MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Bu prosedürün genel amacı, damlacık dijital PCR teknolojisini kullanarak dolaşımdaki mikroRNA'ları ve plazma veya serum gibi biyolojik sıvıları ölçmektir. Yöntem, biyomarket alanındaki soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Tanısal ve prognostik, biyopazarlama kanserini tanımlayarak.

Bu tekniğin en büyük avantajı yüksek hassasiyettedir. Androjen bir referans geni gerektirmeden daha az miktarda bulunan mikroRNA'ları da ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntemin anlamı, erken evre kanserli kişileri belirleme potansiyeline sahip olduğu için kanser teşhisine kadar uzanır.

Nörolojik veya kardiyak bozukluklar gibi diğer hastalıklara da uygulanabilir. Genel olarak, bireylerin, bozulmalarını önlemek için termal döngü adımından önce damlacıkların manipülasyonuna dikkat etmeleri gerekir. Bu nedenle, damlacık oluşumunun görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü damlacıklar dikkatsiz manipülasyon veya çok hızlı pipetleme ile yok edilebilir.

Plazma veya serum mikroRNA'larını izole ederek bu işleme başlayın. Ardından, ekteki belgede açıklandığı gibi bunları ters yazıya dökün ve seyreltin. EvaGreen ana karışım mikroRNA astar setini ve cDNA'yı dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında çözülmelerine izin verin.

Çözüldükten sonra, ana karışım tüpünü birkaç kez ters çevirin. Ve sonra tüm reaktifleri aşağı doğru döndürün. Ekteki belgedeki talimatlara göre bir damlacık dijital veya ddPCR karışımı çalışma solüsyonu hazırlayın.

Her koşul için şablonsuz kontrol artı %10'dan fazla ile sekiz adede kadar numune için yeterince hazırlayınBir araya getirildikten sonra, ddPCR karışımını iyice karıştırın ve döndürün. Bu teknolojinin yüksek tekrarlanabilirliği nedeniyle teknik kopyaların gerekli olmadığını unutmayın. Döndürmeden sonra, 96 oyuklu bir PCR plakasının her bir oyuğuna 12 mikrolitre ddPCR karışımı dağıtın.

Her oyuğa sekiz mikrolitre seyreltilmiş cDNA şablonu ekleyin. Ardından damlacık üreteci kartuşunu kartuş tutucuya yerleştirin. Damlacık üreteci kartuşunun orta sırasına, hazırlanan her numuneden 20 mikrolitreyi dikkatlice aktarın.

Kuyu dibine hava kabarcıkları sokmaktan kaçının. Alt sıradaki petrol kuyularının her birini 70 mikrolitre damlacık jeneratör yağı ile doldurun. Contayı kartuş tutucunun üzerine asın.

Damlacık üretecine yerleştirin ve damlacık oluşumunu başlatmak için kapağı kapatın. Damlacık üretimi bittiğinde, kapağı açın, kartuşu damlacık üretecinden çıkarın ve tek kullanımlık contayı çıkarın. Kartuşun üst kuyuları damlacıkları içerir.

En üstteki sekiz kuyucuğun her birinden 40 mikrolitreyi yavaş ve sorunsuz bir şekilde 96 oyuklu bir PCR plakasının tek bir sütununa aktarın. Buharlaşmayı önlemek için plakayı hemen folyo ile kapatın. Plakayı kapattıktan sonraki 30 dakika içinde, ekteki belgenin üçüncü tablosunda açıklanan PCR protokolünü kullanarak termal döngüye başlayın.

Damlacık okuyucuyu açın. Ardından plakayı termal döngüleyiciden damlacık okuyucuya taşıyın. PCR sonrası damlacıkları içeren 96 oyuklu PCR plakasını damlacık okuyucudaki plaka tutucunun tabanına yerleştirin.

Plaka tutucunun üst kısmını PCR plakasına yerleştirin. PCR plakasını tutucuya sabitlemek için her iki serbest bırakma tırnağını da sıkıca aşağı bastırın. QuantaLife yazılımını sistem bilgisayarından başlatın. Kurulum'a tıklayın ve numuneler, hedef genler ve tahliller hakkında bilgi içeren şablon veri dosyasını açın.

Sol taraftaki gezinti çubuğundan Çalıştır'ı seçin. Bir Çalıştırma Seçenekleri penceresi görünecektir. Boya Seti menüsünden EVA'yı seçin ve damlacık okumasını başlatmak için Tamam'a tıklayın.

Çalışma tamamlandıktan sonra, pozitif damlacıkları seçmek için analiz yazılımındaki 2D Genlik grafiğini kullanın. Pozitif damlacıkları seçmek için, sol taraftaki gezinme çubuğundan kement aracını kullanın. Ardından, pozitif ve toplam damlacıkların sayısını kontrol etmek için Olaylar sekmesine tıklayın.

Probsuz ddPCR ile genellikle toplam 18.000 damlacık sayısı elde edilir. Ardından, son konsantrasyon örneğini görselleştirmek için Konsantrasyon sekmesine tıklayın. Son olarak, Dışa Aktar'ı kullanın.

MikroRNA konsantrasyon değerlerini dışa aktarmak için CSV. mRNA miR-181a-5p, 58 ve 60 santigrat derece tavlama sıcaklıklarında 0.5 ve bir mikrolitre primer konsantrasyonu kullanılarak S1 ve S2 olmak üzere iki plazma numunesinde ölçüldü. Bu şekil, her koşul için amplifikasyon reaksiyonunda mikrolitre başına mikroRNA kopyalarını sunar.

Her numune için PCR pozitif damlacıklar mavi renkle gösterilir ve negatif damlacıklar siyah renkle gösterilir. Burada görülebileceği gibi, kontrol numunesi beklendiği gibi pozitif damlacıklara sahip değildir. PCR'nin 60 santigrat derecede 0,5 veya bir mikrolitre primer kullanılarak gerçekleştirilmesi, pozitif ve negatif damlacıkların daha iyi ayrılmasına neden oldu.

Bu şekilde, hata çubukları Poisson %95 güven aralığını temsil eder. Ve burada, mavi ile gösterilen pozitif damlacıkların sayısı, yeşil ile gösterilen toplam damlacık sayısı ile karşılaştırılır. Birlikte ele alındığında, bu veriler damlacık dijital PCR'nin biyolojik bir sıvının mikrolitresi başına mikroRNA'nın mutlak kopya sayısını belirlemek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, damlacık dijital PCR kullanarak bir mRNA miktar tayininin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, 96 numune sadece birkaç saat içinde analiz edilebilir, bu da klinik bir ortam için en uygun çıktıdır. Her gelişmeden sonra, bu teknik, mikroRNA ve diğer nükleik asitleri hastalık biyobelirteçleri olarak keşfetmek için sıvı biyopsi alanına giden yolu açar.