RV kültürlerini eksprese eden iki haftalık GFP'yi kullanır. G-F-P-M-T-B bakteri süspansiyonunu hazırlamak için önce kültürü beş dakika boyunca 4.000 Gs'de santrifüjleyin, süpernatantlar Resus'u atın, kültürü DPBS'ye süspanse edin ve bu şekilde tekrar santrifüjleyin. Kültürü DPBS ile üç kez yıkayın.

Üçüncü yıkamadan sonra, süpernatı atın ve bakteri peletini RPMI 1640 ortamı içeren 10 mililitre% 10 FBS içinde yeniden süspanse edin. Bakteri agregatlarının çökelmesini sağlamak için süspansiyonu oda sıcaklığında bir saat bekletin. Bakteriyel süpernatı toplayın ve OD'yi 600 nanometrede ve GFP floresansında ölçün.

Bakteri konsantrasyonunu belirlemek için bir mikroplaka okuyucu kullanarak, 600 nanometredeki OD 0.6 ile 0.8 arasında olmalıdır. RFU değerini, aynı koşullarda hazırlanmış başka bir kültür üzerinde yapılan deneylerden önce oluşturulan CFU değerinin bir fonksiyonu olarak görüntüleyen bir referans regresyon çizgisi kullanarak süspansiyonun titresini hesaplayın. Tipik bir konsantrasyon, mililitre başına 10 ila sekiz bakteridir.

Bu prosedüre, Resus'un 96'da depolanan kurutulmuş SI RNA kütüphanesini askıya alarak başlayın. Bir X-S-I-R-N-A tamponu ile iki mikromolar konsantrasyona sahip ana plakalar. Karışımın 10 mikrolitresini 384 kuyulu bir yavru plakanın her bir oyuğuna aktarın, 2.5 mikrolitre SI RNA'yı yavru plakanın her bir oyuğundan 384 kuyulu bir tahlil plakasına aynı tahlil plakasına aktarın.

Negatif ve pozitif kontrol IRNA'larının her birine 2,5 mikrolitre ekleyin. Yardımcı plaka hemen kullanılmayacaksa, soyulabilir bir alüminyum conta ile kapatın. Sızdırmaz plaka, IRNA'ya bağlı olarak en az altı ay ve muhtemelen iki ila üç yıla kadar eksi 20 santigrat derecede saklanabilir.

Kitaplık üreticisinin önerileri. Transfeksiyon reaktiflerini, her biri için 0.1 mikrolitre sağlayacak kadar yeterli çözelti elde etmek için bir X-D-P-B-S içinde seyrelterek hazırlayın. Seyreltilmiş transfeksiyon çözeltisini oda sıcaklığında beş dakika boyunca önceden inkübe edin.

384 kuyulu tahlil plakasının her bir oyuğuna 7.5 mikrolitre seyreltilmiş transfeksiyon çözeltisi ekleyin ve tahlil plakasının her bir oyuğuna 40 mikrolitre insan tipi iki pnömosit, A 5 4 9 hücresinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. RPMI 1640 ortamında süspanse edildi % 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş. Hücreleri% 5 karbondioksit içeren bir atmosferde 37 santigrat derecede üç günlük bir kuluçka süresi boyunca koruyun. Bu hücreler her 24 saatte bir bölünür, bu nedenle transfeksiyondan üç gün sonra her kuyucukta yaklaşık 12.000 hücre bulunur.

Si'den üç gün sonra. 5 49 hücreli bir RNA transfeksiyonu, bir MTBH 37 RV GFP bakteriyel süspansiyonu hazırlar. Daha önce gösterildiği gibi.

Süspansiyon, mililitre başına 2.4 kez 10 ila altı bakteri içermelidir, bu da beşli bir enfeksiyon çokluğuna karşılık gelir. 384 kuyulu tahlil plakasındaki ortamı çıkarın ve oyuk başına 25 mikrolitre bakteri süspansiyonu ekleyin. 384 kuyulu tahlil plakasını 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içeren bir atmosferde beş saat boyunca inkübe edin.

Beş saat sonra. Ortamı çıkarın ve kalan hücre dışı bakterileri öldürmek için% 10 FBS ile desteklenmiş RPMI ortamı ile hücreleri üç kez nazikçe yıkayın. Her bir kuyucuktaki hücreleri 50 mikrolitre ile tedavi edin.

Mililitre başına 50 mikrogram Amikasin içeren taze bir R-P-M-I-F-B-S ortamı. % 5 karbondioksit içeren bir atmosferde bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Son olarak, Amikasin içeren ortamı çıkarın ve başına %10 FBS ile desteklenmiş 50 mikrolitre taze RPMI ortamı ekleyin. Kuyu.

Konfokal mikroskopi ile taramadan önce tahlil plakasını %5 karbondioksit içeren bir atmosferde beş gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu prosedüre başlamak için, oda sıcaklığında% 100 DMSO'da çözündürülmüş bileşikler kütüphanesini içeren 384 kuyulu bir ana plakayı çözün, 0.5 mikrolitre bileşiği ana plakadan ana plakadan RPMI 1640 oyuğu başına 10 mikrolitre içeren 384 oyuklu bir yavru plakaya aktarın. % 10 FPS ile desteklenmiş ortam, bir sonraki hasat altı günlük birincil insan makrofajlarını RPMI 1640'ta mililitre başına dört kez 10 ila beş hücrede hasat eder.

Orta% 10 FPS ve mililitre başına 50 nanogram ile desteklenmiştir. Rekombinant insan MCSF, seyreltilmiş birincil hücreleri, 37 santigrat derecede iki saat boyunca 90 RPM'de hafif çalkalama ile süspansiyon halinde bir ila beş arasında değişen farklı MOI'lerde bazia ile inkübe eder. Hücre dışı bakterileri uzaklaştırmak için enfekte olmuş hücreleri 350 GS'de santrifüjleme ile beş dakika boyunca yıkayın.

Resus, peletleri RPMI 1640'ta askıya alır. Ortam% 10 FPS ve santrifüj ile desteklenmiştir. Tekrar bunu tekrarlayın, son yıkamadan sonra iki kez yıkayın.

Resus, enfekte olmuş hücreleri% 10 FBS ve mililitre başına 50 mikrogram ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamında askıya alır. Amikasin, süspansiyonu 37 derece Celsius'ta bir saat hafif çalkalama, 350 GS'de beş dakika santrifüjleme ile inkübe eder. Amikasin içeren ortamı çıkarın ve enfekte olmuş hücreleri tam RPMI 1640 ile yıkayın.

Ortam% 10 FBS ve mililitre başına 50 nanogram ile desteklenmiştir. Rekombinant insan MCSF. Bu yıkamayı bir kez tekrarlayın.

Enfekte makrofaj süspansiyonunun oyuğu başına 40 mikrolitre, daha önce hazırlanan ve zaten bileşiğin seyreltmelerinin 10 mikrolitresini içeren aynı 384 kuyulu tahlil plakasına ekleyin. Her bir oyuktaki nihai DMSO konsantrasyonu şimdi% 1'dir. SI RNA kütüphanesi için konfokal mikroskopi ile taramadan önce% 5 karbondioksit içeren bir atmosferde% 5 santigrat derecede beş gün boyunca tahlil plakalarını inkübe edin. Görüntü elde edilmeden önce tarama, tahlil plakasının her bir oyuğuna PBS'de mililitre DPI başına 10 mikrolitre taze hazırlanmış 30 mikrogram ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.

Bileşik tarama için Görüntü elde etmeden önce, canlı hücreleri 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca hücre kaynaklı uzak kırmızı floresan boya ile boyayın. Test plakalarını otomatik bir konfokal mikroskoba yükleyin. Pozlama parametrelerini ayarlayın, 450 nanometrede bir emisyon filtresi ile 405 nanometrede bir uyarma lazeri kullanarak DPI floresan kaydedin.

520 nanometrede bir emisyon filtresi ile 488 nanometrede bir uyarma lazeri kullanarak GFP floresansını kaydedin. Elde edilecek kuyuları ve her kuyudaki alanları seçin, bunlar daha sonra düzenler ve alt düzenler olarak adlandırılır. Parametreler, ayarlanan parametreleri kullanarak deney dosyasını oluşturur ve otomatik alımı çalıştırır.

Bu durumda, aynı kuyu ve sahanın dört farklı görüntüsü kaydedilir ve görüntüleri uzak bir sunucuya aktarır. Daha sonra görüntüler, SI RNA taraması için acapella 2.6 görüntü analiz yazılımı kullanılarak değerlendirilir. Her alan iki kanal veya renk içerir.

Bakteriler için yeşil, hücre için mavi. Çekirdekler, bir çekirdek algılama algoritması kullanarak DAPI kanalından hücre çekirdeklerini ve bir piksel yoğunluğu özellikleri algoritması kullanarak GFP kanalından bakteri alanını algılar. Kanalları birleştirerek ve hem bakteri hem de hücreler tarafından paylaşılan piksel sayısını sayarak, hücre içi bakteriler ölçülür.

Dört alanın ortalaması olarak ifade edilen nihai sonuçlar, toplam bakteri alanı, toplam hücre sayısı, enfekte olmuş hücrelerin yüzdesi ve hücre başına bakteri alanıdır. Bileşik tarama için, her alan bakteriler için yeşil ve hücre için uzak kırmızı olmak üzere iki kanal veya renk içerir. Çekirdekler ve sitoplazma, bir piksel yoğunluğu özellikleri algoritması kullanarak uzaktaki kırmızı kanaldan hücre alanını ve GFP kanalından bakteri alanını algılar.

Kanalları birleştirerek ve hem bakteriler hem de çekirdekler tarafından paylaşılan piksel sayısını sayarak, hücre içi bakteriler ölçülür. Dört alanın ortalaması olarak ifade edilen nihai sonuçlar, toplam bakteri alanı, toplam hücresel alan, hücre içi bakterilerin toplam alanı ve hücre içi bakteri alanı ile toplam hücre alanı arasındaki orandır. Yüksek verimli genom çapında SI RNA taramasından elde edilen temsili sonuçlar burada sunulmuştur, din birin SI RNA ile ekspresyonunun susturulması, 5 49 hücrede hücre içi mikobakteri miktarının azalmasına yol açmıştır.

Bu temsili konfokal görüntülerde gösterildiği gibi, hedef olmayan IRNA ile transfekte edilmiş 5 49 hücreli veya din bir'e özgü SI RNA ile transfekte edilmiş ve beş gün boyunca MTB'yi eksprese eden GFP ile enfekte edilmiştir. GFP MT BH 37 RV yeşil ve hücreler kırmızı olarak görüntülendi. Hücre sayısı ve hücre içi G-F-P-M-T-B-H 37 RV yükü görüntü tabanlı analiz yazılımı kullanılarak belirlendi.

Bu grafik, mavi dairelerle temsil edilen beş karışık IRNA kopyasındaki enfekte olmuş bir 5 49 hücrenin yüzdesini ve kırmızı dairelerle temsil edilen bir irna'yı dinler. Üç günlük susturma ve beş günlük enfeksiyondan sonra, enfekte olmuş hücrelerin yüzdesi, hedef olmayan karıştırma IRNA ile transfekte edilen hücrelere kıyasla 5 49 hücreyi susturmuş bir din içinde yarı yarıya azalır. Z-skorunu tanımlamak için karıştırmaya kıyasla SI RNA hedefli DIN bir'in örneğe dayalı bir normalizasyonu uygulandı.

Hedeflenen bir DIN olan SI için negatif 15 civarında bir Z-skoru ortalaması elde edildi. Üç yıldız işareti, 0,0001'den küçük bir P değerini temsil eder. Bu sonuçlar, DIN bir'in si için pozitif bir kontrol olarak, MTB kolonizasyonunda yer alan diğer yeni konak faktörlerini keşfetmek için bir ekran ve yüksek içerikli bileşik taramada dins IRNA ile aynı fenotipe sahip olabilecek pnömositleri keşfetmek için bir ekran olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

Hücre içi bakteri büyümesi üzerindeki bileşik etkinliği, bir doz yanıt eğrisi veya DRC oluşturularak ve referans pozitif ve negatif bileşiklere normalleştirilerek değerlendirildi. Bu örnekte, MTBH 37 RV suşunu eksprese eden A GFP ile enfekte olmuş insan primer makrofajları, negatif kontrol olarak %1 DMSO ile veya isid, INH ve rifampisin olmak üzere iki referans bileşiğin artan konsantrasyonları ile inkübe edildi. RİF. Makrofajlar kırmızı bir floresan boya ile etiketlenir ve yeşil renk, enfekte insan makrofajlarının konfokal floresan görüntülerinin MTB analizinin, aktif bileşiklerin, konakçı hücrelerde MTB'nin hücre içi replikasyonunu etkilediğini ve mikobakteri yükünün azalmasına yol açtığını ortaya koyduğunu gösterir.

Hücre içi bakteri alanı ile toplam hücre alanı arasındaki oran hesaplandı ve daha sonra DRC'yi oluşturmak için bileşik konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizildi, burada gösterilen her grafikte isid ve rifampisin DRC'leridir. Bileşiğin DRC'si, negatif kontrol olan %1 DMSO'ya ve pozitif kontrol mililitre başına 0.1 mikrograma normalize edildi. Bu eğriler, hem bakteri kolonizasyonunun% 50'sini inhibe etmek için gereken konsantrasyonun hem de bakteri replikasyonunun% 99'unu inhibe etmek için gereken minimum konsantrasyonun belirlenmesine izin verir.

Bu, bu teknik, hücre transfeksiyonu veya bileşik hazırlama için iki saat, hücre enfeksiyonu ve mikroplakaya dağıtım için altı saat ve bir görüntü elde etmeyi sürdürmek için iki saat olmak üzere 10 saat içinde yapılabilir. Bu sekiz günlük bir süre boyunca, mikobakteri tüberkülozu ile çalışmanın son derece etkileyici olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken maske de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman giymek gibi erken gelişmiş hastalıkların her zaman alınması gerektiğini unutmayın.