Name: Akut miyokard infarktüsü ve kardiyovasküler hastalık mikroRNAlar dolaşan miktarının için dijital PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Öğrenin, dolaşan mikroRNA'ları dijital PCR ile kardiyovasküler hastalıklar için biyobelirteç olarak nicelendirmeyi. Bu yöntem, serum örneklerinde miRNA ölçümünün doğruluğunu artırarak araştırmacılara güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar hiçbir ilgili kaynaklar var.

1. plazma/Serum üzerinden miRNA çıkarımı
Not: miRNAs uygun bir şekilde ölçmek için plazma/serum doğru mikroRNA izolasyonu önemli bir adımdır. Özellikle farklı protokoller bulunmaktadır çünkü, dikkat edilmesi gereken önemli bir şey için aynı iş akışı örnekleri işlenirken uygun etmektir. Bu protokol için miRNA 50 µL serum elde edilir. 200'den fazla µL bu sınıra doğru ayıklama işlemi kullanmayın.
<ol><li>Serum hazırlamak veya donmuş numuneler çözülme.</li>
	<li>250 µL (5 cilt) ticari lizis reaktif için 50 µL serum ekleyin. Lizis vortexing tarafından destekler. Tüp lysate ile 5 min için oda sıcaklığında bankta yerleştirin.</li>
	<li>Spike-kontrol (1.6 x 107 kopya/µL) 3.5 µL ile lysate spike ve vortexing tarafından mix onları.</li>
	<li>Kloroform (yani, eşit miktarda başlangıç serum örneği olarak) 50 µL faz ayrılması için ekleyin. Tüp 15 s. yer, oda sıcaklığında 2-3 dakika için bankta tüp için şiddetle çalkalanır.</li>
	<li>Faz ayrılması için santrifüj kapasitesi 12.000 x g 15dk için 4 ° C'de, tüp. Not: Örnekleri şimdi RNA, beyaz bir interfaz ve daha düşük, pembe Organik faz içeren bir üst sulu aşamaya ayrılır.</li>
	<li>Üst sulu faz (100 µL) RNA içeren yeni bir tüp içine aktarın. Bu doğru RNA sayısı onu gibi herhangi bir beyaz Interphase malzeme aktarılmaz.</li>
	<li>% 100 etanol 150 µL (yani, Transfer edilen örnek hacmi x 1.5) ekleyin. Onları yukarı ve aşağı pipetting tarafından malzemeleri karıştırın. Değil onları santrifüj kapasitesi ve hızlı bir şekilde bir sonraki adıma geçin.</li>
	<li>250 µL üzerine 2 mL toplama tüp ticari spin sütununda örneğinin pipet. Kapağı kapatın. Adresindeki sütun santrifüj kapasitesi > 8.000 x g akışı aracılığıyla 15 s. atma için oda sıcaklığında.</li>
	<li>Ticari çamaşır arabellek sayının 1 700 µL spin sütununu ekleyin. Kapağı kapatın ve sütun sırasında santrifüj kapasitesi > 8.000 x g 15 s. atma çalışma çamaşır arabellek için oda sıcaklığında.</li>
	<li>Ticari çamaşır arabellek sayının 2 500 µL spin sütununu ekleyin. Kapağı kapatın ve sütun sırasında santrifüj kapasitesi > 8, 000 x g 15 s. atma çalışma çamaşır arabellek için oda sıcaklığında.</li>
	<li>500 µL % 80 etanol spin sütuna pipet. Kapağı kapatın, adresindeki sütun santrifüj kapasitesi > 8, 000 x g 2 dakika süreyle oda sıcaklığında toplama tüp akışı aracılığıyla ile atmak.</li>
	<li>Spin sütun için yeni bir 2 mL toplama tüp aktarın. Sütun membran kuruması için açılan bir kapak ile tam hızda santrifüj kapasitesi. Toplama tüp akışı aracılığıyla ile atmak.</li>
	<li>Spin sütun yeni bir 1,5 mL toplama tüp içine aktarın. RNA membran merkezine doğrudan RNase free su 30 µL uygulayarak elute. Kapağı kapatın. Sütun 1 dk. için tam hızda santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>RNA-70 ° C'de depolayın Not: RNA hiçbir bozulma için 1 yıl-70 ° C ile-20 ° C arasında RNase free suda arıtılmış RNA depolanmasını sağlar. Üreticinin RNA sulandırmak için su RNase free en az 10 µL. 10 µL yeterince membran hidrat ve toplam RNA verim azaltmak daha az kullanarak iletişim kuralıdır.</li>
</ol>2. Ters transkripsiyon
Not: Tamamlayıcı DNA (cDNA) (Toplam reaksiyon cilt) aşağıdaki 15 µL ters Transkripsiyon (RT) iletişim kuralını kullanarak sentez.
<ol><li>RT kiti buz çözme. Enzimler dondurucu sürece onları aşağılayıcı önlemek ve onları kullanmadan önce spin mümkün unutmayın. RT astar buz çözme ve onları kullanmadan önce spin.</li>
	<li>Ana mix Tablo 1' de açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Ana Mix 10 µL ve 96 iyi tabakta bir kuyu başına ayıklanan RNA'ın 5 µL birleştirir.</li>
	<li>2.000 x g 2 min için 4 ° C'de de iyi plaka santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Tablo 2 ' de açıklanan Ters transkripsiyon için termal döngü protokolünü kullanır. Not: aşağıda açıklandığı gibi cDNA doğrudan dijital PCR makinada işleme (bkz. Tablo reçetesi); Alternatif olarak,-20 ° C'de depolanmış olabilir</li>
</ol>3. damlacık üretimi ve dijital PCR
Not: Dijital PCR aşağıdaki 40 µL protokolü kullanılarak gerçekleştirilen.
<ol><li>Ticari dPCR mix, hazırlanan cDNA ve PCR astar buz çözme. Onları kısa bir süre kullanılmadan önce santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Açıklandığı gibi ana karışım hazırlamak Tablo 3.
</li>
	<li>1.33 μL/iyi RT ürün ekleyin ve kısa bir süre santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>20 μL örnek 8-şey kaset (orta satır) her kuyuya pipet. Not: 8-şey kaset tamamen dolu değil, kalan wells cDNA (yani, suyu ayıklanan RNA yerine ile üretilen RT ürün) ihmal şablonu olmayan denetimleri (NTCs) ile doldurmak veya dPCR ticari arabellek. NTC kontaminasyon kontrolü hizmet vermektedir. Bu damlacık oluşumu kalitesini bozabilir çünkü su içinde kalan wells, kullanılmamış olması gerekir.</li>
	<li>70 μL sondalar damlacık üretimi petrol petrol kuyuları (alt satır) 8-şey kaset pipet.</li>
	<li>8-şey kaset üstüne bir conta yeri ve damlacık Jeneratör ' kaset yerleştirin. Damlacık jeneratörü kapatın. 3 gösterge ışıkları sürekli yeşil kadar bekleyin. Not: Şimdi damlacıkları oluşturuluyor.</li>
	<li>Dikkatli ve yavaş 40 μL damlacık kurulan örnek (üst satır) pipetting tarafından bir 96-şey plaka ayrı kuyu aktarın.</li>
	<li>Damlacık oluşumu örnekleri üzerinde tamamladıktan sonra 4 için 180 ° C'de pierceable dPCR folyo ile PCR plaka mühür s.</li>
	<li>Folyo mühürlü PCR-plaka cycler yerleştirin ve rampa 2.5 oranında Tablo 4 ' te açıklandığı gibi döngüsü ° C/s.</li>
</ol>4. damlacık okuma ve analiz
<ol><li>Plaka, plaka sahibi tabanına termal cycler aktarın. PCR plaka plaka sahibi PCR plaka üzerine üstündeki yerleştirerek sıkıştırın.</li>
	<li>Ticari dPCR yazılımını başlatın.</li>
	<li>Örnek adı, deneme ve hedef adını kurulumunda girin. Mutlak miktar seçin.</li>
	<li>Çalıştır' ı tıklatarak okuma damlacık başlatın. FAM/HEX veya FAM/VIC hidroliz probları ile çalışırken algılama Kimya seçin. Not: Ticari dPCR yazılım sonra auto-verileri analiz eder.</li>
	<li>Doğru damlacık üretimi sağlamak için sonuçları tablosunda damlacık numaralarını denetleyin.</li>
	<li>Bütün wells ile aynı quantified miRNA seçin ve Çözümle' yi tıklatın. 2D leke olumlu damlacıkları işaretlemek ve el ile otomatik analiz verileri (Şekil 1) düzeltmek için kullanın.</li>
</ol>5. doğru hesaplama örneği
<ol><li>Örnek örnek normalleştirme faktörüyle (NF) çarparak normalleştirmek. NF medyan [C. elegans miR-39 ölçümleri]tüm örnekleri= / [C. elegans miR-39]verilen örnek
</li>
	<li>Seyreltme faktörler (DF) için ayarlama son miRNA serum konsantrasyonu hesaplayın. [miRNA] son DFRT DFdPCR DFEx x x x [miRNA]satır değeri = Nerede: [miRNA] satır değeri ticari dPCR yazılımların; sayısal miRNA = DFRT = seyreltme faktörü şablonunun Ters transkripsiyon; DFdPCR = dPCR; şablonunda seyreltme faktörü DFEx = seyreltme faktörü çıkarma içinde.</li>
</ol>6. sentetik oligonükleotid seyreltme serisi
<ol><li>Sentetik oligonükleotid liyofilize buz çözme. Kısaca santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Lyophilized sentetik oligonükleotid nükleaz ücretsiz su 10 pmol son bir konsantrasyon içinde seyreltik / µL. kısaca santrifüj kapasitesi bu.</li>
	<li>Tablo 5' te açıklandığı gibi nükleaz ücretsiz suda sulandırmak. Kısaca 8.000 x g 10 seyreltme her adımda arasında seyreltme santrifüj kapasitesi s.</li>
	<li>2. adımda açıklandığı gibi ters transkripsiyon ile devam etmek ve adım 3 ve adım 4 bölümünde açıklandığı gibi dijital PCR ile örnekleri analiz.</li>
</ol>

<ol><li>Schulte, C., Zeller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-based+diagnostics+and+therapy+in+cardiovascular+disease+-+summing+up+the+facts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts.</a> Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).</li>
<li>Sun, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microRNAs+in+myocardial+infarction%3A+from+molecular+mechanism+to+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li>
<li>Dimmeler, S., Zeiher, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+for+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases.</a> European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).</li>
<li>Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs%3A+novel+biomarkers+and+extracellular+communicators+in+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 110, 483-495 (2012).</li>
<li>Oerlemans, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+assessment+of+acute+coronary+syndromes+in+the+emergency+department%3A+the+potential+diagnostic+value+of+circulating+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).</li>
<li>Olivieri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+potential+of+circulating+miR-499-5p+in+elderly+patients+with+acute+non+ST-elevation+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction.</a> Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).</li>
<li>Navickas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+circulating+microRNAs+as+biomarkers+of+cardiovascular+disease%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review.</a> Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).</li>
<li>Devaux, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+value+of+circulating+microRNAs+in+patients+with+acute+chest+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain.</a> Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).</li>
<li>Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+normalization+strategies+for+microRNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Data normalization strategies for microRNA quantification.</a> Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).</li>
<li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+as+a+novel+detection+method+for+quantifying+microRNAs+in+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Internation+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction.</a> Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).</li>
<li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).</li>
<li>D'Alessandra, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+are+new+and+sensitive+biomarkers+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).</li>
<li>Forootan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+limit+of+detection+and+limit+of+quantification+in+quantitative+real-time+PCR+%28qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).</li>
<li>Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+droplet-digital+PCR+vs+real-time+quantitative+PCR+to+inhibitory+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances.</a> Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409(2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Dijital PCR nükleik asitler bir örnek içinde doğrudan mutlak miktar sağlar PCR nispeten roman son nokta yöntemidir. Yöntemi belirli avantajları, azalan bir değişkenliği, artan bir gün-gün tekrarlanabilirlik ve üstün hassasiyet11,12de dahil olmak üzere sahiptir. Ayrıca, örnek yaklaşık 20.000 tek reaksiyonlar ve bitiş noktası analizleri bölümleme nedeniyle, dPCR için daha sağlam olur kantitatif RT-PCR16için karşılaştırıldığında PCR sokan mad...

Dolaşımdaki miRNAs hastalıkları, kardiyovasküler hastalık1de dahil olmak üzere bir dizi için umut verici işaretler olarak tespit edilmiştir. MiRNAs küçük, kodlama-tek iplikçikli RNA molekülleri (yaklaşık 22 nükleotit uzun) söz konusu olursa çoğu düzenleme yoluyla değişiklik mesajcı RNA çeviri ve etkileyen gen ifade2, içinde ve içine fizyolojik ve patolojik durumları dolaşımda serbest bırakılır. Belirli miRNAs nicel ifade patolojiye bağlanabilir ve yüksek doku ve hastalık özgüllük1bazı miRNAs göstermektedir. Kardiyovasküler hastalıklarda miRNAs onlar serum içinde son derece kararlı olduğu ve kolayca yeni biyolojik PCR metodoloji3yardımı ile sayısal gibi çekici aday olmuştur. Miyokard infarktüsünde biyolojik olarak miRNAs potansiyel değeri küçük çalışmalarda değerlendirilmiştir ama büyük tabur bir doğrulama2eksik. Örneğin, miR-499 son derece miyokardiyal kas ifade bulunur ve bir amı4,5,6' önemli ölçüde artış gösterilmiştir. Ayrıca, düzenleyen programlanmış hücre ölümü (apoptoz) ve cardiomyocytes farklılaşma ve böylece bir amı7takip çeşitli mekanizmalar ilgilenmektedir. Bir üstünlük ve miRNAs AMI tanısı için artımlı değerini raporlama bazı küçük çalışmalar dışında üstünlük veya eşitlik yüksek-duyarlı kardiyak troponins için henüz büyük ölçekli çalışmalar2',5 kanıtlanmamıştır ,6,8. Bu nedenle, ileriye dönük çalışmalarda daha büyük tabur miRNAs olası tanı değerini değerlendirmek için gereklidir. Ayrıca, miRNA miktar yöntemleri optimize edilmiş olması gerekir ve standart karşılaştırılabilir kullanarak9protokolleri. Standart deneyleri tutarsız sonuçlar azaltabilir ve biyolojik kendi klinik uygulanabilirliği sağlamak için tekrarlanabilir bir şekilde sayısal gerek rutin klinik uygulama için potansiyel biyolojik olmak için miRNAs yardımcı olabilir.
Son zamanlarda, dPCR bir son nokta analiz olarak tanıttı. Yaklaşık 20.000 bireysel tepkiler10örnek bölümleri. DPCR sistemi standart eğri10olmadan mutlak bir miktar etkinleştirme bir matematiksel Poisson istatistiksel analiz floresan sinyallerini (pozitif ve negatif tepkiler), sonra kullanır. DPCR floresan hidroliz probları ile birleştirilirken, miRNAs çok özel doğrudan mutlak miktar mümkün olmaktadır. Dijital polimeraz zincir reaksiyonu miRNA seviyelerinde miktarının için (azalan bir değişkenliği, artan bir gün-gün tekrarlanabilirlik, doğrusallık yüksek derecede ve yüksek bir hassasiyet de dahil olmak üzere) üstün teknik özellikleri sergilemek göstermiştir nicel gerçek zamanlı PCR10,11' e göre dolaşım. Bu üstün teknik nitelikleri dolaşımdaki miRNAs biyolojik kullanma mevcut kısıtlamaları hafifletmek için yardımcı olabilir ve miRNAs kurulması için biyolojik büyük çok merkezi kardiyovasküler klinik çalışmalarda ve bir tanı yöntemi olarak neden olabilir Genel. Bir önceki çalışmada son zamanlarda dPCR miRNAs bir AMI hastalarında dolaşımdaki mutlak miktar için uygulanan ve miRNAs miktar için qPCR12ile karşılaştırıldığında üstün tanılama potansiyel göstermek başardık.
Bu yayında, dPCR kullanarak doğrudan kardiyovasküler miRNAs dolaşan miktarının için doğru ve tekrarlanabilir bir yöntem olduğunu ispat etmek istiyoruz. MiRNA düzeyleri kullanarak dijital PCR, serumda mutlak miktar büyük çok merkezi kardiyovasküler klinik deneylere kullanım için potansiyel gösterir. Bu yayında, etkili bir şekilde dijital PCR gerçekleştirmek ve serum içinde mutlak miRNA kopya numarası tespit ayrıntılı olarak anlatan.

<table><tbody><tr><td><güçlü >RNA Ekstraksiyonu< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum / Plazma Kiti (50)</td> <td>Qiagen-Numune & MikroRNA ekstraksiyonu için Assay Technologies, Hilden, Deutschland</td><td>217184</td><td>Kit. Kit, ticari tampon RWT içerir (el yazmasında bir numara olarak adlandırılır)&nbsp; ve RPE (el yazmasında iki numara olarak adlandırılır).</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plazma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol</td><td>Qiagen-Örnek & Assay Technologies, Hilden, Deutschland</td><td>219610</td><td>Normalizasyon için Spike-in, Sıra: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'</td></tr><tr><td><güçlü>Ters Transkripsiyon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Ters Transkripsiyon Kiti (1000 Reaksiyon)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, ABD</td><td>4366597</td><td>MicroRNA ters transkripsiyon kiti</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Testleri M</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, ABD</td><td>4440887</td><td>Ters transkripsiyonda kullanılan tahliller</td></tr><tr><td>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, ABD</td><td>4440887</td><td>Tahlil Numarası 001352</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, ABD</td><td>4440887</td><td>Tahlil Numarası 000200</td></tr><tr><td>PCR Plakası, 96 kuyulu, segmentli, yarı etekli</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD</td><td>AB0900</td><td>Ters transkripsiyon için 96 kuyulu plaka</td></tr><tr><td>Microseal ' B&rsquo; mühür Mühürler</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD</td><td>MSB1001</td><td>Uygun depolamayı sağlamak için folyo</td></tr><tr><td>C1000 Dokunmatik Termal Döngüleyici</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD</td><td>1851196</td><td>Ters transkripsiyon için kullanılan</td></tr> döngüleyici<tr><td><güçlü>Damlacık Dijital PCR</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 nmol RNA oligo has-miR-499-5p</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>Özel</td><td>Sıra: Problar için 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGUUU-3'ddPCR</td></tr> <tr><td>Süper Karışım (dUTP yok)</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD</td><td>1863024</td><td>Damlacık üretiminde kullanılan süpermiks</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Testleri Applied</td><td>Biosystems, Inc., Foster City, CA, ABD</td><td>4440887</td><td>Dijital PCR'de kullanılan testler (floresan hidroliz probu)</td></tr><tr><td>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, ABD</td><td>4440887</td><td>Tahlil Numarası 001352, ticari primerler</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, ABD</td><td>4440887</td><td>Tahlil Numarası 000200, ticari astarlar</td></tr><tr><td>DG8 Kartuşlar ve Contalar</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD</td><td>1864007</td><td>Kartuş, damlacık üretimi için 8 adede kadar numune alır</td></tr><tr><td>DG8 Kartuş Holder</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD</td><td>1863051</td><td>Damlacık üretiminde kartuşları tutar</td></tr><tr><td>Problar için Damlacık Üretim Yağı</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD</td><td>1863005</td><td>Damlacık üretiminde kullanılan yağ</td></tr><tr><td>ddPCR 96 Kuyulu Plakalar</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD</td><td>12001925</td><td>ddPCR PCR Plakası için 96 kuyulu plaka</td></tr><tr><td>Isı Yalıtımı, folyo, delinebilir</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD</td><td>1814040</td><td>Delinebilir folyo, damlacık okuyucu</td></tr><tr><td>ddPCR ile uyumlu Damlacık Okuyucu Yağı</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD</td><td>1863004</td><td>Damlacık okumada kullanılan yağ</td></tr><tr><td>QX100 veya QX200 Damlacık Jeneratörü</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD</td><td>1863002</td><td>Damlacık Jeneratörü, numune/yağ emülsiyonu PX1 PCR'den damlacıklar üretir</td></tr><tr><td> Plaka Kapatıcı</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD</td><td>1814000</td><td>PCR</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td> öncesi plakayı kapatır <td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD</td><td>ddPCR</td><td></td></tr><tr><td>QX100 veya QX200 Damlacık Okuyucu</td> için kullanılan 1851196 Döngüleyici <td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD</td><td>1863003</td><td>Optik dedektör</td></tr> <tr><td>ile PCR pozitif ve PCR negatif damlacıkları okurProblar için ddPCR Tampon Kontrolü</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD</td><td>1863052</td><td>Boş kontrol&nbsp; ve kalan 8 kuyulu kaset</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantaSof Software</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ABD</td><td>1864011</td><td>Damlacık okuma programı</td></tr><tr><td>Prizma Windows 5</td><td>GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, ABD</td><td></td><td>İstatistiksel analiz programı</td></tr></tbody></table>

akut miyokard infarktüsü ve kardiyovasküler hastalık mikrorna'lar dolaşan miktarının için dijital pcr

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Dolaşımdaki serum mikroRNA (miRNAs) kalp-damar hastalıkları ve akut miyokard infarktüsü (AMI), biyolojik olarak kardiyovasküler hücrelerden dolaşıma serbest bırakılması söz göstermiştir. Dolaşımdaki miRNAs son derece istikrarlı ve sayısal. Belirli miRNAs nicel ifade patoloji ve bazı miRNAs gösteri yüksek doku ve hastalık özgüllük bağlanabilir. Roman biyolojik kalp-damar hastalıkları için bulma tıbbi araştırma için önem taşıyor. Oldukça yakın, dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) icat etti. dPCR, floresan hidroliz probları ile birlikte belirli doğrudan mutlak miktar sağlar. dPCR düşük değişkenliği, yüksek doğrusallık ve nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) göre yüksek hassasiyet gibi üstün teknik nitelikleri sergiler. Böylece, dPCR doğrudan miRNAs, özellikle büyük çok merkezi kardiyovasküler klinik çalışmalarda kullanılmak miktarının bir daha doğru ve tekrarlanabilir yöntemdir. Bu yayında nasıl etkili serum numuneleri mutlak kopya sayısında değerlendirmek için dijital PCR gerçekleştirmek açıklar.

Dijital PCR floresan hidroliz probları ile kombine araştırmacılar doğrudan belirli miRNAs kopya/µL mutlak miktarı ölçmek için sağlar. DPCR örnekte içinde yaklaşık 20.000 bireysel PCR reaksiyonları, dPCR teknik gerektirmeyen bölümlere gibi10çoğaltır. DPCR sistemi (pozitif ve negatif tepkiler arasında farklı) Floresan sinyallerini bir matematiksel Poisson istatistiksel analizi kullanır eğri bir standart için ihtiyaç olmadan10mutlak bir miktar ...

Dolaşımdaki mikroRNA'lar söz biyolojik kalp-damar hastalıkları ve akut miyokard enfarktüsü olarak göstermiştir. Bu çalışmada, bir protokol miRNA ayıklama, Ters transkripsiyon ve kardiyovasküler hastalığı olan hastalarda serum miRNAs mutlak miktar için dijital PCR için açıklar.

Akut miyokard infarktüsü ve kardiyovasküler hastalık mikroRNA'lar dolaşan miktarının için dijital PCR

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Bu yöntem, mikro RNA'ların kardiyovasküler hastalıkta geçerli biyobelirteçler olup olmadığı gibi tanı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile karşılaştırıldığında, dijital PCR, dolaşımdaki mikroRNA'ları ölçmek için üstün teknik nitelikler sergiler. Numune yaklaşık 20.000 damlacığa bölündüğünden, mükerrer ölçümlere gerek yoktur ve miktar tayini için standart bir eğriye gerek yoktur.Bu yöntem, kardiyovasküler hastalarda mikroRNA'ların miktar tayini hakkında fikir verebilse de, diğer hastalara ve hastalıklara da uygulanabilir, çünkü diğer mikroRNA'lar kanser ilerlemesinde biyobelirteç olarak umut vaat ettiğinden, onkolojik hastalara da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, üretilen damlacıklar kırılgan olduğundan ve dikkatli bir şekilde ele alınması gerektiğinden mücadele edecektir. Serum örneklerinden RNA'yı izole ettikten sonra, dPCR için daha kararlı tamamlayıcı DNA elde etmek için ters transkripsiyonla devam edin.Başlamak için, ters transkripsiyon kitini buz üzerinde çözün. Sonra enzimleri ve primerleri döndürün. Ardından, ana karışımı metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın.Ana karışımın 10 mikroli

digital-pcr-for-quantifying-circulating-micrornas-acute-myocardial

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Burada örnek sınırlı miktarda çalışma, özellikle microRNA (miRNA) ekspresyon düzeyleri için bir maliyet ve zaman etkili yüksek verimli bir tarama aracı olarak mikroakışkan platformu ile birlikte optimize edilmiş bir multiplex ters transkriptaz kantitatif PCR (QRT PCR) protokolü açıklamak.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

Karmaşık biyolojik örneklerde ölçüm biyolojik giderek karar verme klinik rehberlik. Biz aynı anda kalp miyozin bağlayıcı protein-C, kreatin kinaz MB ve miyokard infarktüsü ve sağlıklı kontrol grubu olan hastalarda serum örneklerinde kardiyak troponin I ölçmek için son derece hassas bir yöntem açıklanmaktadır.

Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi

Sirkülasyon mikroRNAlar son zamanlarda çeşitli kanser ve diğer hastalıklar için umut verici ve yeni biyolojik belirteçler olarak ortaya çıkmıştır. Bu makalenin amacı üç farklı prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR platformları ve ölçmek ve microRNA dolaşan bereket belirlemek için kullanılabilir yöntemleri tartışmaktır.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Boya bazlı bir kimya ve damlacık dijital PCR teknolojisi kullanılarak hücresiz mikroRNA'ların miktar tayini için hassas ve doğru bir yöntem açıklanmaktadır.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

MikroRNA'lar önemli bir düzenleyici rol oynar ve çeşitli insan hastalıkları için yeni bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmaktadır. MiRNA'ların yüksek yoğunluklu lipoprotein taşınmaktadır gösterilmiştir. Hızla insan plazmasından MiRNA analizi için uygun, saflaştırılmış HDL izole edilmesi için basit bir yöntem geliştirdik.

Yüksek Saf Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein gelen miRNA Yüksek koymak Through-İzolasyon için hızlı ve basitleştirilmiş Yöntemi

Bu rapor plazma miRNA, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR ile veya öncesi amplifikasyon olmadan kullanarak mutlak düzeylerini ölçmek için bir protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı plazma miRNAs miktarı daha iyi anlaşılmasını tanıyor ve nitel karşılık gelen verilerden farklı çalışmalar veya laboratuvar değerlendirmesini sağlar.

Cynomolgus maymunlar, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak plazma mikroRNA düzeylerinin mutlak miktar

Mikro-RNA'ların (miRNAs) haberci RNA (mRNA) çoğu düzenleyiciler hizmet veren kısa ve son derece homolog RNA dizileri vardır. Geçerli miRNA algılama yöntemleri duyarlılık ve özgüllük değişir. Situ hibridizasyon ve immunostaining eşzamanlı miRNA ve protein molekülleri fare kalp doku bölümlerinde algılanması için bir araya getiren bir protokolü açıklar.

Doku özgü miRNA ifade profil oluşturma In Situ hibridizasyon fareyle kalp bölümleri içinde

Bu makale, kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak akut böbrek hasarı olan bir fare modelinin böbreklerinde mikroRNA ekspresyonunu tespit etmek için bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, iskemik böbrek hasarı fare modelini ve mikroRNA örneklerinin dikkatli bir şekilde çıkarılmasını vurgular.

İskemik Böbrek Hasarı Fare Modelinin Böbrekteki MikroRNA'ları için Kantitatif Bir Tespit Yöntemi

Bu protokol, farklı primerler kullanılarak hücrelerdeki dairesel RNA (circRNA) seviyelerinin hassas bir şekilde ölçülmesi için ayrıntılı dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemini açıklamaktadır.

Dairesel RNA'ların Dijital Damlacık PCR Kullanılarak Nicelleştirilmesi

Akut miyokard infarktüsü (AMI) sıçan modelinde kalp patofizyolojik ve fizyolojik fonksiyonu MI sonucu incelemek için yararlıdır.

Sıçanlarda Akut Miyokard Enfarktüsü

Öğrenin, dolaşan mikroRNA'ları dijital PCR ile kardiyovasküler hastalıklar için biyobelirteç olarak nicelendirmeyi. Bu yöntem, serum örneklerinde miRNA ölçümünün doğruluğunu artırarak araştırmacılara güvenilir bir protokol sunar.

Akut miyokard infarktüsü ve kardiyovasküler hastalık mikroRNA'lar dolaşan miktarının için dijital PCR

Daha fazla video keşfet