İfadesi için HeLa Tabanlı Hücre Özgür İfade Sistemleri Plasmodium Rhoptry Proteinler

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hela bazlı hücresiz ekspresyon sistemlerini kullanarak plazmodyum proteinlerini çevirmek ve proteinleri mikro hacimlerde çevrilmiş üründen saflaştırmaktır. Bu, sıtma rekombinant RT ağacı proteinlerinin hücresiz ekspresyonu olan iki aşamalı ve bir aşamalı in vitro translasyon için rekombinant plazmitleri hazırlamak için plazmodyum genlerinin klonlanmasıyla elde edilir. Rekombinant proteinleri çevirmek için hazırlanan plazmit, transkripsiyon karışımı ile inkübe edilir.

mRNA'yı kopyalayan iki aşamalı ekspresyon sistemi kullanılırken, elde edilen mRNA daha sonra protein translasyonu için translasyon karışımına eklenir. Tek adımlı ekspresyon sistemi kullanılırken, rekombinant plazmit, rekombinant proteinlerin transkripsiyonu ve translasyonu için hela hücre lizatı ile inkübe edilir. Rekombinant proteinler daha sonra mikro hacimlerde translasyon ürününden saflaştırılır.

Sonuçlar, batı lekeleme analizine dayalı olarak başarılı bir ekspresyon ve saflaştırma göstermektedir. Bu tekniğin buğday tohumu ekspresyon sistemi ve tavşan retikülosit lizat sistemi gibi diğerlerine göre temel avantajı, bu sistemin proteinleri üç saat içinde eksprese edebilmesidir. Kodlama optimizasyonu gerekmez.

Uygun fiyatlı ve kullanımı kolaydır. Çoklu antijenler mikrodiziler üzerinde taranabilir, bu da tedavi ve tanı için antijenlerin saptanmasını mümkün kılar. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, proteinleri mikro hacimlerde ifade eden ve protein saflaştırmasını son derece zorlaştıran hücresiz ifade olduğu için mücadele edeceklerdir.

İlk olarak, e coli kullanarak eksprese proteinleri patlatamadığımız ve diğer ekspresyon sistemlerini çok pahalı ve zaman alıcı bulduğumuz için bu sistemi kullanma fikrimiz vardı. Bu çalışmada hela tabanlı hücresiz ekspresyon sistemini alternatif bir sistem olarak incelemeye karar verdik. İki aşamalı insan in vitro protein ekspresyonu için metin protokolünde açıklandığı gibi rekombinant plazmit vektör DNA içeren 20 mikrolitre transkripsiyon karışımı hazırlayın.

DNA şablonlarını kullanma. Bileşenleri bir mikro santrifüj tüpünde karıştırın ve bir su banyosunda 30 santigrat derecede 75 dakika inkübe edin. Daha sonra transkripsiyon karışımından iki mikrolitre alın ve hela hücre lizatı içeren 23 mikrolitre translasyon karışımına ekleyin.

Elde edilen karışımı 30 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin. Tercüme edilen ürünleri eksi 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, rekombinant plazmit vektörü, DNA ve DNA şablonları için bir adım insan birleştirilmiş in vitro translasyon protein ekspresyonu için metin protokolünde açıklandığı gibi bir lizat içeren 25 mikrolitre transkripsiyon ve translasyon karışımı hazırlayın.

Bu reaksiyon karışımını 30 santigrat derecede 90 dakika ila altı saat arasında inkübe edin ve çeviri ürünlerini eksi 20 santigrat derecede saklayın. İfade edilen rekombinant proteinleri saflaştırmak için, 100 mikrolitre saflaştırma karışımı yapmak için 25 mikrolitre translasyon ürününe 75 mikrolitre bir X saflaştırma tamponu ekleyin. 300 mikrolitre damıtılmış su ve 300 mikrolitre bağlayıcı tampon ekleyerek nikel reçinesini iki kez yıkayın.

Fazla etanolü çıkarmak için reçineyi ve santrifüjü bir dakika boyunca 14.000 Gs'de yeniden süspanse edin. Daha sonra, hazırlanan saflaştırma çözeltisinden 100 mikrolitre nikel şelatlama reçinesine ekleyin ve karışımı bir ucunda inkübe edin. Çalkalayıcıyı oda sıcaklığında 60 dakika boyunca sonlandırın.

Karışımı bir dakika boyunca 14.000 Gs'de santrifüjleyin ve süpernatı akış olarak etiketlenmiş taze bir tüpe toplayın. Reçineyi 100 mikrolitre bir x yıkama tamponu ile yıkayın, ardından 14.000 GS'de bir dakika santrifüjleyin ve süper adı yıkama etiketli yeni bir tüpte toplayın. Yıkamadan sonra bu adımı iki kez tekrarlayın.

Reçineye 100 mikrolitre bir x elüsyon tamponu ekleyin ve 15 dakika boyunca bir uç uç çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Daha sonra bir dakika boyunca 14.000 Gs'de santrifüjleyin. Ellucian adımını her seferinde iki kez gerçekleştirin.

Süpernatanı yeni bir mikro santrifüj tüpüne toplayın ve ellucian'dan sonra eluat olarak etiketleyin. Reçineyi daha önce olduğu gibi iki kez yıkayın ve ardından dört santigrat derecede saklayın. Western blotlama yapmak için yıkamalar ve elüsyon numuneleri boyunca akışı eksi 20 santigrat derece veya daha düşük bir sıcaklıkta saklayın.

İlk olarak, P falsy parum e coli'den, eksprese edilen rekombinant R üç proteinlerinden, hazırlanan rekombinant proteinlerden ve afinite yöntemi kullanılarak saflaştırılan protein ürünlerinden ayrı schon ekstraktları tüpleri hazırlayın. Daha sonra, 20 mikrolitrelik bir son hacim için her tüpe merkaptoetanol içeren elektroforez numune tamponu ekleyin. Çözünmüş protein örnekleri yapmak için tüpleri iki dakika kaynatın.

Jelleri çalıştırdıktan sonra proteinleri ayırmak için çözündürülmüş protein örneklerini %10 SDS sayfa jellerine yükleyin. Nitroselüloz kağıdın% 2 yağsız sütle aktarılmasını ve bloke edilmesini takiben iki saat boyunca yarı kuru bir batı kurutma odasında jel başına 35 miliamper akımda elektroforez yoluyla SDS sayfa jellerinden ayrılan proteinleri nitroselüloz kağıda aktarın. Nitroselüloz kağıdını, negatif kontroller için metin protokolünde listelenen poliklonal antikorlarla inkübe edin.

Ayrıca nitroselüloz kağıdı bir ila 100 seyreltilmiş normal fare ve tavşan serumu ve SB iki miyelom hücresinden süper adlandırılmış kullanılmış kültür içinde inkübe edin. Nitroselüloz kağıdın gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edilmesinin ardından, dört kez leke tamponu ile yıkandı ve türe özgü ikincil antikorlarla inkübe edildi, at turpu peroksidaz ile konjuge edildi,% 2 sütte 1000 ila 1000 oranında seyreltildi. Ardından nitroselüloz kağıdı leke tamponu ile tekrar dört kez yıkayın.

Son olarak, yıkanmış nitroselüloz kağıdı bir renk geliştirme çözeltisi ile inkübe edin, A artı B karanlıkta 30 dakika boyunca, in vitro insan hücresi içermeyen ekspresyon sistemleri kullanılarak plazmodyum proteinlerinin başarılı ekspresyonu, daha önce eksprese edilen rekombinant proteinlerin antiserumlar tarafından tanınmadığı gibi RT ağacına özgü tavşan antieri ile doğrulandı p FALs parem ve P Yoi Lee'den gelen parazitoz vae proteinlerine karşı, Tavşan antiserumu 6: 76'nın eksprese edilen proteinlere karşı özgüllüğünü göstermek. Normal tavşan serumu rekombinant proteinlerle reaksiyona girmedi. İki adımlı in vitro insan hücresiz ifade sistemi ve bir adımlı birleştirilmiş in vitro çeviri sistemi kullanılarak çevrilmiştir.

25 mikrolitre çevrilmiş protein ürününden çevrilmiş proteinlerin başarılı bir şekilde saflaştırılması burada gösterilmektedir. Özellikle, mara'nın yarık transmembran proteininin başarılı bir şekilde saflaştırılması gösterilmiştir. Plazmodyum RT ağacı protein kodlayan genlerden varsayımsal bir proteinin başarılı bir şekilde saflaştırılması da gösterilmiştir.

Son olarak, plazmodyum RT ağacı proteini içeren armadillo tekrarlarının başarılı bir şekilde saflaştırılması gösterilmiştir. Saflaştırmadan sonra protein verimi, geliştirilmesinden sonra 25 mikrolitre başına 3.5 mikrogramdır. Bu teknik, parazitoloji alanında parazitoloji alanında protein karakterizasyonu, protein-protein etkileşimleri, antikor inhibitör çalışmalar ve aşı geliştirme için parazitoloji alanındaki araştırmacıların önünü açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, plazmodyum proteinlerini üç saat içinde eksprese etmek için şifacı hücre içermeyen hücre bazlı hücre ekspresyon sistemini nasıl kullanacağınızı anlamalısınız. Ayrıca, proteinlerin mikro hacimlerde çevrilmiş üründen nasıl saflaştırılacağı konusunda da bir anlayışa sahip olacaksınız.