FM sinaps Bisiklete binme boya: yüksek potasyum depolarizasyon, elektrik ve Channelrhodopsin stimülasyon karşılaştırma

Bu deneyin genel amacı, floresan FM boyaları kullanılarak Drosophila larva nöromüsküler kavşağının canlı hazırlığı üzerinde sinaptik veziküllerin endo ve ekzositoz döngüsünü gözlemlemektir. Bu yöntem, sinaptik vezikül döngüsünün işlevi için hangi genlerin kritik olduğu gibi sinirbilim alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, üç farklı uyaran türü, yüksek potasyum depolarizasyonu, elektrik stimülasyonu veya optogenetik kullanarak canlı bir preparatta vezikül döngüsünü optik olarak izleyebilmenizdir.

Bu prosedür için, diseksiyon yapan saline bir lexoflor 647'ye konjuge edilmiş anti-HRP antikorunu ekleyin. Daha sonra, diseksiyon odasına elastomer kaplı bir kapak fişi ekleyin ve ardından diseksiyon sırasında NMJ presinaptik terminali etiketlemek için HRP antikoru ile diseksiyon solüsyonunu ekleyin. İnce bir boya fırçası kullanarak, gıda şişesinden dolaşan üçüncü bir yıldızı elastomer kaplı bir kapak camına aktarın.

Ardından, ağız tarafından üretilen negatif hava basıncını kullanarak bir cam mikro pipet ucunu küçük bir hacimde yapıştırıcı ile doldurun. Daha sonra, larvaları sırt tarafı yukarı bakacak şekilde forseps ile konumlandırın ve ağızdan pozitif hava basıncı kullanarak kafayı küçük bir damla yapıştırıcı ile elastomer kaplı örtü kızağına yapıştırın. Bu işlemi larvaların arka ucu ile tekrarlayın ve hayvanın iki tutkal eki arasında gergin bir şekilde gerildiğinden emin olun.

Makas kullanarak, sırtta bir milimetre yatay kesim ve sırt orta hattı boyunca dikey kesim yapın. Ardından kas sistemini kaplayan dorsal trakea, bağırsak, yağ gövdesi ve diğer iç organları nazikçe çıkarın. Dört gövde duvarı kanadı için yapıştırma prosedürünü tekrarlayın ve gövdeyi hem yatay hem de dikey olarak nazikçe gerdiğinizden emin olun.

Daha sonra VNC'yi kaldırın ve makasla motor sinirlerini dikkatlice kesin ve VNC'yi tamamen çıkarın. SV döngüsünü durdurmak için diseksiyon salinini kalsiyum içermeyen salin ile değiştirin. Elektriksel stimülasyon için, gerekli konik ve uç boyutunu elde etmek için mikroelektrot çektirmesini kullanarak bir emme pipeti hazırlayın.

Daha sonra, tek bir motor sinirini emerken sıkı bir uyum sağlamak için mikroelektrot ucunu bir mikro dövme ile ateşle parlatın. Emme pipetini, uzun, esnek bir plastik tüpe ve bir şırıngaya bağlı bir mikromanipülatör üzerindeki elektrot tutucusuna kaydırın. Daha sonra, FM boya ile preparasyonu mikroskop aşamasına koyun ve larvalar ve emme pipeti odaklanana kadar sahneyi kaldırın.

Daha sonra, şırınga tarafından emme elektroduna üretilen negatif hava basıncı ile seçilen hemi segmentini innerve ederek bir kesme motor siniri halkasını emdirin. Daha sonra, SV endositozunu ve FM 143 boya alımını sağlamak için seçilen parametreleri kullanarak motor siniri uyarın. Prosedürün bu noktasındaki en kritik adım, tek bir motor aksonunu emme elektroduna sıkı bir şekilde emmektir.

Bu biraz deneme yanılma gerektirebilir. Yeterli bir emme elektrodu bulunduğunda, tutarlı bir stimülasyon gerilimi sağlamak için karşılaştırılan tüm koşullar için aynı olanı kullanın. FM boya boşaltma için, aynı motor siniri aynı elektroda emdirin ve ardından SV ekzositozunu ve FM 143 boya salınımını aktive etmek için motor siniri uyarın.

Channelrhodopsin stimülasyonu için, bir koaksiyel kablo kullanarak programlanabilir bir stimülatöre mavi bir LED takın ve LED'i kamera bağlantı noktasına yerleştirin. Mikroskop yakınlaştırma işlevini kullanarak mavi LED ışık huzmesini FM boyası ile preparat üzerine odaklayın. Prosedürdeki noktadaki en kritik adım, LED ayarlarının sabit tutulduğundan ve tutarlı bir stimülasyon zorlanması sağlamak için tüm koşullar karşılaştırıldığında her hayvanın aynı bölümünü aydınlattığınızdan emin olmaktır.

Işık stimülasyonunu başlatın ve optogenetik stimülasyon süresinin önceden belirlenmiş süresi boyunca zamanlayıcı ile takip edin. Zamanlayıcı durduğunda, FM boya solüsyonunu hızlı bir şekilde çıkarın ve SV döngüsünü durdurmak için kalsiyum içermeyen tuzlu su ile değiştirin. FM boya boşaltma işleminden sonra, ışık stimülasyonunu başlatın ve optogenetik stimülasyon süresinin önceden belirlenmiş süresi boyunca bir zamanlayıcı ile takip edin.

Zamanlayıcı süresi sona erdiğinde, FM boya solüsyonunu hızlı bir şekilde çıkarın ve SV döngüsünü durdurmak için kalsiyum içermeyen tuzlu su ile yerleştirin. Floresan görüntüyü ölçmek için, görüntüyü J'ye yükleyin ve Görüntü, Yığınlar, Zproject'e tıklayarak maksimum yoğunluk projeksiyonu oluşturun, ardından anti-HRP 647 kanalını kullanarak Görüntü, Ayarla, Eşik'e gidin ve yalnızca NMJ vurgulanana kadar üst araç çubuğunu kaydırın. Değnek aracını kullanarak NMJ'ye tıklayın.

NMJ süreksizse, shift düğmesini basılı tutun ve tüm parçaları seçin. Ardından görüntüyü FM 143 boya kanalına değiştirin ve floresan ölçümünü elde etmek için Analiz Et, Ölç'e gidin. Aynı NMJ'den kaldırılan görüntü için bu adımları tekrarlayın.

Floresan FM 143, TEM yoluyla görselleştirme için oksitlenmiş bir DAB elektron yoğun çökeltiye fotodönüştürülebilir. Aktiviteye bağlı FM 143 boya yüklemesini takiben drosophila NMJ'yi etiketlemek için fotoğraf dönüştürme yönteminin şematik bir diyagramı aşağıda verilmiştir. Bu, tekdüze boyutlu SV'lerin yoğun bir popülasyonunu gösteren, dinlenme halindeki vahşi tip bir sinaptik bouton'un temsili bir TEM görüntüsüdür.

Bu görüntüler, fotokonversiyon olmadan veya FM 143 fotokonversiyon ile beş dakika boyunca yüksek potasyum salin depolarizasyonu ile uyarılan sinaptik butonları göstermektedir. Toplu uç homo yapıları burada gözlemlenebilir. Ve bu görüntüler, sinir emme elektrodu ile 20 hertz'de beş dakika boyunca fotokonversiyon olmadan veya FM 143 fotokonversiyon ile elektriksel olarak uyarılan sinaptik butonları gösteriyor.

Boya yüklü veziküllerin, bitişik yüksüz veziküllerden çok daha koyu göründüğüne dikkat edin. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek potasyum depolarizasyonu, elektrik stimülasyonu ve optogenetik channelrhodopsin stimülasyonu kullanılarak larva tutkal diseksiyonunun yanı sıra FM boya yükleme ve boşaltma işleminin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız. FM boyaları ilk olarak Fei-Mao tarafından sentezlendiğinden, bu çok yönlü boyalar, klatrin aracılı endositoz arasındaki farkı incelemek ve ayrıca uyarılmış, spontan ve minyatür sinaptik aktiviteleri incelemek için farklı vezikül havuzlarının aktiviteye bağlı mobilizasyonunu incelemek için kullanılmıştır.

Bu deney boyunca dikkate alınması gereken birçok faktör vardır. Birkaçını saymak gerekirse, harici kalsiyum konsantrasyonu, kullandığınız stimülasyon yönteminin türü ve ayrıca alma ve bırakma adımları sırasında FM boyasının ne kadar süreyle yüklenip boşaltılacağı. Lütfen kendi denemenizi planlarken bu faktörleri dikkatli bir şekilde göz önünde bulundurun.

İyi şanslar!