Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

Bu prosedürün genel amacı, yüksek verimli bir 384 kuyucuklu plaka testi kullanarak kısa peptitlerin insan MHC iki bağışıklık proteinlerine bağlanmasını nicel olarak belirlemektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen peptitlerle solüsyon fazı kompetisyon bağlanma testlerinin gerçekleştirilmesiyle sağlanır. İkinci adımda, dengeye ulaşmuş peptit-MHC iki kompleksleri, yüksek bağlanma kapasiteli ELIZA plakalarına immobilize edilmiş bir anti-MHC iki antikoru ile yakalanır.

Ardından, yakalanan kompleksler opium işaretli streptavidin ile inkübe edilir ve ardından bağlanmamış streptavidin yıkanarak uzaklaştırılır ve yakalanan opium aktive edilir. Son olarak, yakalanan MHC two kontrol peptid seviyelerini nicelleştirmek için zaman çözünürlüklü florometri kullanılabilir. Bu yöntem, hedef proteinlerin immunojenik potansiyeline dair öncül bilgiler sağlayabilir.

Özellikle in silico tahmincilerin çıktılarını doğrulamak için yararlıdır. Prosedüre, 384 kuyucuklu yüksek bağlama kapasiteli beyaz bir ELISA plakasının her kuyucuğuna 25 µL taze seyreltilmiş L 2 43 antikor çözeltisi ekleyerek başlayın; plakayı bir polyester filmle kapatın ve 4 °C'de gece boyu inkübe edin. Ardından, her bir test maddesinin 10 mM'lık stok çözeltisiyle başlayarak.

Peptit ve DMSO kullanarak, 3 adet 84 kuyucuklu polipropilen plaka ile aşağıdaki dilüsyon serisini ve sitrat fosfat tamponunu hazırlayın. Tam bir 84 kuyucuklu polipropilen plakanın, gösterildiği gibi üç ayrı EIA plaka gerektirdiğini unutmayın. Ardından, seçilen MHC II stok çözeltilerini 15 ml'lik konik tüp kullanarak reaksiyon tamponunda 101 nM konsantrasyonuna dilüe edin.

Ardından, kontrol peptidini 20 µM'dan taze hazırlanmış MHC II master mix içerisinde 1:100 oranında seyreltin ve pozitif kontrol kuyusuna, kontrol peptidli MHC II master mix'ten 21,5 µL ekleyin. 384 kuyucuklu polipropilen plakanın her bir test peptidi seyreltisine, bağlanma reaksiyonunu bu aşamada oluşturmak için 1:1 oranında kontrol peptidi içeren MHC II master mix ekleyin. Son olarak, bağlanma reaksiyonunu bir polyester film ile kapatın ve plakayı, çalkalamadan, CO₂ kontrollü olmayan bir inkübatörde 37 °C'de 12 ila 24 saat boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, 3 84 kuyucuklu plakadaki bağlanma reaksiyon kuyucuklarını nötralizasyon tamponu ile bire bir oranda seyreltin. Ardından, ELISA plakasını her kuyucuk başına 60 µL %0,05 PBS ile üç kez yıkayın; ardından, 3 84 kuyucuklu plakadaki her bir nötralize edilmiş bağlanma reaksiyonu solüsyonundan 25 µL'lik miktarları, üç paralel şeklinde antikor kaplı 3 84 kuyucuklu plakaya aktarın.

Ardından ELISA plağındaki kuyucukları doldurun ve inkübasyon sonrası ELISA plağını polyester film ile kapatarak 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. ELISA plağını az önce gösterildiği gibi üç kez yıkayın ve ardından her kuyucuğa 25 µL taze seyreltilmiş streptavidin-biotin ekleyin. Plağı polyester film ile kapatarak oda sıcaklığında, karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, plaka başına 10 mililitre geliştirme çözeltisini karanlıkta oda sıcaklığına getirin; bir saat sonra ELISA plakasını gösterildiği gibi yıkayın, ardından her kuyucuğa 25 µL geliştirme çözeltisi ekleyin ve plakayı polyester filmle kapalı olarak karanlıkta 10 ila 15 dakika inkübe edin. Son olarak, floresanı uygun ayarlara sahip zaman çözünürlüklü bir floresan plaka okuyucu ile okuyun. Bu temsilci deneyde, Enterobacter cloae P99 beta-laktamazın olgun peptit dizisi, MHC II aleline karşı olası peptit bağlayıcılar açısından analiz edilmiştir.

Yalnızca %5 eşik değerinde, MHC sınıf II bağlanması için gerekli olan birinci konumdaki zorunlu P1 çapa kalıntısına sahip DRB1*15:01'e özgü peptidler tanımlanmıştır. Skorları 2,6'ya eşit veya daha yüksek olan peptidlerin bağlayıcı olma olasılığı yüksektir. Bu nedenle, yalnızca %5 eşik değerinde, en üstteki 11 peptidin MHC sınıf II DRB1*15:01'e bağlanacağı öngörülmektedir.

Bu MHC iki bağlanma analizinde analiz için öngörülen epitoplardan temsili bir panel seçilmiştir. Bu 15 rezidüden oluşan beta-laktamaz peptit fragmanları, muhtemel nonamer MHC iki epitopları sentetik protein fragmanlarının içine gömülecek şekilde kimyasal olarak sentezlenmiştir. Bu sentetik peptitlerin, MHC iki DRB 1 15 0 1'e bağlanma konusunda biotinillenmiş bir myelin basic protein B kontrol peptidi ile rekabet etme kapasitesi, az önce gösterildiği şekilde analiz edilmiştir.

Sentetik peptitler için rekabetçi bağlanma eğrileri burada gösterilmiştir. IC 50 değerleri, logaritmik olarak dönüştürülmüş veriler Prism'in tek bölgeli rekabetçi bağlanma doğrusal olmayan uyum fonksiyonu kullanılarak fit edilerek hesaplanmıştır. Grafikte görüldüğü ve tabloda belirtildiği üzere, peptitler geliştirilmelerinin ardından doğal olarak üç gruba ayrılmıştır: IC 50 değeri 1 µM'den küçük olan güçlü bağlayıcılar, IC 50 değeri 1 µM'ye eşit veya büyük ancak 100 µM'den küçük olan orta dereceli bağlayıcılar ve IC 50 değeri 100 µM'ye eşit veya daha büyük olan zayıf bağlayıcılar.

Bu teknik, moleküler immünoloji ve biyoterapötik tasarım alanlarındaki araştırmacıların, insan hastalarda anti protein bağışıklık yanıtlarının temelini oluşturan kilit moleküler tanıma olaylarını daha kapsamlı bir şekilde keşfetmelerinin önünü açmıştır.