Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Bu prosedürün genel amacı, tip bir ve üç interferon alt tipleri gibi oldukça homolog bir gen grubunun yüksek verimli analizi için 384 kuyulu tahlil plakasını hazırlamak ve çalıştırmaktır. Bu, önce tahlil plakalarını çalıştırmak için kullanılan standart seri seyreltmenin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, astar probu ve plakaları yapmak için kullanılan şablon kontrolü olmayan çalışma stoğu karışımları hazırlanır.

Daha sonra 384 kuyulu tahlil plakası, otomatik çok kanallı bir pipetleyici kullanılarak hazırlanır ve saklama için kurutulur. Son olarak, 384 kuyulu tahlil plakası çalıştırılır ve analiz edilir. Sonuç olarak, yüksek verimli kantitatif gerçek zamanlı RT PCR R testi, doku kültürü modellerinde, patojenleri inceleyen veya bulaşıcı veya otoinflamatuar hastalıklar bağlamında klinik örneklerde interferon ekspresyon imzalarını tanımlamak için kullanılır.

Bu tekniğin, standart doğrusal problar veya siber yeşil kullanan kantitatif R iki PCR gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, moleküler işaret ve kilit nükleik asit floresan problarının, standart ve somon spermi veya S-S-D-N-A'nın çözülmesi, girdaplanması ve kısaca santrifüjlenmesinden sonra, oldukça benzer diziler arasındaki tek baz çifti farklılıklarını ayırt etmek için kullanılabilmesidir. 51 mikrolitre S-S-D-N-A'yı 20,3 mililitre su ile karıştırarak 17 standart seyreltme seti için SSD NA su karışımını hazırlayın. 190 mikrolitre SS DNA su karışımını sekiz tüplü bir PCR şeridinin ilk tüpüne ve 180 mikrolitreyi sonraki beş tüpe dağıtın.

50 Picomolar standart stoktan 10 mikrolitreyi 190 mikrolitre S-S-D-N-A su karışımı girdabı ile tüpe aktararak ve hızlı bir şekilde santrifüjleyerek bir ila 20 seyreltme gerçekleştirin. PCR şeridi, en son seyreltilmiş tüpten 20 mikrolitreyi seri girdabındaki bir sonraki tüpe aktararak bir ila 10 seyreltme gerçekleştirir ve PCR şeridini hızlı bir şekilde santrifüjler. Serideki son tüp standardı alana kadar bir ila 10 seyreltmeyi tekrarlayın.

17 adet iki mililitrelik tüpü etiketledikten sonra, metin protokolüne göre hazırlanmış primerler ve problar kullanarak her tüpe iki mikrolitre S-S-D-N-A eklemek için 12,5 mikrolitrelik elektronik çok kanallı pipet kullanın. Her astara uygun ileri astarı, ters astarı ve probu ekleyin. Prob seti, şablon kontrolü veya NTC çalışma stoğu karışımlarını hazırlamak için çalışma stoğu tüpü.

Her bir astar prob setinden 14.3 mikrolitreyi bu tabloya göre uygun NTC çalışma stoğu karışım tüpüne aktarın. NTC çalışma stoğu için gerekli olan astar prob setlerinin bir Eloqua'sının çıkarılmasının ardından, her bir astar prob seti çalışma stoğu tüpünün nihai hacmini 1,7 mililitreye getirmek için 1,5 mililitre suda karıştırılır. Astar prob setleri ve NTC karışımları için 96 kuyulu bir kaynak plakası hazırlamak için.

Soğutulmuş 96 kuyulu soğutma bloğuna yeni bir 96 kuyulu plaka yerleştirin ve 250 mikrolitrelik elektronik çok kanallı pipet kullanarak kuyuları doğru astar prob seti veya NTC karışımı ile belirleyin. Her astar prob setine 66 mikrolitre su ekleyin. Dört hedef 17 kuyuya 82,5 mikrolitre su dağıtın.

Her anti C karışımına 27,5 mikrolitre su dağıtın. Daha sonra, kuyu dağıtımında belirlenen primer problarına çalışma stoğunda 54 mikrolitre doğru primer prob ekleyin. Hedef 17 primer Probu çalışma setinin 67,5 mikrolitresi, kuyularda belirlenen hedef 17 primer prob stoğuna sahiptir.

Belirlenen kuyucuklara 22,5 mikrolitre doğru NTC çalışma stoğu karışımı ekleyin. Ardından, 96 kuyulu plakayı kapatmak için bir yapışkan plaka contası kullanın ve içeriğin 96 kuyulu adaptörle kuyuların dibinde olduğundan emin olmak için 700 Gs'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Plakayı vorteks karıştırıcıya yerleştirin ve 1000 RP'de bir dakika karıştırın.

Daha sonra plakayı 700 Gs'de beş dakika santrifüjleyin. 384 kuyulu tahlil plakalarını hazırlamak için, otomatik çok kanallı pipetleyiciyi açın ve platformu kurmak için interferon tahlil plakaları yapma protokolünü açmak için yazılım simgesine çift tıklayın. Tamamen dolu bir pipet ucu kutusunu birinci platform konumuna, 96 kuyulu kaynak plakasını dördüncü konuma ve yeni bir 384 kuyulu plakayı altıncı konuma yerleştirin.

Koşu tamamlandığında oynat düğmesine basarak koşuya başlayın. Sıvıların kuyuların dibinde olduğundan emin olmak için 384 kuyulu tahlil plakasını düz bir yüzeye hafifçe vurun ve plakayı bir dakika boyunca 700 Gs'de döndürdükten sonra yapışkan bir plaka contası uygulayın. Yapışkan plaka contasını çıkarın.

384 kuyulu tahlil plakasını plakalı kurutucuya yerleştirin ve 384 kuyulu manifoldu doğrudan kuyuların üzerine yerleştirin. 384 kuyulu tahlil plakasının içeriği kuruduktan sonra. Yeni bir yapışkan plaka contası, hızlı folyo etiket uygulayın ve tahlil plakasını yüklemek ve çalıştırmak için kullanana kadar karanlıkta dört santigrat derecede saklayın.

İki mikrolitre S-S-D-N-A'yı 84.9 mikrolitre su içinde seyrelterek iki temizlik geni veya HKG kuyusu karışımı hazırlayın. Daha sonra iki mikrolitre seyreltilmiş SSD NA 11.8 mikrolitre su, 23 mikrolitre ana karışım ve 9.2 mikrolitre doğru 20 XHKG primer Prob setini etiketli her bir HKG tüpüne, vortekse ekleyin ve numuneleri ve pozitif kontrol CDNA'sını hazırladıktan sonra kısa bir süre santrifüjleyin 78.8 mikrolitre ana karışım ve 54.8 mikrolitre su her 24 mikrolitre numune ve pozitif kontrol tüpüne. Kurutulmuş 384 kuyulu bir tahlil plakasına eklenecek standartları ve NTC kuyu karışımlarını hazırlamak için, 1,5 mililitrelik bir tüpte 275 mikrolitre ana karışıma 165 mikrolitre su ekleyin; NTC kuyusu için 52,5 mikrolitre suya 1,5 mililitrelik bir tüpte 52,5 mikrolitre ana karışıma karıştırın.

Önceden hazırlanmış kurutulmuş bir 384 kuyulu tahlil plakasını dört santigrat dereceden çıkarın ve bir dakika boyunca 700 GS'de santrifüjleyin. 30 mikrolitrelik elektronik çok kanallı pipet ile 7,5 mikrolitre NTC dağıtın. Her NTC'ye iyi karıştırın.

Her bir standarda altı mikrolitre standart iyi karıştırın ve 1,5 mikrolitre standart dağıtın. Daha sonra 7,5 mikrolitre numuneyi 12,5 mikrolitrelik elektronik çok kanallı pipet ile belirlenen kuyucuklara dağıtın. Plakayı ve santrifüjü bir dakika boyunca 700 Gs'de kapatmak için optik yapışkan film kullandıktan sonra 2.5 mikrolitre HKG astar Probu karışımlarını belirlenen kuyucuklara dağıtın, kapalı 384 oyuklu plakayı girdap karıştırıcısında 2.600 RPM'de iki dakika boyunca vorteksleyin ve 700 peynirde beş dakika santrifüjleyin.

Son olarak, mühürlü tahlil plakasını Q-R-T-P-C-R makinesine yerleştirin. Test düzeni için şablonu açın ve aşağıdaki reaksiyon koşullarını kullanın. Çalıştırmaya başlayın, verileri metin protokolüne göre dışa aktarın ve analiz edin Bu şekilde görüldüğü gibi, insan tipi bir ve üç interferon ekspresyon imzaları, periferik kan mononükleer hücrelerinde veya toll benzeri reseptör ligandları ile uyarılan altı donörden alınan p BMC'lerde analiz edildi.

Veriler, temizlik genine normalize edilmiş mutlak CQ değeri ve toplam RNA'nın mikrogramı başına şablonun kopya sayısı dahil olmak üzere iki analiz yöntemi kullanılarak bir günlük ölçeğinde radar çizelgeleri olarak sunulur. Veriler, TLR agonistleri tarafından ortaya çıkan insan interferon ekspresyon imzalarının, Resus Maccas'ta tip bir ve üç interferonun ligand spesifik ekspresyon imzaları olduğunu göstermektedir. Bu deneyde ayrıca TLR ligandı spesifik olsaydı, üç donörden PBMC üç saat boyunca üç ligand ile uyarıldı.

Başlangıçta uyarılmamış hücrelerde interferon alt tip ekspresyonu burada gösterildiği gibi düşüktü. LPS ve poli iK'e yanıt olarak sınırlı sayıda interferon alfa alt tipi eksprese edildi. Buna karşılık, imiquimod'a yanıt olarak interferon ekspresyonu yüksekti ve alt tip ekspresyonu, interferon beta ve interferonun geniş ekspresyonu idi.

Lambda bir, üç TLR agonistinin tümü tarafından geliştirilmiştir Bu videoyu izledikten sonra, tip bir ve üç interferon alt tipleri gibi oldukça benzer bir gen grubunun yüksek verimli analizi için dört kuyulu tahlil plakasının nasıl hazırlanacağı, çalıştırılacağı ve analyze. 3D iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.