Protein Analiz Sürekli Tanıma Desenler oluşturma Elektronik Dil
September 16th, 2014
Elektronik dilin (eT) inşası için, algılama malzemelerinin tasarımını ve üretimini büyük ölçüde basitleştiren ve eT'nin sıvıdaki numuneler için sürekli evrim profilleri ve manzaraları oluşturmasına izin veren yeni bir yaklaşım tanımlanmıştır. Elde edilen eT, ayrımcılık gibi yaygın protein analizi için etkilidir.
Aşağıdaki deneyin genel amacı, kombinatoryal bir yaklaşıma dayalı bir elektronik dil oluşturmak ve protein analizi için yüzey plazması ve rezonans görüntüleme yapmaktır. Bu, laktoz ve sülfatlanmış laktozun yapı taşları olarak kullanılması ve karışımlarının, bir dizi kombinatoryal çapraz reaktif reseptör oluşturmak için kendi kendine montaj için bir prizmanın altın yüzeyine bırakılmasıyla elde edilir. İkinci adım yüzey olarak, bağlanma olaylarını gerçek zamanlı olarak izleyen ve SPR görüntüleri ve sensör gramları adı verilen bir dizi kinetik bağlanma eğrisi üreten plazma ve rezonans görüntüleme uygulanır.
Daha sonraki veri işleme, her örnek için bir 2B sürekli evrim profili ve bir 3B sürekli evrim manzarası oluşturmak için bir matematik hesaplama yazılımı kullanılarak sensör gramlarına dayalı olarak gerçekleştirilir, sonuçlar, elektronik dilin ortak saflaştırılmış proteinler için farklı 3B sürekli evrim manzaraları oluşturabildiğini ve örüntü tanımaya dayalı ayrımları için verimli olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin klasik, elektronik gnosis ve diller gibi mevcut yöntemlere göre çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, şarkı reseptörlerinin hazırlanması büyük ölçüde basitleştirilmiştir.
Çok çeşitli çapraz reaktif reseptörler, az sayıda molekülü karıştırarak tercih edilebilir. İkincisi, birleştirici yaklaşım sayesinde, elektronik dilimiz tarafından üretilen tanıma kalıpları sürekli olarak kabul edilebilir, böylece anormal sinyaller daha kolay tanımlanabilir. Bu nedenle, kombinatoryal çapraz reaktif reseptör dizisini hazırlamak için daha güvenilir analiz elde edilebilir.
İlk olarak, prizmanın altın yüzeyini kullanmadan 48 saat önce bir plazma temizleyici ile %75 oksijen, %25 argon, 0.6 milibar ve 40 watt güç altında üç dakika temizleyin. Daha sonra% 10 gliserol veya PBSG içeren 100 mililitre fosfat tampon çözeltisi hazırlayın. PBS'ye gliserol eklenmesi, biriktirildikten sonra çözücü buharlaşmasını ve yapı bloğundaki veya BBB konsantrasyonundaki değişiklikleri azaltmak için çok önemlidir.
Daha sonra laktoz veya yapı bloğu bir ve sülfatlanmış laktoz veya stok çözeltilerinden yapı bloğu iki stok çözeltileri hazırlayın. %10'luk artışlarla sıfır ile %100 arasında oranlara sahip 11 saf ve karışık çözelti hazırlayın ve PBSG'de toplam yapı taşı konsantrasyonu 0.1 milimolar olan bu saf ve karışık çözeltilerin sekiz nanolitrelik damlacıklarını prizma yüzeyine biriktirin, toplam 44 nokta olan her oran için dörtlü çift halinde temassız bir gözcü kullanın, prizmayı bir mililitre ultra saf su içeren bir Petri kabının içine yerleştirin ve gece boyunca bırakın. Buradaki altın yüzey üzerinde BB one ve BB two'nun kendi kendine montajı için oda sıcaklığı. Karışık kendi kendine monte edilmiş tek tabakalardaki ortalama yüzey bileşiminin, biriktirme karışık çözeltisinin bileşimini yansıttığı varsayılmaktadır.
Ertesi gün, prizmayı Argonne akışı altında kurutmadan önce ultra saf suyla iyice yıkayın. Protein algılama sırasında sıcaklık değişiminin neden olduğu kırılma indisi değişikliklerini önlemek için yüzey plazması ve rezonans görüntüleme cihazlarının 25 santigrat dereceye yerleştirildiği inkübatörü ayarlayın. Bilgisayar kontrollü bir şırınga pompasına, bir tatlıya ve altı portlu bir orta basınçlı enjeksiyon valfine bağlı 10 mikrolitrelik polieter eter keton akış hücresine işlevsel olmayan bir durulama prizması yerleştirin.
Akış sistemini yeni filtrelenmiş ve Degas yığınları çalışan arabellekle doldurun. Durulama prizmasını çıkarın ve kombinasyonel Çapraz reaktif reseptör dizisini içeren prizmayı dakikada 100 mikrolitrelik bir akış hızında akış hücresi çalışma yığınlarına yerleştirin. CCD kameranın yardımıyla, çalışma tamponunu geçerek prizma yüzeyinde bulunan hava kabarcıklarını temizleyin.
Dizinin iyi kontrastlı bir görüntüsüne dayalı olarak ilgilenilen alan için aynı çapta bir daire çizerek her nokta için çalışma alanını hızlı bir şekilde tanımlayın ve yüzey plazması ve rezonans görüntüleme sistemindeki entegre yazılımın yardımıyla, tüm noktalar için gelen açının bir fonksiyonu olarak yansıtma eğrilerini temsil eden iz plazma eğrileri. Yansıtma eğrilerinin en yüksek eğiminde kinetik eğrilerin kaydedileceği konum olan çalışma açısını seçin. Kinetik ölçümler için seçilen çalışma açısını sabitlemek için tarama aynasını döndürün.
Tüm noktalar için yansıtma sinyali sabit ve sabit olana kadar akış sistemi boyunca yığınlar halinde çalıştırmaya devam edin. Daha sonra, akış hızı dakikada 100 mikrolitreye ayarlanmış şekilde enjeksiyon valfi yük konumundayken 500 mikrolitrelik numune döngüsüne bir mililitre fıstık lektini veya bir HL çözeltisini enjekte etmek için bir şırınga kullanın, enjeksiyon valfini enjeksiyon konumuna getirin. Protein enjeksiyonunun sonundaki tüm noktalarda zamana karşı yansıtma değişimlerini eş zamanlı olarak izleyerek kinetik ölçümlere başlayın.
Diziyi sekiz dakika boyunca çalışan arabellekle durulayın. Son olarak, diziyi yeniden oluşturmak için bir mililitre %1 DS enjekte edin. Protein çözeltisinin akış hücresine girmesini takiben diğer proteinler için de aynı işlemi tekrarlayın.
Moleküler bağlanma meydana gelir ve plazma eğrilerinde bir kaymaya ve bir refleksivite varyasyonuna neden olur. Görüntü elde etme yazılımı, ölçülen ışık yoğunluğu değerlerini gri ölçek seviyelerine dönüştürerek SPR görüntüleri verir ve sensör gramlarını veren zamana karşı yansıtıcılık varyasyonu oluşturur. Ardından, her örnek için bir 2B sürekli evrim profili oluşturmak için her protein enjeksiyonunun sonundaki yansıtıcılığı yapı taşı oranına karşı çizmek için bir matematik hesaplama yazılımı kullanın.
Son olarak, ortak protein analizi için elektronik dilin yeteneğini araştırmak üzere her protein için bir 3D sürekli evrim manzarası adı verilen zamana bağlı bir sürekli tanıma modeli oluşturmak için yapı taşı oranını sensör gramlarına ekleyin, üç protein kullanıldı: her protein için bir HL miyoglobin ve lizozim. 3D olarak gösterildiği gibi elektronik dil tarafından farklı bir 2D sürekli evrim profili oluşturuldu. Bir HL miyoglobin ve lizozim için sürekli evrim manzaraları da üretildi.
Elektronik dil, hidrofobik, nötr ve yüklü amino asit kalıntılarının dağılımı gibi proteinlerin yüzey özelliklerine duyarlıdır. Manzaraların elde edilen sürekli evrim profilleri, verimli protein ayrımı ve örüntü tanımaya dayalı ileriye dönük tanımlama için parmak izi olarak kullanılabilir. Bu yaklaşımı denerken, elektronik dilin iyi bir şekilde tekrarlanabilirliğini sağlamak için optimize edilmiş ve standartlaştırılmış deneysel prosedürleri takip etmeyi unutmamak önemlidir.
Bu prosedürler, prizmanın temiz ve iyi yüzeyini, yüzey plazma rezonans görüntüleme için çalışma açısının seçilmesini ve sistemi yeniden kullanım için tamamen yenilemek için uygun çözeltinin uygulanmasını içerir. Bu videoyu izledikten sonra, protein analizi için COMBINATOR yaklaşımına ve SOFA plazma rezonans görüntülemeye dayalı olarak elektronik dilin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Deneyleriniz için iyi şanslar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, sensör malzemelerinin tasarımını ve üretimini basitleştiren yeni bir elektronik dil (eT) yapım yöntemi sunmaktadır. eT, sıvı örnekler için sürekli evrim profilleri ve manzaraları oluşturma yeteneğine sahip olup, protein analizi ve ayrımında verimlilik göstermektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyoteknoloji
- Analitik Kimya
Arka Plan
- Elektronik diller, insan tat algısını taklit eden cihazlardır.
- Karmaşık sıvı örneklerini analiz etmek için kullanılırlar.
- eT'lerin yapımı için mevcut yöntemler karmaşık ve zaman alıcı olabilir.
- Bu çalışma, eT tasarımı ve üretiminin verimliliğini artırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Kombo yaklaşım kullanarak bir elektronik dil oluşturmak.
- Protein analizi için yüzey plazma ve rezonans görüntüleme yapmak.
- Saflaştırılmış proteinler için farklı 3D sürekli evrim manzaraları oluşturmak.
Kullanılan Yöntemler
- Yapı taşları olarak laktoz ve sülfatlı laktoz kullanımı.
- Altın yüzey üzerinde alıcı dizilerinin kendiliğinden birleşimi.
- Bağlanma olaylarını izlemek için yüzey plazma ve rezonans görüntülemesinin uygulanması.
- 2D ve 3D sürekli evrim profilleri oluşturmak için veri işleme.
Ana Sonuçlar
- Elektronik dil, protein analizi için başarılı bir şekilde farklı 3D manzaralar oluşturur.
- Yaygın saflaştırılmış proteinler arasında ayrım yapmada verimlilik gösterir.
- Yöntem, tek alıcıların hazırlanmasını basitleştirir.
- SPR görüntüleme ile bağlanma olaylarının gerçek zamanlı izlenmesi sağlanır.
Sonuçlar
- Yeni eT yapım yöntemi, geleneksel tekniklere göre önemli avantajlar sunar.
- Protein analizi ve ayrımında verimliliği artırır.
- Bu yaklaşım, biyokimyasal algılama alanında daha geniş uygulamalara yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
The electronic tongue (eT) platform described enables rapid generation of cross-reactive receptor arrays for protein discrimination, addressing a key bottleneck in early-stage biomarker and target validation workflows. By producing continuous recognition patterns (2D CEP and 3D CEL) via SPRi, the method supports mechanistic de-risking through label-free, real-time binding kinetics. This approach enhances predictive confidence in protein target engagement assays, particularly for complex mixtures where traditional single-target sensors may fail.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through pattern-based discrimination of purified proteins, reducing reliance on single-target assumptions.
- Operational Value: Simplifies receptor array preparation using only two building blocks (lactose and sulfated lactose) to generate diverse cross-reactive sensors.
- Predictive Value: Generates continuous evolution landscapes that serve as protein-specific fingerprints, improving target selectivity assessment in discovery screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Creates standardized, reproducible sensor arrays via controlled self-assembly of building block mixtures on gold surfaces.
- Quantitative Output: Produces sensor grams and continuous evolution profiles that quantify binding responses across varying building block ratios.
- Scalability: Supports high-density spotting (44 spots in quad duplicate) for parallel protein analysis, enabling assay miniaturization and reuse.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: The eT’s sensitivity to surface amino acid distributions (hydrophobic, neutral, charged) allows alignment with disease-relevant protein variants.
- Mechanistic De-risking: Continuous recognition patterns help distinguish specific from non-specific binding, reducing false positives in preclinical target validation.
- Biomarker Alignment: Distinct 3D CELs for proteins like myoglobin and lysozyme demonstrate potential for fingerprinting biomarker candidates in complex fluids.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing orthogonal protein characterization data after initial hit identification but before lead optimization, particularly for targets requiring conformational or surface property analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by generating differential recognition patterns for proteins with similar sequences but different surface properties.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible surfaces with quantitative kinetic outputs (sensor grams) for comparing protein interactions.
- Analytics: Enables data-driven comparison via 2D CEP (end-point binding vs. ratio) and 3D CEL (time-resolved binding landscapes) for pattern-based classification.
- Translational Research: Connects to preclinical work by offering a reusable platform for monitoring protein variants or post-translationally modified forms.
- Enterprise Reuse: The combinatorial approach allows regeneration (via 1% DS injection) and reuse of the same array across multiple protein targets, reducing reagent costs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein interaction studies through continuous, label-free monitoring of binding events.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized surface preparation (plasma cleaning, overnight self-assembly) and defined working angle selection for SPRi.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing multi-parametric recognition patterns that capture complex binding behaviors missed by endpoint assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of protein targets based on unique fingerprints, decreasing late-stage failure due to unanticipated binding profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface plasmon resonance imaging and microfluidic flow cell setup.
- Depends on non-contact spotter precision for nanoliter droplet deposition and plasma cleaning equipment for surface preparation.
- Necessitates cross-team standardization of building block ratios, PBSG buffer conditions, and regeneration protocols (1% DS) for reproducible results.
- Adaptation to other model systems may require re-optimization of building block choices and self-assembly conditions based on surface chemistry.
- Practical limitations include sensitivity to solvent evaporation (mitigated by 10% glycerol in PBSG) and the need for air bubble removal during flow cell setup.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:57
Preparation of the Combinatorial Cross-reactive Receptor (CoCRR) Array
3:45
Protein Sensing by Surface Plasmon Resonance Imaging (SPRi)
6:05
Data Processing and Analysis
6:54
Results: Continuous Evolution Profiles and Landscapes for Protein Analysis
7:47
Conclusion
