Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

Bu prosedürün genel amacı, nükleozom yoğunluk analizi için doğal kromatin immünopresipitasyon dizileme kitaplıkları oluşturmaktır. Bu yöntem, tek bir nükleozom seviyesinde bir hücre popülasyonundaki epigenomik özelliklerin ortaya çıkarılması ve heterojen kromatin imzalarının sürekli elementlerine çözülmesi gibi epigenetikteki sorulara cevap verebilir. Bu tekniğin ana avantajı, MNaz erişilebilirliğini histon modifikasyonu ile birleştiren bir ölçüm oluşturmak için açık kromatin bölgesine tercihli erişimin MNase özelliğini kullanmaktır.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, optimal MNaz sindirimi elde edemedikleri için mücadele edeceklerdir. Bu protokole, metin protokolünde açıklandığı gibi hücre hazırlığı ile başlayın. Birinci gün, her hücre peletini 37 santigrat derece su banyosunda 10 saniye boyunca çözdürün.

Ardından, hücreleri buza aktarın. Her hücre peletine, hemen 20 mikrolitre başına 10.000 hücrelik bir nihai konsantrasyona buz gibi soğuk bir bir-X lizis tamponu artı bir-X PIC ekleyin. Kabarcık oluşturmadan yukarı ve aşağı pipetleyerek 10 kez karıştırın.

Buz üzerinde çalışarak, elde edilen lizatların oyuğu başına 20 mikrolitreyi 96 oyuklu bir plakaya alikotlayın. Buz üzerinde 20 dakika inkübe etmeden önce plakayı plastik conta ile örtün. Plakayı MNase olarak etiketleyin ve kuyucukları bir şablon anahtarına kaydedin.

20 dakikalık lizis tamamlanmadan hemen önce, MNase bir enzimi MNase bir seyreltme tamponu ile mikrolitre başına 20 birimlik bir nihai konsantrasyona seyreltin ve buz üzerinde tutun. Buz üzerinde çalışarak, MNase bir sindirim ana karışımını metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Ardından, her bir numune sırası için 20 mikrolitre ana karışım ve ayrıca beş mikrolitre ekstra hacmi 96 oyuklu bir rezervuar plakasına ayırın.

Lizatlar inkübe etmeyi bitirdikten sonra, MNase sindirim plakasını buzdan çıkarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir numune sırasına 20 mikrolitre MNnase bir sindirim ana karışımı ekleyin ve 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Satırlar arasındaki ipuçlarını değiştirin.

Ardından, plakayı oda sıcaklığında tam olarak beş dakika inkübe edin. Beş dakika sonra reaksiyonu durdurmak için, her bir numune sırasına altı mikrolitre 250 mikromolar EDTA eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın ve birkaç kez yukarı ve aşağı karıştırın. Satırlar arasındaki ipuçlarını değiştirdiğinizden emin olun.

EDTA ilavesinden sonra, pipetin ayarını 20 mikrolitreye getirin ve sindirim reaksiyonunun tamamen durmasını sağlamak için öncekinden 10 kez karıştırın. Son olarak, MNase sindirilmiş numunelerin her sırasına altı mikrolitre 10X lizis tamponu ekleyin ve 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Plakayı plastik bir conta ile örtün ve 15 dakika buz üzerinde inkübe edin.

Antikor boncuk kompleks plakasını ve ön temizleme plakasını metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Her iki plakayı da 200 kez G'de 10 saniye santrifüjleyerek hızlı bir şekilde döndürün. Ardından, antikor boncuk kompleks plakasını bir plaka mıknatısına yerleştirin ve çözeltinin berraklaşması için 15 saniye bekleyin. Boncukları rahatsız etmeden bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın.

Ardından, plakayı plaka mıknatısından çıkarın ve buz üzerinde tutun. Ön temizleme reaksiyon plakasını bir plaka mıknatısı üzerine yerleştirin ve boncukların ayrılması ve çözeltinin berraklaşması için 15 saniye bekleyin. Boncukları rahatsız etmeden, süpernatanı buz üzerinde tutulan antikor boncuk kompleksi plakasının karşılık gelen kuyucuklarına dikkatlice aktarmak için bir pipet kullanın.

Her birini 15 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın. Plakayı bir alüminyum plaka kapağı ile iyice kapatın ve dönen bir platform üzerinde gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından, plakayı IP Reaksiyonu olarak yeniden etiketleyin.

İkinci günde, ısıtma karıştırıcısını 65 santigrat dereceye ayarlayın, ardından buz üzerinde düşük tuzlu yıkama tamponu ve yüksek tuzlu yıkama tamponu hazırlayın. IP reaksiyon plakasını 200 kez 10 saniye boyunca hızlı döndürün G. IP reaksiyon plakasını bir plaka mıknatısına yerleştirin ve çözeltinin berraklaşması için 15 saniye bekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, boncukları rahatsız etmeden, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın.

Plakayı plaka mıknatısından çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. IP reaksiyon plakasındaki her bir numune sırasına 150 mikrolitre buz gibi düşük tuzlu yıkama tamponu ekleyin ve boncukları tamamen yeniden süspanse etmek için 10 kez yavaşça yukarı ve aşağı karıştırın. IP reaksiyon plakasını tekrar plaka mıknatısına yerleştirin ve süpernatanı daha önce olduğu gibi çıkarın.

Ardından, plakayı tekrar buzun üzerine yerleştirin ve toplam iki yıkama için yıkama adımlarını tekrarlayın. Buz üzerinde çalışarak, IP reaksiyon plakasındaki her bir numune sırasına 150 mikrolitre yüksek tuzlu yıkama tamponu ekleyin. Boncukları tamamen yeniden süspanse etmek için 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek numuneleri yavaşça karıştırın.

Süpernatanı daha önce olduğu gibi çıkardıktan sonra, IP reaksiyon plakasını buzun üzerine yerleştirin ve yanına yeni bir 96 oyuklu plakayı önceden soğutun. IP reaksiyon plakasındaki her bir numune sırasına 150 mikrolitre yüksek tuzlu yıkama tamponu ekleyin ve boncukları tamamen yeniden süspanse etmek için yukarı ve aşağı pipetleyerek 10 kez yavaşça karıştırın. Yeniden süspansiyondan sonra, her bir numune sırasını yeni, önceden soğutulmuş 96 oyuklu plakanın ilgili sırasına aktarın.

Eski plakayı atın. Yeni IP reaksiyon plakasını plaka mıknatısına yerleştirin ve süpernatanı daha önce olduğu gibi atın. Plakayı oda sıcaklığında tutun.

IP reaksiyon plakasındaki her bir numune sırasına 30 mikrolitre ChIP elüsyon tamponu ekleyin ve 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın. Kabarcık oluşumunu engellemeye özen gösterin. Plakayı bir PCR kapağı ile kapatın ve 1.350 RPM karıştırma hızıyla 1 1/2 saat boyunca 65 santigrat derecede bir ısıtma karıştırıcısında inkübe edin.

1 1/2 saatlik bir inkübasyondan sonra, IP reaksiyon plakasını dört santigrat derecede bir dakika boyunca 200 kez G'de döndürün. Ardından, IP reaksiyon plakasını bir plaka mıknatısının üzerine yerleştirin ve çözeltinin berraklaşmasını bekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, boncukları rahatsız etmeden, her sıra için yeni uçlar kullanarak 20 mikrolitre süpernatanı dikkatlice 96 oyuklu yeni bir plakaya aktarın.

Plakayı IP Reaksiyonu olarak etiketleyin ve oda sıcaklığında tutun. Protein sindirimine ve ardından metin protokolünde açıklandığı gibi kütüphane yapımına devam edin. Burada, kütüphane oluşumundan önce optimal, az sindirilmiş ve aşırı sindirilmiş MNaz sindirilmiş kromatinin temsili sonuçları gösterilmiştir.

Optimal olarak sindirilen profile tek nükleozom fragman boyutları hakimdir, ancak daha yüksek dereceli nükleozom fragmanlarının geri kazanılmasına izin vermek için aşırı sindirilmez. Kromatinin yetersiz sindirimi, IP materyalinden oluşturulan sıralama kütüphanesinin profilinde de belirgin olacaktır. Kütüphaneleri qPCR ile doğrulamak için, IP kütüphanelerinin giriş kütüphanesine göre katlama zenginleşmesi pozitif ve negatif hedefler için değerlendirildi.

Ek olarak, bir genom tarayıcısında yüksek qPCR tarafından değerlendirilen kat zenginleştirmesine sahip kitaplıkların hizalanmış okumalarının incelenmesi, giriş kitaplığına kıyasla görsel olarak algılanabilir zenginleştirmeleri ortaya çıkarmalıdır. Başarılı nükleozom yoğunluğu ChIP dizileme kitaplıkları, MACS2 ile tanımlanan zenginleştirilmiş tepe noktaları içinde hizalanmış okumaların önemli bir kısmı ile yüksek korelasyonlu kopyalar içerecektir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki gün içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, nükleozom yoğunluk analizi için doğal kromatin immünopresipitasyon dizileme kitaplıklarının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, kromatinin en iyi şekilde sindirildiğinden emin olmayı ve yalnızca ilgilenilen epitop ile yüksek afinite gösteren ve diğer epitoplarla çok az çapraz reaktivite gösteren veya hiç göstermeyen antikor kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, bir hücre popülasyonu içindeki heterojenliğe bağlı epigenetik imzalar gibi soruları yanıtlamak için MNaz erişilebilirliğinin hesaplamalı modellemesi gerçekleştirilebilir.

Bu yöntem, nükleozom pozisyonunun ve yerel yoğunluğun kombinatoryal etkisinin yanı sıra histon alt birimlerinin translasyon sonrası modifikasyonu hakkında bilgi sağlar ve insan veya fare, birincil hücreler ve donmuş dokular gibi herhangi bir sisteme uygulanabilir.