Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

Bu prosedürün genel amacı, nükleozom yoğunluğu analizi için natif kromatin immünopresipitasyon sekanslama kütüphaneleri oluşturmaktır. Bu yöntem, bir hücre popülasyonundaki epigenomik özellikleri tek nükleozom düzeyinde ortaya çıkarmak ve heterojen kromatin imzalarını sürekli öğelerine ayırmak gibi epigenetik sorulara yanıt verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, açık kromatin bölgesine tercihli erişim sağlayan MNase özelliğini kullanarak, MNase erişilebilirliğini histon modifikasyonu ile birleştiren bir ölçüm oluşturmaktır.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, optimal MNase sindirimi elde edemedikleri için zorluk yaşayacaklardır. Bu protokole, metin protokolünde açıklandığı şekilde hücre hazırlama ile başlayın. Birinci günde, her bir hücre peletini 37 °C sıcaklığındaki bir su banyosunda 10 saniye boyunca çözdürün.

Ardından, hücreleri buza transfer edin. Her bir hücre peletine, 20 µL başına 10.000 hücre olacak nihai konsantrasyonda, buz gibi soğuk bir-X lizis tamponu artı bir-X PIC'i hemen ekleyin. Kabarcık oluşturmadan pipetle yukarı-aşağı çekerek 10 kez karıştırın.

Buz üzerinde çalışarak, elde edilen lizatlardan her bir kuyuya 20 µL olacak şekilde 96 kuyucuklu bir plakaya paylaştırın. Plakayı, buz üzerinde 20 dakika inkübe etmeden önce plastik kapakla kapatın. Plakayı MNase olarak etiketleyin ve kuyucukları bir şablon anahtara kaydedin.

20 dakikalık lizis tamamlanmadan hemen önce, MNase one enzimini MNase one dilüsyon tamponu ile microliter başına 20 ünite nihai konsantrasyona gelecek şekilde seyreltin ve buz üzerinde tutun. Buz üzerinde çalışarak, metin protokolünde açıklandığı şekilde MNase one sindirim ana karışımını hazırlayın. Ardından, numune satırlarının her biri için 20 microliter ana karışımı ve beş microliter ek hacmi bir 96 kuyucuklu rezervuar plakasına paylaştırın.

Lizatlar inkübasyon sürecini tamamladıktan sonra, MNase sindirim plağını buz üzerinden çıkarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir örnek sırasına 20 µL MNnase bir sindirim ana karışımı ekleyin ve pipetle 10 kez çekip bırakarak karıştırın. Sıralar arasında uçları değiştirin.

Ardından, plakayı oda sıcaklığında tam beş dakika boyunca inkübe edin. Beş dakika sonra reaksiyonu durdurmak için, çok kanallı bir pipet kullanarak her bir örnek sırasına altı mikrolitre 250-mikromolar EDTA ekleyin ve birkaç kez yukarı aşağı karıştırın. Sıralar arasında pipet uçlarını değiştirdiğinizden emin olun.

EDTA eklemesinden sonra, pipetin ayarını 20 mikrolitreye getirin ve sindirim reaksiyonunun tamamen durduğundan emin olmak için daha önce yaptığınız gibi 10 kez karıştırın. Son olarak, MNase ile sindirilmiş numunelerin her bir sırasına altı mikrolitre 10X lizis tamponu ekleyin ve pipetle 10 kez yukarı aşağı çekerek iyice karıştırın. Plakayı plastik bir örtüyle kapatın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Antikor boncuk kompleksi plakasını ve ön temizleme plakasını metin protokolünde açıklandığı şekilde hazırlayın. Her iki plakayı da 200 ×g'de 10 saniye boyunca santrifüj ederek hızlıca döndürün. Ardından, antikor boncuk kompleksi plakasını bir plaka mıknatısı üzerine yerleştirin ve çözeltinin berraklaşması için 15 saniye bekleyin. Boncukları rahatsız etmeden süpernatantı bir pipet yardımıyla dikkatlice uzaklaştırın ve atın.

Ardından, plakayı plaka mıknatısından çıkarın ve buz üzerinde tutun. Ön temizleme reaksiyon plakasını bir plaka mıknatısı üzerine yerleştirin ve boncukların ayrılıp çözeltinin berraklaşması için 15 saniye bekleyin. Boncukları rahatsız etmeden, bir pipet kullanarak süpernatanı buz üzerinde tutulan antikor boncuk kompleksi plakasının ilgili kuyucuklarına dikkatlice aktarın.

Her kuyucuğu pipetleme yöntemiyle 15 kez aşağı yukarı çekerek nazikçe karıştırın. Plakayı bir alüminyum plaka kapağı ile iyice kapatın ve döner bir platform üzerinde dört santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, plakayı IP Reaksiyonu şeklinde yeniden etiketleyin.

İkinci günde, ısıtmalı karıştırıcıyı 65 °C'ye ayarlayın, ardından buz üzerinde düşük tuzlu yıkama tamponu ve yüksek tuzlu yıkama tamponu hazırlayın. IP reaksiyon plağını 200 ×g'de 10 saniye boyunca hızlıca santrifüjleyin. IP reaksiyon plağını bir plaka mıknatısı üzerine yerleştirin ve çözelti berraklaşana kadar 15 saniye bekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, boncukları rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çekin ve atın.

Plakayı plaka mıknatısından çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. IP reaksiyon plağındaki her örnek sırasına 150 µL buz gibi soğuk düşük tuzlu yıkama tamponu ekleyin ve boncukları tamamen yeniden süspandüye etmek için yavaşça 10 kez yukarı-aşağı karıştırın. IP reaksiyon plağını tekrar plaka mıknatısına yerleştirin ve süpernatantı daha önce yaptığınız gibi uzaklaştırın.

Ardından, plakayı tekrar buza yerleştirin ve yıkama adımlarını toplam iki yıkama olacak şekilde tekrarlayın. Buz üzerinde çalışarak, IP reaksiyon plakasındaki her örnek sırasına 150 µL yüksek tuzlu yıkama tamponu ekleyin. Boncukları tamamen yeniden süspande etmek için örnekleri pipetle 10 kez aşağı yukarı çekerek yavaşça karıştırın.

Daha önce yapıldığı gibi süpernatan uzaklaştırıldıktan sonra, IP reaksiyon plağı buza yerleştirilmeli ve yanına yeni bir 96 kuyucuklu plak ön soğutulmalıdır. IP reaksiyon plağındaki numunelerin her bir sırasına 150 µL yüksek tuzlu yıkama tamponu eklenmeli ve boncukların tamamen yeniden süspanse edilmesi için pipetleme yoluyla 10 kez yavaşça karıştırılmalıdır. Yeniden süspansiyon işleminden sonra, numunelerin her sırası, ön soğutulmuş yeni 96 kuyucuklu plağın karşılık gelen sırasına aktarılmalıdır.

Eski plakayı atın. Yeni IP reaksiyon plakasını plaka mıknatısı üzerine yerleştirin ve süpernatantı daha önce yaptığınız gibi atın. Plakayı oda sıcaklığında tutun.

IP reaksiyon plağındaki her bir örnek sırasına 30 µL ChIP elüsyon tamponu ekleyin ve pipetle 10 kez yukarı-aşağı çekerek yavaşça karıştırın. Kabarcık oluşumunu önlemeye dikkat edin. Plağı bir PCR kapağı ile kapatın ve 1.350 RPM karıştırma hızıyla, 65 °C'deki bir ısıtmalı karıştırıcıda 1,5 saat boyunca inkübe edin.

1 1/2 saatlik inkübasyonun ardından, IP reaksiyon plağını 4 °C'de, bir dakika boyunca 200 ×g hızda santrifüjleyin. Daha sonra, IP reaksiyon plağını bir plak mıknatısı üzerine yerleştirin ve solüsyon berraklaşana kadar bekleyin. Boncukları rahatsız etmeden, çok kanallı bir pipet kullanarak, her sıra için yeni uçlar kullanarak süpernatantın 20 µL'sini dikkatlice yeni bir 96 kuyucuklu plağa aktarın.

Plakayı IP Reaksiyonu şeklinde etiketleyin ve oda sıcaklığında tutun. Metin protokolünde açıklandığı şekilde protein sindirimi ve ardından kütüphane oluşturma adımlarına geçin. Burada; kütüphane oluşturma öncesindeki optimal, yetersiz sindirilmiş ve aşırı sindirilmiş MNase sindirimli kromatinin temsilci sonuçları gösterilmiştir.

Optimal şekilde sindirilmiş profilde, yüksek mertebeden nükleozom fragmanlarının geri kazanımına izin verecek şekilde aşırı sindirim yapılmadan, tekil nükleozom fragman boyutları hakimdir. Kromatinin suboptimal sindirimi, IP materyalinden üretilen sekanslama kütüphanesinin profilinde de belirgin olacaktır. Kütüphaneleri qPCR ile doğrulamak için, pozitif ve negatif hedefler için IP kütüphanelerinin girdi kütüphanesine göre kat artırımı değerlendirilmiştir.

Ek olarak, yüksek qPCR ile değerlendirilen kat artışına sahip kütüphanelerin hizalanmış okumalarının bir genom tarayıcısında incelenmesi, girdi kütüphanesine kıyasla görsel olarak tespit edilebilir zenginleşmeler ortaya koymalıdır. Başarılı nükleozom yoğunluğu ChIP-seq kütüphaneleri, hizalanmış okumaların önemli bir kısmı MACS2 tarafından tanımlanan zenginleşmiş piklerin içinde yer alan, yüksek korelasyonlu tekrarlar içerecektir. Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütüldüğü takdirde iki günde tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, nükleozom yoğunluğu analizi için natif kromatin immünopresipitasyon dizileme kütüphanelerinin nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, kromatinin optimal şekilde sindirildiğinden emin olmanın ve yalnızca ilgilenilen epitopla yüksek afinite gösteren ve diğer epitoplarla çok az çapraz reaksiyon gösteren veya hiç göstermeyen antikorlar kullanmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, bir hücre popülasyonu içindeki heterojenlikten kaynaklanan epigenetik imzalar gibi soruları yanıtlamak için MNase erişilebilirliğinin hesaplamalı modellemesi gerçekleştirilebilir.

Bu yöntem, nükleozom konumunun ve yerel yoğunluğun yanı sıra histon alt birimlerinin translasyon sonrası modifikasyonlarının kombinatoryal etkisine dair bilgi sağlar ve insan veya fare gibi her türlü sisteme, primer hücrelere ve dondurulmuş dokulara uygulanabilir.