Akut miyokard infarktüsü ve kardiyovasküler hastalık mikroRNA'lar dolaşan miktarının için dijital PCR
3 Temmuz 2018
Dolaşımdaki mikroRNA'lar söz biyolojik kalp-damar hastalıkları ve akut miyokard enfarktüsü olarak göstermiştir. Bu çalışmada, bir protokol miRNA ayıklama, Ters transkripsiyon ve kardiyovasküler hastalığı olan hastalarda serum miRNAs mutlak miktar için dijital PCR için açıklar.
Bu yöntem, mikro RNA'ların kardiyovasküler hastalıkta geçerli biyobelirteçler olup olmadığı gibi tanı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile karşılaştırıldığında, dijital PCR, dolaşımdaki mikroRNA'ları ölçmek için üstün teknik nitelikler sergiler. Numune yaklaşık 20.000 damlacığa bölündüğünden, mükerrer ölçümlere gerek yoktur ve miktar tayini için standart bir eğriye gerek yoktur.
Bu yöntem, kardiyovasküler hastalarda mikroRNA'ların miktar tayini hakkında fikir verebilse de, diğer hastalara ve hastalıklara da uygulanabilir, çünkü diğer mikroRNA'lar kanser ilerlemesinde biyobelirteç olarak umut vaat ettiğinden, onkolojik hastalara da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, üretilen damlacıklar kırılgan olduğundan ve dikkatli bir şekilde ele alınması gerektiğinden mücadele edecektir. Serum örneklerinden RNA'yı izole ettikten sonra, dPCR için daha kararlı tamamlayıcı DNA elde etmek için ters transkripsiyonla devam edin.
Başlamak için, ters transkripsiyon kitini buz üzerinde çözün. Sonra enzimleri ve primerleri döndürün. Ardından, ana karışımı metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın.
Ana karışımın 10 mikrolitresini, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda beş mikrolitre ekstrakte edilmiş RNA ile birleştirin. Daha sonra plakayı iki dakika boyunca dört santigrat derecede 2.000xg'de santrifüjleyin. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ters transkripsiyon ile devam edin.
İlk olarak, ticari dPCR karışımını, cDNA ve PCR primerlerini buz üzerinde çözün ve kullanmadan hemen önce santrifüjleyin. Ardından ana karışımı metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Ana karışımın 18,67 mikrolitre hacmine 1,33 mikrolitre hacimde ters transkripsiyon ürünü ekleyin ve kısaca santrifüjleyin.
Bir pipet kullanarak, 20 mikrolitre numuneyi sekiz kuyucuklu bir kasetin orta sırasının her bir oyuğuna aktarın. Daha sonra 70 mikrolitre damlacık üretim yağını kasetin yağ kuyularına pipetleyin. Ardından, kasetin üstüne bir conta yerleştirin ve damlacık üretecine yerleştirin.
Damlacık üretecini kapatın ve üç gösterge ışığı sabit yeşil yanana kadar bekleyin. Bir pipet kullanarak, damlacık şeklindeki numunenin 40 mikrolitresini 96 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına dikkatlice aktarın. Ardından plakayı dPCR folyosu ile 180 santigrat derecede dört saniye boyunca kapatın.
Mühürlü PCR plakasını döngüleyiciye yerleştirin ve metin protokolünde belirtilen döngü talimatlarını izleyin. Plakayı termocycler'dan çıkarın ve bir plaka tutucunun tabanına aktarın. Ardından plaka tutucunun üst kısmını PCR plakasına yerleştirin.
Son olarak, ticari dPCR yazılımını başlatın. Bu protokolde, kardiyovasküler hastalığı olan hastaların serumundaki mikroRNA'ları ölçmek için dijital PCR kullanıldı. Örnekler 16 hastadan perkütan girişim öncesi, sekiz saat sonra ve 16 saat sonra alındı.
ST yükselmeli miyokard enfarktüsü olan hastalar, stabil koroner arter hastalığı olan hastalara kıyasla miR-499 seviyelerinde anlamlı bir artış gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik doğru yapılırsa 96 numunenin damlacık oluşumu için yaklaşık bir saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, damlacıkları dikkatli bir şekilde kullanmayı akılda tutmak önemlidir.
Bu videoyu izledikten sonra, doğru damlacık oluşumu, döngü, okuma ve analiz yoluyla dijital PCR'nin doğru bir şekilde nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, kardiyovasküler hastalıklar için potansiyel biyobelirteçler olan dolaşımdaki mikroRNA'ların ekstraksiyonu ve kantifikasyonu için bir protokol sunmaktadır. Dijital PCR kullanan bu yöntem, kardiyovasküler durumu olan hastalardan alınan serum örneklerinde miRNA ölçümünün doğruluğunu artırmayı amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyovasküler hastalıklar
- Biyobelirteçler
- MikroRNA analizi
Arka Plan
- MikroRNA'lar, gen regülasyonunda rol oynayan küçük kodlamayan RNA'lardır.
- Kardiyovasküler durumlar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar için potansiyel biyobelirteçler olarak ortaya çıkmışlardır.
- Dijital PCR, mikroRNA'ların miktar tayini için geleneksel yöntemlere göre avantajlar sunar.
- miRNA profillerinin anlaşılması, kardiyovasküler hastalıkların teşhis ve yönetimine yardımcı olabilir.
Çalışmanın Amacı
- Kardiyovasküler hastalıklar için mikroRNA'ların biyobelirteç olarak doğrulanması.
- Dolaşımdaki miRNA'ların miktarının belirlenmesinde dijital PCR'ın etkinliğinin gösterilmesi.
- Alandaki araştırmacılar için güvenilir bir protokol sağlanması.
Kullanılan Yöntemler
- Serum örneklerinden miRNA'ların ekstraksiyonu.
- Komplementer DNA sentezi için ters transkripsiyon.
- miRNA'ların mutlak kantifikasyonu için dijital PCR.
- Dijital PCR'ın kantitatif gerçek zamanlı PCR ile karşılaştırılması.
Temel Sonuçlar
- Dijital PCR, miRNA kantifikasyonunda üstün doğruluk göstermiştir.
- Yöntem, standart eğriye ihtiyaç duymadan binlerce damlacığın analizine olanak tanır.
- Yöntemin potansiyel uygulanabilirliği, kardiyovasküler hastalıkların ötesine geçerek kanser gibi diğer durumları da kapsamaktadır.
- Tekniği yeni kullananlar için hassas damlacıkların işlenmesindeki zorluklar kaydedilmiştir.
Sonuçlar
- Çalışma, dolaşımdaki mikroRNA'ların kardiyovasküler hastalıklar için biyobelirteç olarak kullanımını desteklemektedir.
- Dijital PCR, hassas miRNA kantifikasyonu için gelecek vaat eden bir araçtır.
- İleri araştırmalar, bu yöntemin diğer hastalıklar üzerindeki uygulamasını genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Dolaşımdaki mikroRNA'ların dijital PCR ile nicelendirilmesi, kardiyovasküler hastalık araştırmalarında biyobelirteç doğrulaması için tekrarlanabilir ve yüksek hassasiyetli bir yaklaşım sunar. Bu yöntem, standart eğrilerine gerek duymadan mutlak nicelendirme sağlayarak hedef doğrulamayı ve analiz geliştirmeyi destekler, böylece çok merkezli çalışmalardaki değişkenliği azaltır. Teknik, miRNA ekspresyonunu patoloji ile ilişkilendirerek erken keşif aşamasındaki öngörü güvenini artırır ve terapötik hipotez sorgulamalarında karar verme süreçlerine temel oluşturur.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: AMI'de miR-499 gibi hastalığa özgü miRNA'ları nicelendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Standart eğriler olmadan mutlak miRNA kopya sayıları sağlayarak merkezler arası tekrarlanabilirliği artırır.
- Öngörücü Değer: miRNA seviyelerini kardiyovasküler patoloji ile ilişkilendirerek biyobelirteç odaklı portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Alt akış tarama iş akışları için doğrulanmış biyolojik sistemler (serum RNA'sından cDNA) üretir.
- Operasyonel Değer: Analiz standardizasyonuna uygun, yüksek lineerlik ve düşük değişkenlikte çıktılar sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Karışım hazırlandıktan sonra yaklaşık bir saat içinde 96 örneğin işlenmesine olanak tanıyarak orta ölçekli taramaları destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Keşif aşamasındaki miRNA kantifikasyonunu, hastalıkla ilişkili serum biyobelirteçleri aracılığıyla preklinik doğrulamaya bağlar.
- Mekanistik Risk Azaltma: miRNA ekspresyonunu kardiyovasküler hasarla ilişkilendirerek hedef doğrulamadaki belirsizliği azaltır.
- Biyobelirteç Uyumu: Yüksek doku ve hastalık spesifitesine sahip miRNA'ları kantifiye ederek translasyonel biyobelirteç gelişimini destekler.
İşleme Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, hipotez testinden öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürecine uygundur ve hedef güvenini ve analiz hazırlığını bilgilendiren kantitatif miRNA verileri sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Kardiyovasküler hücrelerden dolaşıma salınan miRNA miktarlarını belirleyerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Biyobelirteç adaylarını değerlendirmek için yüksek hassasiyete sahip, analiz hazır ve standartlaştırılmış çıktılar üretir.
- Analitik: Standart eğriler olmadan yapılan mutlak kantifikasyon sayesinde, farklı koşullar arasındaki miRNA seviyelerinin doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Dolaşımdaki miRNA profillerini kardiyovasküler patoloji ile ilişkilendirerek biyobelirteç sürekliliğini geliştirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Kardiyovasküler ve onkolojik endikasyonlar genelinde uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir kantifikasyon platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Düşük varyasyonlu ve yüksek hassasiyetli miRNA kantifikasyonu ile biyobelirteç geçerliliğine yönelik öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlı ölçümleri ortadan kaldıran damlacık tabanlı bölümlendirme yoluyla tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu sağlar.
- Stratejik Değer: Biyobelirteç-hedef ilişkilerindeki mekanistik belirsizliği azaltarak devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Kantitatif ve patoloji bağlantılı miRNA verileri aracılığıyla risk ayarlı ilerlemeye olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Örnek kaybını önlemek için RNA izolasyonu, ters transkripsiyon ve damlacık yönetimi konularında uzmanlık gerektirir.
- Hassas kantifikasyon için damlacık üretim ekipmanı, PCR döngü cihazları ve dPCR yazılımı gereklidir.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için damlacık oluşumu ve sızdırmazlık protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Serum dışındaki plazma veya doku lizatları gibi farklı örnek türlerine uygulandığında adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Deneyimsiz kullanıcılar için işlem hacmini etkileyebilecek, hassas damlacık yönetimi gibi pratik sınırlamalar içerir.
