Akut miyokard infarktüsü ve kardiyovasküler hastalık mikroRNA'lar dolaşan miktarının için dijital PCR

Bu yöntem, mikro RNA'ların kardiyovasküler hastalıkta geçerli biyobelirteçler olup olmadığı gibi tanı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile karşılaştırıldığında, dijital PCR, dolaşımdaki mikroRNA'ları ölçmek için üstün teknik nitelikler sergiler. Numune yaklaşık 20.000 damlacığa bölündüğünden, mükerrer ölçümlere gerek yoktur ve miktar tayini için standart bir eğriye gerek yoktur.

Bu yöntem, kardiyovasküler hastalarda mikroRNA'ların miktar tayini hakkında fikir verebilse de, diğer hastalara ve hastalıklara da uygulanabilir, çünkü diğer mikroRNA'lar kanser ilerlemesinde biyobelirteç olarak umut vaat ettiğinden, onkolojik hastalara da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, üretilen damlacıklar kırılgan olduğundan ve dikkatli bir şekilde ele alınması gerektiğinden mücadele edecektir. Serum örneklerinden RNA'yı izole ettikten sonra, dPCR için daha kararlı tamamlayıcı DNA elde etmek için ters transkripsiyonla devam edin.

Başlamak için, ters transkripsiyon kitini buz üzerinde çözün. Sonra enzimleri ve primerleri döndürün. Ardından, ana karışımı metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın.

Ana karışımın 10 mikrolitresini, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda beş mikrolitre ekstrakte edilmiş RNA ile birleştirin. Daha sonra plakayı iki dakika boyunca dört santigrat derecede 2.000xg'de santrifüjleyin. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ters transkripsiyon ile devam edin.

İlk olarak, ticari dPCR karışımını, cDNA ve PCR primerlerini buz üzerinde çözün ve kullanmadan hemen önce santrifüjleyin. Ardından ana karışımı metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Ana karışımın 18,67 mikrolitre hacmine 1,33 mikrolitre hacimde ters transkripsiyon ürünü ekleyin ve kısaca santrifüjleyin.

Bir pipet kullanarak, 20 mikrolitre numuneyi sekiz kuyucuklu bir kasetin orta sırasının her bir oyuğuna aktarın. Daha sonra 70 mikrolitre damlacık üretim yağını kasetin yağ kuyularına pipetleyin. Ardından, kasetin üstüne bir conta yerleştirin ve damlacık üretecine yerleştirin.

Damlacık üretecini kapatın ve üç gösterge ışığı sabit yeşil yanana kadar bekleyin. Bir pipet kullanarak, damlacık şeklindeki numunenin 40 mikrolitresini 96 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına dikkatlice aktarın. Ardından plakayı dPCR folyosu ile 180 santigrat derecede dört saniye boyunca kapatın.

Mühürlü PCR plakasını döngüleyiciye yerleştirin ve metin protokolünde belirtilen döngü talimatlarını izleyin. Plakayı termocycler'dan çıkarın ve bir plaka tutucunun tabanına aktarın. Ardından plaka tutucunun üst kısmını PCR plakasına yerleştirin.

Son olarak, ticari dPCR yazılımını başlatın. Bu protokolde, kardiyovasküler hastalığı olan hastaların serumundaki mikroRNA'ları ölçmek için dijital PCR kullanıldı. Örnekler 16 hastadan perkütan girişim öncesi, sekiz saat sonra ve 16 saat sonra alındı.

ST yükselmeli miyokard enfarktüsü olan hastalar, stabil koroner arter hastalığı olan hastalara kıyasla miR-499 seviyelerinde anlamlı bir artış gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik doğru yapılırsa 96 numunenin damlacık oluşumu için yaklaşık bir saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, damlacıkları dikkatli bir şekilde kullanmayı akılda tutmak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, doğru damlacık oluşumu, döngü, okuma ve analiz yoluyla dijital PCR'nin doğru bir şekilde nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.