Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

Bu prosedürün genel amacı, kısa peptitlerin insan MHC iki bağışıklık proteini ile bağlanmasını yüksek verimli 3 84 oyuklu plaka testi kullanarak ölçmektir. Bu, ilk olarak ilgilenilen peptitlerle çözelti fazı rekabet bağlama deneylerinin gerçekleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci aşamada, dengelenmiş peptit MHC iki kompleksi, yüksek bağlayıcı ELIZA plakaları üzerinde hareketsiz hale getirilmiş bir anti MHC iki antikoru ile yakalanır.

Daha sonra, yakalanan kompleksler streptavidin etiketli afyon ile inkübe edilir ve daha sonra bağlanmamış streptavidin yıkanır ve yakalanan afyon aktive edilir. Sonuç olarak, zamanla çözülen florometri, MHC iki yakalanan kontrol peptidinin seviyelerini ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntem, hedef proteinlerin immünojenik potansiyeli hakkında ön bilgiler sağlayabilir.

İn silico prediktörlerin çıktısını doğrulamak için özellikle yararlıdır, 3 84'ün her bir oyuğuna 25 mikrolitre taze seyreltilmiş L 2 43 antikor çözeltisi ekleyerek işleme başlayın. İyi yüksek bağlayıcı beyaz ELIZA plakası, plakayı bir polyester film ile kapattı ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe etti. Daha sonra her testin 10 milimolar stoğu ile başlayın.

Peptit ve DMSO, 3 84 kuyulu polipropilen plaka kullanarak aşağıdaki seyreltme serisini ve sitrat fosfat tamponunu yapar. Tam 3 84 kuyulu bir polipropilen plakanın, şekilde gösterildiği gibi üç ayrı ÇED plakası gerektirdiğini unutmayın. Daha sonra, seçilen MHC iki stok çözeltisini 15 mililitrelik bir konik tüp kullanarak reaksiyon tamponunda 101 nano molar konsantrasyona seyreltin.

Daha sonra kontrol peptidini taze hazırlanmış MHC iki ana karışımında 20 mikromolar dan bir ila 100 oranına seyreltin ve pozitif kontrole kontrol peptidi ile 21.5 mikrolitre MHC iki ana karışım ekleyin. 3 84 kuyucuklu polipropilen plakadan, bu sırada da bağlanma reaksiyonunu oluşturmak için test peptit seyreltmelerinin her birine bire bir oranında kontrol peptidi içeren MHC iki ana karışımını ekleyin. Son olarak, bağlanma reaksiyonunu bir polyester film ile kapatın ve plakayı karbondioksit kontrollü olmayan bir inkübatörde 37 santigrat derecede 12 ila 24 saat boyunca çalkalamadan inkübe edin.

Ertesi gün, bağlanma reaksiyonu kuyularını 3 84'te seyreltin. Nötralizasyon tamponu ile bire bir oranında kuyu plakası. Daha sonra Eliza plakasını üç kez yıkayın PBS oyuğu başına% 0.05 PBS% 20 sonraki, 3 84 oyuklu plakadan her bir nötralize bağlanma reaksiyonu çözeltisinden 25 mikrolitre 3 84 kaplı antikora üç kopya halinde.

Peki, Eliza plakası daha sonra polyester filmle kaplı ELIZA plakasını inkübasyondan sonra gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. ELIZA plakasını az önce gösterildiği gibi üç kez yıkayın ve ardından her birine 25 mikrolitre taze seyreltilmiş strep din afyon ekleyin. Polyester bir film ile kaplanmış plakayı karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, bir saat sonra karanlıkta da oda sıcaklığına plaka başına 10 mililitre geliştirme solüsyonu getirin, ELIZA plakasını gösterildiği gibi yıkayın ve daha sonra her bir oyuğa 25 mikrolitre geliştirme solüsyonu ekleyin ve polyester film ile kaplı plakayı karanlıkta 10 ila 15 dakika inkübe edin. Son olarak, afyon ayarlarına sahip zamanla çözülmüş bir floresan plaka okuyucu ile floresansı okuyun. Bu temsili deneyde, enterobacter Cloe P dokuz dokuz beta-laktamazın olgun bir peptit dizisi, MHC iki aleline varsayılan peptit bağlayıcıları için analiz edildi.

DRB bir, on beş oh bir, yüz on yedi olmayan veya peptit, MHC için gerekli olan birinci pozisyonda zorunlu bir P bir çapa kalıntısı ile tanımlandı, sadece %5'lik bir eşikte iki bağlanma. 2.6'ya eşit veya daha büyük puanlara sahip peptitler muhtemelen bağlayıcıdır. Bu nedenle,% 5 eşiğinde, sadece ilk 11 peptidin MHC'yi iki DRB 1, 15, 0, 1'e bağlayacağı tahmin edilmektedir.

Bu MHC iki bağlayıcı testinde analiz için tahmin edilen epitopların temsili bir paneli seçildi. Bu 15 kalıntının beta-laktamaz peptit fragmanları, varsayılan nonamer MHC iki epitopunun sentetik protein fragmanlarına gömüleceği şekilde kimyasal olarak sentezlendi. Bu sentetik peptitlerin, MHC iki DRB 1 15 0 1'e bağlanmak için biyotinile edilmiş bir miyelin temel protein B kontrol peptidi ile rekabet etme kapasitesi daha sonra gösterildiği gibi analiz edildi.

Sentetik peptitler için rekabetçi bağlanma eğrileri burada gösterilmiştir. IC 50 değerleri, prizmanın tek bölgeli rekabetçi bağlayıcı doğrusal olmayan uyum fonksiyonu kullanılarak log dönüşüm verilerinin uydurulmasıyla hesaplandı. Grafikte görüldüğü gibi tabloda gösterildiği gibi, peptitler doğal olarak üç gruba ayrıldı, bir mikromolar dan daha az bir IC 50 ile güçlü bağlayıcılar bir mikromolar dan daha büyük veya ona eşit bir IC 50 ile orta derecede bağlayıcılar, ancak 100'den az mikromolar ve 100 mikromolar dan büyük veya buna eşit bir IC 50 ile zayıf bağlayıcılar Geliştirilmesinden sonra.

Bu teknik, moleküler immünoloji ve biyoterapötik tasarım alanlarındaki araştırmacıların, insan hastalarda anti protein bağışıklık tepkilerinin altında yatan temel moleküler tanıma olaylarını daha tam olarak keşfetmelerinin yolunu açtı.