Name: MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Öğrenin, damlacık dijital PCR teknolojisiyle plazma veya serumdaki dolaşım mikroRNA'larını nicelendirmeyi. Bu yüksek duyarlı yöntem, kanser tanısı için biyobelirteçleri tespit ederek erken evre kanseri belirlemede araştırmacılara değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

(-, 2010/15 9980 5 mille n başına. Özel Program Moleküler Klinik Onkoloji) ve Üniversite ve Öğretim İtalyan Bakanlığı MF (MFAG 11676) Kanser Araştırma İtalyan Derneği (AIRC) den ve MN için fon tarafından desteklenen MN Araştırma FIRB 2011 (Proje RBAPIIBYNP).

Plazma ya da serum gelen mikroRNA İzolasyon Not: Plazma ve serum hazırlama miRNA miktarının dolaşımdaki ilgili bir adımdır. plazma ve serum hazırlanması için herhangi bir tercih işlemi yoktur. dikkate Önemli olan tek şey aynı deneyden tüm örnekler aynı iş akışı kullanarak işlenmelidir olmasıdır. 200 ul serum veya plazmadan başlayın. Toplam RNA ticari olarak temin edilebilir kitler kullanılarak serum veya plazma izole edilebilir. 1. (miRNA dahil) Toplam RNA Protokolü İzolasyon <ol><li> Buz üzerinde Çözülme serum / plazma örnekleri. </li><li> 200 ul serum / plazma liziz reaktifi (örn., QIAzol) 1 ml ilave edilir. </li><li> vorteks karışım, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında tezgah üzerinde Homojenat içeren tüp yerleştirin. </li><li> C. sentetik miRNA cel-miR-39-3p bir 4.16 nM çözeltisi 3 ul ekleyin elegans. </li><li> kloroform 200 ul ekle. 15 saniye boyunca kuvvetlice tüpü çalkalayın. Yeri inci2 dakika boyunca oda sıcaklığında tezgah e tüpü. </li><li> 4 ° C&#39;de 12,000 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj aşamaları ayırma elde etmek üzere, üst sulu faz RNA içerir. </li><li> , Yeni bir tüpe 700 ul sulu faz transfer herhangi bir beyaz interfaz malzeme transferini engellemek. </li><li> % 100 etanol 1 ml ilave edilir ve çevirerek karıştırın. </li><li> Pipet yukarı mini spin kolon içine numune 700 ul 2 ml toplama tüpü yerleştirilir. 15 saniye boyunca 12.000 xg&#39;de kapağı ve santrifüj kapatın. flow-through atın. </li><li> Kalan örnek kullanarak bu adımı yineleyin. </li><li> Mini döndürme kolonuna 700 ul Tampon RWT ekle sütunu yıkamak için 12,000 xg&#39;de 15 sn için kapağı ve santrifüj kapatın. flow-through atın. </li><li> Mini spin kolon içine Pipetleyin 500 ul Tampon RPE. 12.000 rpm&#39;de 15 saniye boyunca kapağı ve santrifüj kapatın. flow-through atın. Yine bu adımı yineleyin. </li><li> spin kolon kurumasını 2 dakika süreyle tam hızda mini spin kolon santrifüjKalıntı etanolden membran. </li><li> Sütunun membran üzerinde yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir toplama tüpü ve damlalıklı 35 mL RNaz içermeyen su mini spin kolon aktarın. </li><li> RNA elüte etmek için 12,000 x g&#39;de 1 dakika boyunca santrifüj. </li><li> -80 ° C&#39;de RNA saklayın. Not: RNA konsantrasyonu, doğru olarak belirlenebilir edemediğinden, giriş miktarı için bir ölçü olarak, sabit hacimli kullanımı. </li></ol> 2. mikroRNA Ters Transkripsiyon <ol><li> 5x reaksiyon tamponu, nükleaz içermeyen su: ters transkripsiyon (RT) reaktif karışımı bileşenleri çözülme. Yavaşça karıştırın buz üzerinde tüpler ve yeri tersini. Kullanımdan hemen önce, dondurucudan enzim karışımı çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. tüm reaktifler aşağı doğru döndürün. </li><li> Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi buz üzerinde RT reaktif karışımı hazırlayın. En az% 10 aşan karışımı hazırlayın. </li><li> Pipetleme tarafından reaksiyonu karıştırın ve daha sonra aşağı doğru döndürün. </li><li> 42 ° C&#39;de 60 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Rever Isı inaktive95 ° C&#39;de 5 dakika boyunca SE transkriptaz. </li><li> Hemen ardından 4 ° C&#39;ye soğutun. </li><li> -20 ° C&#39;de cDNA saklayın. </li></ol> 3. cDNA Sulandırma <ol><li> nükleaz içermeyen su içinde planlanan ddPCR reaksiyonları için gerekli olan cDNA şablon miktarının seyreltilir. 1:50 ve 1 arasında cDNA reaksiyonu sulandırmak: 500 suda, hedef miRNA bereket bağlıdır. -20 ° C&#39;de seyreltilmiş cDNA saklayın. seyreltilmiş cDNA -20 ° C&#39;de en az 3 ay boyunca stabil olduğu kanıtlanmıştır. </li></ol> 4. damlacık oluşturma ve PCR Not: damlacık oluşturma her seferinde 8 numuneler üzerinde yapılmalıdır. Teknik çoğaltır nedeniyle 12,15 .A Şablonsuz kontrol (NTC) bir numunesi, her plaka çalıştırılmalıdır bu teknolojinin yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği ve her biri farklı ddPCR durum için gerekli değildir. <ol><li> Çözülme ve ana karışımı dengeye (örn., EvaGreen Master Mix) oda sıcaklığında, mikroRNA primer seti ve cDNA. </li><li> Master Mix th Mixoroughly Tüpü birkaç kez baş aşağı çevirerek. tüm reaktifleri aşağı doğru döndürün. </li><li> Tablo 2&#39;de tarif edildiği gibi ddPCR karışımı hazırlayın. Birden ddPCR reaksiyonlar gerçekleşirken zaman, ddPCR çalışma-çözeltisi karışımı hazırlayın. en az% 10 aşan karışımı hazırlayın. </li><li> monte kez iyice karıştırın ve ddPCR karışımı aşağı doğru döndürün. </li><li> ddPCR 12 ul, 96 oyuklu bir plaka, PCR ya da PCR tüpleri içine karıştırmak dağıtın. </li><li> de / her bir tüpe seyreltildi cDNA şablonunun 8 ul ekle. </li><li> tutucu içine damlacık jeneratör kartuşu takın. </li><li> Aktarım hava kaçınarak kuyunun dibinde kabarcıkları dikkatle ise damlacık jeneratör kartuşunun örnek kuyu (orta sıra) her Hazırlanan numune 20 ul. </li><li> damlacık jeneratör yağı 70 ul her petrol kuyusu (alt sıra) doldurun. </li><li> kartuş yuvasına üzerinde conta kanca ve damlacık jeneratör yerleştirin. </li><li> Üreticinin pr göre damlacık nesil başlatmak için kapağını kapatınotocol. damlacık oluşturma bittiğinde, kapağı açın atılabilir conta çıkarın. kartuşun üst kuyular damlacıkları içerir. </li><li> 96 oyuklu bir PCR plaka tek bir sütuna sekiz en oyuklara (damlacıklar) içeriğinin pipetleyin yavaş ve düzgün 40 ul. </li><li> hemen buharlaşmasını önlemek için damlacıkların aktardıktan sonra folyo ile PCR plaka mühür. Damlacık okuyucu iğne ile uyumlu delinebilir folyo plaka contaları kullanın. </li><li> bir plak kapatıldı, 30 dk içinde termal çevrimi (PCR) başlayın. </li><li> Tablo 3&#39;e göre bisiklet protokolü gerçekleştirin. </li></ol> 5. Damlacık Okuma <ol><li> damlacık okuyucu açın. </li><li> damlacık okuyucuya termal döngü plaka taşıyın. </li><li> plaka sahibinin tabanına PCR sonrası damlacıkları içeren 96-PCR plaka koyun. </li><li> PCR plaka üzerinde plaka sahibinin üst yerleştirin. Sıkıca hem serbest bırakma tırnaklarını basınaşağı tutucuya PCR plakasını sabitlemek için. </li><li> Sistem PC&#39;den yazılımını başlatın. <ol><li> deneyi (Mutlak miktar) tanımlamak için Kur&#39;u tıklatın ve sonra damlacık okumaya başlamak için Çalıştır &#39;ı tıklatın. </li><li> damlacık okuma tamamlandığında, tıklayın açın ve verileri analiz etmek için, lütfen &quot;Analiz&quot;. </li><li> Pozitif damlacıkları (kement aracı) (Şekil 1B) seçmek için analiz yazılımı 2D genlik arsa kullanın. </li><li> Pozitif ve toplam damlaların sayısını kontrol etmek Olaylar sekmesini kullanın. 18.000 toplam sayısı - 21.000 damlacıkları genellikle probeless ddPCR ile elde edilir. </li><li> Pozitif damlacıklar seçildikten sonra, Konsantrasyon sekmesinden ihracat .csv seçeneğini kullanarak miRNA konsantrasyon değerleri ihracat. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Arroyo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute2+complexes+carry+a+population+of+circulating+microRNAs+independent+of+vesicles+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5003-5008 (2011).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li>
<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).</li>
<li>Braicu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+divine+messengers%3A+are+they+the+Hermes+of+modern+molecular+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Exosomes as divine messengers: are they the Hermes of modern molecular oncology.</a> Cell Death Differ. 22, 34-45 (2015).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circ Res. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Guay, C., Regazzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+novel+biomarkers+for+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as novel biomarkers for diabetes mellitus.</a> Nat Rev Endocrinol. 9, 513-521 (2013).</li>
<li>Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+of+circulating+cell-free+microRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11, 145-156 (2014).</li>
<li>Moldovan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+challenges+in+utilizing+miRNAs+as+circulating+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers.</a> J Cell Mol Med. 18, 371-390 (2014).</li>
<li>Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+Using+Circulating+miRNAs+as+Cancer+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Challenges in Using Circulating miRNAs as Cancer Biomarkers.</a> Biomed Res Int. 2015, 731479(2015).</li>
<li>Jarry, J., Schadendorf, D., Greenwood, C., Spatz, A., van Kempen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+validity+of+circulating+microRNAs+in+oncology%3A+five+years+of+challenges+and+contradictions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The validity of circulating microRNAs in oncology: five years of challenges and contradictions.</a> Mol Oncol. 8, 819-829 (2014).</li>
<li>Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+MicroRNA+Biomarker+Studies%3A+Pitfalls+and+Potential+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating MicroRNA Biomarker Studies: Pitfalls and Potential Solutions.</a> Clin Chem. 61, 56-63 (2015).</li>
<li>Miotto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Circulating+miRNAs+by+Droplet+Digital+PCR%3A+Comparison+of+EvaGreen-+and+TaqMan-Based+Chemistries%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Quantification of Circulating miRNAs by Droplet Digital PCR: Comparison of EvaGreen- and TaqMan-Based Chemistries.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23, 2638-2642 (2014).</li>
<li>Ferracin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+cell-free+microRNAs+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of cell-free microRNAs in cancer patients.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Mangolini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+microRNAs+in+the+serum+of+breast+cancer+patients+measured+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR.</a> Biomarker Research. , (2015).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nat Methods. 10, 1003-1005 (2013).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nat Methods. 11, 809-815 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Sirkülasyon miRNA&#39;lar son derece düşük konsantrasyonlarda, kanda bulunan plazma ve serum örneklerinden elde edilebilir RNA miktarı düşüktür. Bu nedenle, bu tür mikrodizi ve RNA dizi analizi gibi diğer tekniklerle ölçmek zordur. Ayrıca, veriler normalleştirme üzerinde anlaşma genel bir eksikliği ve kan endojen &quot;referans&quot; miRNA&#39;ların varlığı yoktur. Bu bağlamda, serum veya plazma çok düşük dahi olsa ml başına miRNA kopya sayısını sayma yeteneğine sahip damlacık dijital PCR gibi hassas bir teknoloji, çok ...

MicroRNA'lar (miRNA'lar), aktif salınım veya nekrotik ve apoptotik süreçlerin bir sonucu olarak potansiyel olarak organizmanın tüm hücreleri tarafından kan dolaşımına salınır. Hücresiz miRNA'lar, kan dolaşımında ya serbest kararlı moleküller olarak ya da lipoproteinlere bağlı olarak ya da eksozomlar ve mikro-parçacıklar 1-3 içinde sarılmış olarak tespit edilmiştir. Hücreden hücreye iletişimciler 4 olarak işlev gördüklerine inanılmaktadır ve miktarları kanser, kalp bozuklukları veya otoimmün hastalıkların varlığında değişir 5-7. Doğru ve tekrarlanabilir nicelikleri, hastalık biyobelirteçleri olarak değerlendirilmelerinin temelidir. Bununla birlikte, başka bir yerde daha önce açıklanan birkaç nedenden dolayı 8,9, serum veya plazmada ve diğer vücut sıvılarında miRNA miktar tayini çok zor olabilir 10,11. Yakın zamanda, miRNA'ya özgü LNA primerlerine ve DNA bağlayıcı boya damlacık dijital PCR (ddPCR) teknolojisine dayalı olarak dolaşımdaki miRNA'ların mutlak miktar tayini için bir yöntem geliştirdik 12. Bu metodoloji, miRNA meme kanseri biyobelirteçlerinin doğrulanmasına uygulanmıştır 13,14. 
Her ters kopyalanmış miRNA molekülünün nanolitre boyutunda bir damlacık içinde bölünmesinden sonra, her numunedeki her miRNA'nın kopya sayısını saymak, temel olarak yeşil ve dolayısıyla pozitif floresan damlacıkların sayısını saymak mümkündür. Bir PCR reaksiyonu meydana gelir gelmez, kantitatif RT-PCR'DE (RT-qPCR) olduğu gibi standart bir eğri oluşturmaya veya hedef miktar hesaplamasında PCR verimliliğini hesaba katmaya gerek kalmadan pozitif bir sayım elde edilir. Ek olarak, ddPCR'nin dolaşımdaki miRNA miktar tayininde RT-qPCR'den daha hassas ve doğru olduğu kanıtlanmıştır 15. Bu makalede, bu metodolojinin ayrıntılı protokolünü sunuyoruz, en ilgili adımları tartışıyoruz ve özellikle serum ve plazma klinik örneklerini ele alıyoruz.

<table><tbody><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>miRNA dahil toplam RNA için sütunlar, serum/plazma</td></tr><tr><td>100 nmole RNA oligo'dan ekstraksiyon Cel-miR-39-3p</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>Özel</td><td>Dizi: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG</td></tr><tr><td>Evrensel cDNA sentez kiti II, 8-64 rxns</td><td>Exiqon</td><td>203301</td><td>MicroRNA ters transkripsiyon için Kit</td></tr><tr><td>MicroRNA LNA PCR primer seti&nbsp;</td><td>Exiqon</td><td>204000-206xxx ve 2100000-21xxxxx</td><td>Damlacıklar içinde miRNA amplifikasyonu için astarlar</td></tr><tr><td>QX200 damlacık üreteci</td><td>BioRad</td><td>186-4002</td><td>Damlacık okuma için kullanılan cihaz</td></tr><tr><td>QX200 damlacık okuyucu</td><td>BioRad</td><td>186-4003</td><td>Damlacık üretimi için kullanılan cihaz</td></tr><tr><td>QuantaSoft yazılımı</td><td>BioRad</td><td>186-3007</td><td>Veri toplama ve analizi</td></tr> <tr>için yazılım<td>PX1 PCR plaka kapatıcı</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td>Plaka mühürleyici</td></tr><tr><td>DG8 damlacık jeneratörü kartuşları ve contaları</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td>Damlacıklar oluşturmak için numune ve yağı karıştırmak için kullanılan kartuşlar</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen süper karışım</td><td>BioRad</td><td>186-4033/36</td> EvaGreen boyası için <td>PCR süper karışım</td></tr><tr><td>QX200 damlacık üreteci yağı</td><td>BioRad</td><td>186-4005</td><td>Damlacık üretimi için yağ</td></tr></tbody></table>

microrna niceleme dna bağlayıcı boya kimya ve damlacık dijital pcr kullanarak sirkülasyon

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

mikroRNA (miRNA&#39;ların) (hücre içermeyen) dolaşımdaki kan akışı içine hücrelerden salınırlar. dolaşımdaki Belirli mikroRNA miktarı bir hastalık durumu ile bağlantılı hastalık belirteç olarak kullanılmak üzere bir potansiyele sahip olmuştur. Dijital PCR teknolojisi bir boya temelli kimya kullanılarak ve damlacık microRNA ölçümü dolaşan için hassas ve doğru bir yöntem son zamanlarda geliştirilmiştir. Spesifik olarak, nükleik asit (LNA) belirli miRNA&#39;ların mutlak miktarının elde edilmesi mümkün olmaktadır, uyumlu bir damlacık dijital PCR sisteminin yeşil floresan DNA bağlayıcı boya ile miRNA spesifik primerler tabanlı Kilitli kullanılarak. Burada, bu tekniği gerçekleştirmek gibi plazma ve serum gibi biyolojik sıvılarda, içinde miRNA miktarını değerlendirmek için nasıl tarif uygulanabilir ve etkili hem de.

Plazma ya da serum ml başına özgül miRNA&#39;ların mutlak miktarı, dijital PCR teknolojisi yeşil fluoresan DNA bağlayıcı boya kullanılarak ve damlacık belirlenebilir. 1 son MiRNA konsantrasyonunu belirler pozitif damlacıkları seçim sürecini sunulur şekil (kopya / ml ) analiz yazılımı ile hesaplanmıştır amplifikasyon reaksiyonunda. Kandaki her miRNA miktarı diğerlerine göre biraz miRNA türü daha bol olması, çok farklıdır. ddPCR reaksiyonunda 1:50 seyrelti...

Boya bazlı bir kimya ve damlacık dijital PCR teknolojisi kullanılarak hücresiz mikroRNA'ların miktar tayini için hassas ve doğru bir yöntem açıklanmaktadır.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Bu prosedürün genel amacı, damlacık dijital PCR teknolojisini kullanarak plazma veya serum gibi biyolojik sıvılardaki dolaşıma giren mikroRNA'ları nicelleştirmektir. Bu yöntem, biyobelirteç alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; kanserin tanısal ve prognostik biyobelirteçlerinin belirlenmesini sağlar.Bu tekniğin temel avantajı yüksek hassasiyetidir. Herhangi bir iç kontrol geni gerektirmeksizin, miktarı daha düşük olan mikroRNA'ların nicelendirilmesi için de kullanılabilir. Bu yöntemin etkileri, erken evre kansere sahip kişileri tanımlama potansiyeli nedeniyle kanser teşhisine kadar uzanmaktadır.Ayrıca nörolojik veya kardiyak bozukluklar gibi diğer hastalıklara da uygulanabilir. Genel olarak, bireylerin damlacıkların parçalanmasını önlemek için termal döngü adımından önceki damlacık manipülasyonuna dikkat etmeleri gerekir. Bu nedenle, damlacıkların dikkatsiz manipülasyonla veya çok hızlı pipetleme ile yok edilebilmesi sebebiyle, damlacık oluşumunun görsel bir gösterimi kritik öneme sahiptir.Bu prosedüre plazma veya serum mikroRNA'larını izole ederek başlayın. Ardından, ekteki belgede açıklandığı şekilde ters transkripsiyonlarını gerçekleştirin ve onları seyreltin. EvaGreen master mix mikroRNA primer setini ve cDNA'yı dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında çözülmelerini bekleyin.Çözündükten sonra, master mix tüpünü birkaç kez altüst edin. Ardından tüm reaktifleri santrifüjleyerek çöktürün. Beraberindeki belgede yer alan talimatlara göre bir droplet dijital veya ddPCR mix çalışma çözeltisi hazırlayın.Her koşul için bir şablon kontrolü dahil olmak üzere sekiz örneğe kadar yetecek miktarda ve %10 fazlasıyla hazırlayın. Hazırlama işlemi tamamlandıktan sonra, ddPCR karışımını iyice karıştırın ve santrifüjleyin. Bu teknolojinin yüksek tekrarlanabilirliği nedeniyle teknik tekrarların gerekli olmadığını unutmayın. Santrifüjden sonra, her bir 96 kuyucuklu PCR plakası kuyucuğuna 12 µL ddPCR karışımı dağıtın.Her bir kuyucuğa sekiz µL seyreltilmiş cDNA kalıbı ekleyin. Ardından, damlacık oluşturucu kartuşu kartuş tutucuya yerleştirin. Hazırlanan her bir örneğin 20 µL'sini, damlacık oluşturucu kartuşun orta sırasına dikkatlice aktarın.Kuyucuğun dibine hava kabarcığı girmesinden kaçının. Alt sıradaki her bir yağ kuyucuğunu 70 µL damlacık oluşturucu yağ ile doldurun. Contayı kartuş tutucusunun üzerine geçirin.Damlacık oluşturma işlemine başlamak için damlacık oluşturucuya yerleştirin ve kapağı kapatın. Damlacık oluşturma işlemi tamamlandığında kapağı açın, kartuşu damlacık oluşturucudan çıkarın ve tek kullanımlık contayı sökün. Kartuşun üst kuyucukları damlacıkları içerir.Sekiz üst kuyucuğun her birinden 40 µL'yi yavaşça ve sorunsuz bir şekilde 96 kuyucuklu bir PCR plakasının tek bir sütununa aktarın. Buharlaşmayı önlemek için plakayı hemen folyo ile kapatın. Plaka kapatıldıktan sonraki 30 dakika içinde, ekteki belgenin üçüncü tablosunda açıklanan PCR protokolünü kullanarak termal döngüye başlayın.Damlacık okuyucuyu açın. Ardından plakayı termal döngüleyiciden damlacık okuyucuya taşıyın. PCR sonrası damlacıkları içeren 96 kuyucuklu PCR plakasını damlacık okuyucudaki plaka tutucunun tabanına yerleştirin.Plaka tutucunun üst kısmını PCR plakası üzerine yerleştirin. PCR plakasını tutucuya sabitlemek için her iki serbest bırakma sekmesini sıkıca aşağı bastırın. Sistem bilgisayarından QuantaLife yazılımını başlatın. Kurulum'a (Setup) tıklayın ve örnekler, hedef genler ve analizler hakkında bilgilerin bulunduğu şablon veri dosyasını açın.Sol taraftaki gezinme çubuğundan Run seçeneğini belirleyin. Bir Run Options penceresi açılacaktır. Dye Set menüsünden EVA'yı seçin ve damlacık okumasını başlatmak için OK'ye tıklayın.Çalışma tamamlandığında, pozitif damlacıkları seçmek için analiz yazılımındaki 2D Genlik grafiğini kullanın. Pozitif damlacıkları seçmek için sol taraftaki gezinti çubuğunda bulunan kement (lasso) aracını kullanın. Ardından, pozitif ve toplam damlacık sayılarını kontrol etmek için Olaylar sekmesine tıklayın.Probunsuz ddPCR ile genellikle toplam 18.000 damlacık elde edilir. Ardından, final numune konsantrasyonunu görüntülemek için Konsantrasyon sekmesine tıklayın. Son olarak Dışa Aktar seçeneğini kullanın.mikroRNA konsantrasyon değerlerini dışa aktarmak için kullanılan CSV dosyası. mRNA miR-181a-5p, 58 ve 60 °C bağlanma sıcaklıklarında, 0,5 ve bir µL primer konsantrasyonu kullanılarak S1 ve S2 adlı iki plazma örneğinde nicelendirildi. Bu şekil, her bir koşul için amplifikasyon reaksiyonundaki mikrolitre başına mikroRNA kopya sayısını sunmaktadır.Her örnek için PCR pozitif damlacıklar mavi, negatif damlacıklar ise siyah renkte gösterilmiştir. Burada görüldüğü üzere, kontrol örneğinde beklendiği gibi pozitif damlacık bulunmamaktadır. PCR'ın 60 °C'de, 0.5 veya 1 µL primer kullanılarak gerçekleştirilmesi, pozitif ve negatif damlacıkların daha iyi ayrışmasını sağlamıştır.Bu şekilde, hata çubukları Poisson %95 güven aralığını temsil etmektedir. Burada, mavi ile gösterilen pozitif damlacık sayısı, yeşil ile gösterilen toplam damlacık sayısıyla karşılaştırılmıştır. Birlikte değerlendirildiğinde bu veriler, damlacık dijital PCR'ın bir biyolojik sıvının mikrolitresi başına düşen microRNA kopya sayısının mutlak değerini belirlemek için kullanılabileceğini göstermektedir.Bu videoyu izledikten sonra, damlacık dijital PCR kullanarak mRNA kantifikasyonunun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yöntemde uzmanlaşıldığında, klinik bir ortam için optimal bir çıktı olan 96 örnek sadece birkaç saat içinde analiz edilebilir. Her gelişimle birlikte, bu teknik, hastalık biyobelirteçleri olarak mikroRNA ve diğer nükleik asitleri araştırmak için likit biyopsi alanının önünü açmaktadır.

circulating-microrna-quantification-using-dna-binding-dye-chemistry

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada örnek sınırlı miktarda çalışma, özellikle microRNA (miRNA) ekspresyon düzeyleri için bir maliyet ve zaman etkili yüksek verimli bir tarama aracı olarak mikroakışkan platformu ile birlikte optimize edilmiş bir multiplex ters transkriptaz kantitatif PCR (QRT PCR) protokolü açıklamak.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

Bu videoda, dijital polimeraz zincir reaksiyonu veya dPCR ile hedef nükleik asitleri tespit etmek için emülsifiye edilmiş nano damlacıklar oluşturmak için adım adım bir prosedür sunuyoruz.

Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Nadir Tümör Mutasyonlarını Tespit Etmek için Nanodamlacık PCR Reaksiyonları Oluşturmak İçin Bir Yöntem

Bu videoda, iki farklı genetik belirteci aynı anda tespit etmede yararlı olan geleneksel PCR tekniğinin bir modifikasyonu olan çift yönlü dijital PCR (ddPCR) tekniğini gösteriyoruz. Tek bir PCR reaksiyonu, bağımsız olarak amplifiye edilen nanolitre boyutunda emülsifiye edilmiş damlacıklara bölünür ve hedef dizilerin başlangıç konsantrasyonunu hesaplamak için damlacıkların fraksiyonundan farklı renkli floresan amplifikasyon sinyallerinin tespiti kullanılır.

Çift genetik belirteçlerin eş zamanlı olarak ölçülmesi için dubleks dijital PCR

MicroRNA'lar (miRNA'lar), yaygın olarak korunan bir düzenleyici molekül sınıfıdır. Burada, iki güçlü ligasyon adımına ve ardından yüksek verimli dizilemeye dayanan bir miRNA klonlama yöntemini açıklıyoruz. Yöntemimiz, miRNA'ların genom çapında doğru bir şekilde kantitasyonuna izin verir.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

Sirkülasyon mikroRNAlar son zamanlarda çeşitli kanser ve diğer hastalıklar için umut verici ve yeni biyolojik belirteçler olarak ortaya çıkmıştır. Bu makalenin amacı üç farklı prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR platformları ve ölçmek ve microRNA dolaşan bereket belirlemek için kullanılabilir yöntemleri tartışmaktır.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Basitleştirilmiş (analog) bir okuma ile nükleik asitleri ölçmek için bir uç nokta dijital testi tanımlıyoruz. Damlacık bazlı dijital tahlillerin toplu floresansını özel enstrümantasyon yerine standart bir qPCR makinesi kullanarak ölçüyoruz ve sonuçlarımızı mikroskopi ile doğruluyoruz.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Bu rapor plazma miRNA, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR ile veya öncesi amplifikasyon olmadan kullanarak mutlak düzeylerini ölçmek için bir protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı plazma miRNAs miktarı daha iyi anlaşılmasını tanıyor ve nitel karşılık gelen verilerden farklı çalışmalar veya laboratuvar değerlendirmesini sağlar.

Cynomolgus maymunlar, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak plazma mikroRNA düzeylerinin mutlak miktar

Dolaşımdaki mikroRNA'lar söz biyolojik kalp-damar hastalıkları ve akut miyokard enfarktüsü olarak göstermiştir. Bu çalışmada, bir protokol miRNA ayıklama, Ters transkripsiyon ve kardiyovasküler hastalığı olan hastalarda serum miRNAs mutlak miktar için dijital PCR için açıklar.

Akut miyokard infarktüsü ve kardiyovasküler hastalık mikroRNA'lar dolaşan miktarının için dijital PCR

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Burada, tek hücrelerde mutlak mitokondriyal (mt) DNA kopya sayısını ve mtDNA delesyon heteroplazmi seviyelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kullanarak Tek Hücreli Mitokondriyal DNA Kopya Sayısını ve Heteroplazmiyi Ölçme

Bu protokol, farklı primerler kullanılarak hücrelerdeki dairesel RNA (circRNA) seviyelerinin hassas bir şekilde ölçülmesi için ayrıntılı dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemini açıklamaktadır.

Dairesel RNA'ların Dijital Damlacık PCR Kullanılarak Nicelleştirilmesi

Öğrenin, damlacık dijital PCR teknolojisiyle plazma veya serumdaki dolaşım mikroRNA'larını nicelendirmeyi. Bu yüksek duyarlı yöntem, kanser tanısı için biyobelirteçleri tespit ederek erken evre kanseri belirlemede araştırmacılara değerli bir araç sunar.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Daha fazla video keşfet