Yüksek Çözünürlüklü X-Işını Absorpsiyon Spektroskopisi Kullanılarak Kriyojenik Sıcaklıkta Türleşme için Biyolojik Numunelerin Hazırlanması

Bu protokol, hücresel örnekler için standartlaştırılmıştır ve farklı senkrotron konumlarında çalışan deneylerin karşılaştırılmasına izin verilmiştir. Bu tekniğin temel avantajı, numunenin kimyasal entegrasyonunun hızlı ve güvenilir bir şekilde korunmasını sağlayan basit ve anlaşılır bir iş akışıdır. Bu teknikte yeni olan bireyler, dondurulmuş yinelenmiş hücrelerin peletlenmesi ve hücresel peletin kriyonumune düzenine hızlı yüklenmesi ile mücadele edebilir.

Kriyojenik sıcaklıkta bir numunenin bağlantısının kesin ve hızlı bir şekilde kesilmesi çok önemlidir. Bu nedenle, görsel bir gösterim, tekniğin nasıl uygulanacağını anlamak için çok önemlidir. Selenyum türleşmesi için insan prostat ve yumurtalık kanseri hücre hattı hücre peletlerini hazırlamak için, her hücre hattından uygun sayıda hücreyi, laminer bir akış başlığında uygun hücre kültürü ortamında koşul başına üç T-75 şişesine tohumlayın ve şişeleri% 80 birleşene kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Kanser hücrelerini selenyum tedavisine maruz bırakmak için, selenyum nanopartikül çözeltisini tam hücre kültürü ortamında uygun çalışma konsantrasyonlarına seri olarak seyreltmeden önce, önce oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir ultrason su banyosunda taze hazırlanmış nanopartikül stok çözeltilerini sonikleştirin. Laminer akış başlığında, hücreleri yıkama başına beş mililitre 37 santigrat derece PBS ile iki kez nazikçe yıkayın ve şişenin dibine 15 mililitre selenyum muamelesinin 15 mililitresini dikkatlice eklemek için steril bir 25 mililitre pipet kullanın. Şişeyi tamamen kapatmadan kapakları kapatın ve şişeleri 24 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yatay olarak yerleştirin.

Kültür ortamını yıkadıktan ve yeniledikten sonra hücre peletlerini hazırlamak için, hücreleri nazikçe ayırmak için şişe başına bir hücre kazıyıcı kullanın. Şişeye yapışmış hücreleri süpernatantın içine yıkamak ve ayrışmış hücreleri santrifüjleme yoluyla toplamak için orta kullanın. Tedavinin kalan tüm izlerini gidermek ve hücreleri bir mililitre PBS'de yeniden askıya almak için peletleri yıkama başına tüp başına beş mililitre PBS'de iki kez yıkayın.

Hücreleri 1.5 mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın ve hücreleri başka bir santrifüjleme ile toplayın. Ardından, tüm süpernatantı nazikçe çıkarmak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve her 1,5 mililitrelik tüpün alt kısmını hücre peleti seviyesine kadar sıvı azota batırın. Dondurulduktan hemen sonra, tüpleri uzun süreli depolama için sıvı azot dewarına aktarın.

Yüksek çözünürlüklü x-ışını absorpsiyon spektroskopisi için, Bragg koşullarındaki kristal analizörü spektrometresindeki tüm kristalleri, ilgilenilen floresan hattı enerjisine göre optimize edin ve gelen monokromatik ışın enerjisini kalibre etmek için absorpsiyon kenarının enerji konumunun bilindiği bir referans kullanın. Numune tutucuyu biyolojik numuneler için sıvı helyum kriyostata aktarın ve kriyostatı 10 derece Kelvin'e ayarlayın, ardından senkrotron güvenlik kurallarını izleyerek deneysel kulübeyi kapatın ve analize başlayın. Burada, selenyumun başlangıç durumundaki ve besleyici ortama inkübe edilen hücrelerdeki temsili yüksek çözünürlüklü x-ışını absorpsiyon spektroskopisi spektrumları, ilk selenyum nanopartiküllerindeki selenyumun hem selenyum sıfır hem de selülit benzeri formlar olarak mevcut olduğunu göstermektedir.

Bununla birlikte, PC3 hücreleri ile etkileşimlerden sonra, selenyum esas olarak hücrelerde selenyum sıfır olarak mevcuttu ve bu da hücrelerdeki selenyum türlerinin değiştiğini gösterdi. Demir için, yüksek çözünürlüklü x-ışını absorpsiyon spektroskopisi referans spektrumları, demir oksidasyon durumuna bağlı olarak farklı kenar konumları sergiler ve azaltılmış demir türleri düşük enerji değerlerine kaydırılır. Bir diatom peletinin aynı pozisyonunda toplanan iki ardışık spektrum benzerdi, bu da 10 Kelvin'de bir helyum kriyostat kullanıldığında ışın hasarının iki kazanım arasında sınırlı olduğunu gösteriyordu.

Ayrıca, diyatom peletinin farklı konumlarından gelen spektrumlar aynıydı, bu da numune peletinin homojen olduğunu ve spektrumların daha iyi bir sinyal-gürültü oranı spektrumu elde etmek için ortalamasının alınabileceğini gösterdi. En kritik adımlar, nanopartikül diltüyonunun hazırlanması, kriyojenik sıcaklıkta peletleme ve standart referans numunelerin hazırlanmasıdır. Bu prosedür, ICP-MS veya HPLC-ICP-MS gibi diğer toplu analitik tekniklere veya kriyojenik sıcaklıkta gerçekleştirilebilen diğer senkrotron olmayan spektroskopik tekniklere uygulanabilir.

Diğer bilimsel sorular, özellikle biyojeoloji, biyokimya ve çevre bilimleri veya toksikoloji araştırmaları alanlarında bu prosedür kullanılarak araştırılabilir. Selenyum bileşikleri ve selenyum nanopartikülleri sağlığınız için zor olabilir ve eldivenler, gözlükler ve yüz maskesi kullanılarak özel bir kimyasal başlıkta manipüle edilmelidir.