Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

ChIP-exo yöntemimizin ana avantajı, geleneksel kromatin immünopresipitasyon yöntemine kıyasla hücredeki protein DNA etkileşimlerinin geliştirilmiş haritalama çözünürlüğüdür. ChIP için protein G manyetik boncukları hazırlamak için manyetik boncukları homojen olana kadar karıştırın. Daha sonra iki mililitrelik protein düşük bağlama tüpüne 25 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin.

Boncuklara bir mililitre engelleme çözeltisi ekleyin. Pipetleyerek iyice karıştırın, ardından tüpü bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Süpernatan temizlendikten sonra çıkarın.

Daha sonra, boncuklara bir mililitre engelleme çözeltisi ekleyin. Tüpü dört santigrat derecede sallanan bir platforma yerleştirin ve 10 dakika sallayın, ardından tüpü kısaca döndürün. Tüpü manyetik rafa yerleştirin ve süpernatanı çıkarın.

Manyetik boncuklara 500 mikrolitre engelleme çözeltisi ekleyin. Antikoru Adacık-1'e karşı kısaca döndürün, ardından manyetik boncukları içeren tüpe dört mikrogram antikor ekleyin. Manyetik boncuklar ve Adacık-1 antikoru içeren tüpü dört santigrat derecede sallanan bir platforma yerleştirin ve altı ila 24 saat boyunca sallayın.

Kromatin immünopresipitasyonuna başlamak için, antikor kaplı boncukları bir mililitre bloke edici solüsyonda yıkayın. Antikor kaplı boncukları içeren tüpü beş dakika boyunca dört santigrat derecede sallanan bir platforma yerleştirin. Kısa bir süre döndürdükten sonra, tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı çıkarın.

Antikor kaplı boncukları 50 mikrolitre bloke edici solüsyon içinde yeniden süspanse edin. Antikor kaplı boncuklara bir mililitre sonikasyonlu lizat ekleyin, ardından numuneyi gece boyunca dört santigrat derecede sallanan bir platformda inkübe edin. Numunenin gece boyunca inkübe edilmesine izin verdikten sonra, tüpü kısa bir süre döndürerek kapaktan sıvıyı toplayın, ardından tüpü manyetik bir rafa yerleştirin.

Ve bir dakika sonra, süpernatanı bir pipetle dikkatlice çıkarın. Ardından, aşağıdaki gibi bir dizi yıkama gerçekleştirin. Numuneye CPI içeren bir mililitre soğuk yıkama tamponu ekleyin.

Numuneyi beş dakika boyunca dört santigrat derecede sallanan bir platformda karıştırın. Numune tüpünü kısa bir süre döndürün, ardından manyetik bir rafa yerleştirin. Bir dakika sonra, süpernatanı bir pipetle çıkarın.

İlk enzimatik reaksiyon ve onarım ve DA kuyruğu için, numuneye 38 mikrolitre otoklavlanmış çift damıtılmış su ekleyin, ardından son hazırlık reaksiyon karışımını ve son hazırlık enzim karışımını ekleyin. Tüpün içeriğini pipetleme ile karıştırın, ardından numuneyi 20 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Ardından, numune boncuklarını daha önce açıklandığı gibi yüksek tuz yıkama tamponu, lityum klorür yıkama tamponu ve 10 milimolar Tris hidrojen klorür tamponu ile yıkayın.

İndeks adaptör ligasyonunu gerçekleştirmek için, numuneye 27 mikrolitre soğuk 10 milimolar Tris hidrojen klorür tamponu ekleyin. Ardından indeks adaptörü, ligasyon arttırıcı ve ligaz ana karışımını ekleyin. Numuneyi 20 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Yine, numune boncuklarını yüksek tuzlu yıkama tamponu, lityum klorür yıkama tamponu ve 10 milimolar Tris hidrojen klorür tamponu ile yıkayın. Daha sonra numuneye 47 mikrolitre soğuk 10 milimolar Tris hidrojen klorür tamponu ekleyin. Eksik fosfodiester bağından kaynaklanan DNA'daki çentiği onarmak için, numuneye 11.1 mikrolitre dolgu karışımı ekleyin.

Numuneyi 30 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Bir dizi yıkamadan sonra, numuneye 50 mikrolitre soğuk otoklavlanmış çift damıtılmış su ekleyin. ChIP DNA'sını beş asal ila üç asal yönde sindirmek için lambda eksonükleaz tamponu ve lambda eksonükleaz ekleyin ve numuneyi pipetleme ile karıştırın.

Numuneyi 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Sindirim tamamlandıktan sonra, üç yıkamayı son bir kez tekrarlayın. Boncuklardan ChIP numunesini çıkarmak için, numuneyi 75 mikrolitre ChIP elüsyon tamponu ve inkübatörde 65 santigrat derecede 15 dakika boyunca 130 kez G'de yeniden süspanse edin.

Numuneyi kısa bir süre vorteksleyin, ardından gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Numuneyi kısaca döndürün ve manyetik bir rafa yerleştirin. Bir dakika sonra, süpernatanı yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın.

DNA'yı saflaştırın ve elüte edin. Ayrıştırılmış DNA'yı saflaştırdıktan sonra, ekstrakte edilen DNA örneğinin 16 mikrolitresini bir PCR tüpüne aktarın. Numuneye 1,2 mikrolitre denatüre etme ve astar tavlama karışımı ekleyin.

El yazmasının altıncı tablosunda açıklanan programı kullanarak, şablon DNA'ya denatüre ve tavlama primerleri. Numuneye üç mikrolitre primer uzatma karışımı ekleyin ve el yazmasının yedinci tablosunda açıklanan PCR programını çalıştırın. Numuneye 4.1 mikrolitre DA atık karışımı ekleyin ve numuneyi el yazmasının sekizinci tablosundaki PCR programını kullanarak çalıştırın.

Daha sonra numuneye 21,5 mikrolitre üniversal adaptör ligasyon karışımı ekleyin ve 20 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Numuneye 29 mikrolitre LM-PCR karışımı ekleyin, ardından numuneyi el yazmasının 10. tablosundaki programı kullanarak çalıştırın. 18 döngü LM-PCR'nin ardından, fare motor nöronlarından alınan ChIP-exo örnekleri% 1.5'lik bir agaroz jeli üzerinde elektroforeze edildi.

ChIP-exo Islet-1 sonuçları, ChIP-exo kütüphanelerinin LM-PCR ile başarılı bir şekilde amplifiye edildiğini gösteren 200 ila 400 baz çifti civarında amplifiye edilmiş DNA kütüphaneleri gösterdi. 100 baz çifti etrafındaki bant, adaptörlerden ve PCR primerlerinden gelen artefaktları temsil eder. Antikor kontrolü, spesifik olmayan arka plan DNA'sının lambda eksonükleaz tedavisi ile sindirildiğini göstermektedir.

ChIP-exo ve ChIP-seq kullanılarak, Islet-1'e bağlı konumlar belirlendi. ChIP-exo sinyali, çoklu kümelenmiş Adacık-1 transkripsiyon faktörü bağlanma modellerini tespit eden Adacık-1 bağlanma bölgelerine yüksek oranda odaklandı. ChIP-seq sinyali, ChIP-exo'nun Islet-1 için ChIP-seq'ten daha yüksek eşleme çözünürlüğüne sahip olduğunu gösteren daha geniş sinyaller gösterdi.

Çoklu transkripsiyon faktörleri genellikle DNA'yı bir protein-DNA kompleksi olarak yan yana bağlar. ChIP-exo, çoklu transkripsiyon faktörlerinin hedef DNA'yı nasıl tanıdığını ve düzenlediğini incelememizi sağlar.