Overview
מקור: מעבדות של ד"ר איאן פפר וד"ר צ'ארלס גרבה - אוניברסיטת אריזונה
הפגנה סופרת: לואיזה איקנר
ספקטרום המחקר במיקרוביולוגיה סביבתית רחב בהיקפו ובפוטנציאל היישום. בין אם העבודה היא בקנה מידה ספסל עם מבודד חיידקים ידועים, או בתחום איסוף אדמה או דגימות מים המכילות מבודד חיידקים לא ידועים, היכולת להבחין במהירות ובאופן חזותי אוכלוסיות מעניינים נותרה בעלת השפעה רבה למיקרוביולוגים סביבתיים גם כיום עם שפע הטכניקות המולקולריות הזמינות לשימוש. וידאו זה מדגים טכניקה אחת כזו, המכונה כתמי גרם.
Principles
כתם גרם הוא טכניקת הכתמה קלאסית וחשובה שנותרה בשימוש נרחב על ידי מיקרוביולוגים סביבתיים. בדומה לכתם פשוט, הוא מאפשר הערכה של מורפולוגיה של תאים חיידקיים (למשל,קוצ'י, מוטות, נבגים לשעבר), גודל וסידור (למשל,שרשראות או אשכולות). בנוסף, הוא מאפשר הבחנה בין חיידקים לשתי קבוצות עקרוניות נפרדות - גרם שלילי וסבתא-חיובית - על פי הרכב ומבנה דופן התא (איור 1).
כתמי גרם הוא תהליך רב-שלבי. לפני הכתמים, מריחה חיידקית מוכנה באמצעות צלחת, שיוטה או תרבות מרק. הכנת ההכפשה מיובשת ומתוקנת על מגלשת זכוכית נקייה. כתם ראשוני של סגול קריסטל מוחל לאחר מכן על הכתם הקבוע. סגול קריסטל הוא כתם בסיסי המורכב מיונים צבעוניים טעונים חיובית(כלומר כרומופורים) היוצרים קשרים יוניים חלשים עם קבוצות פונקציונליות טעונות שליליות הנמצאות בדופן התא החיידקי. לאחר שטיפה עדינה של המגלשה במים, יוד של גרם מוחל, ויוצר מתחמים מסיסים עם סגול הגביש בדופן התא. מתחמי היוד הסגול-קריסטל נקשרים עוד יותר עם פפטידוגליקאן, מרכיב עקרוני של קירות תאי חיידקים. לאחר שטיפה שנייה במים, חומר צביעה מוחל בקצרה על הכתם. עבור חיידקים גרם שלילי, קומפלקס ויוד סגול קריסטל נשטף במהלך שלב צביעה, עם חיידקים גרם חיובי שמירה על הכתם הסגול. שטיפה שלישית ואחרונה במים מלווה בכתם נגדי של ספרנין שצבע חיידקים גרם שלילי ורוד או אדום.
איור 1. השוואה של דופן התא של חיידקים גרם-חיובי ו גרם שלילי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. איסוף דוגמאות
- לאסוף דגימת קרקע ולהעביר למעבדה לניתוח מיקרוביאלי.
- במעבדה, לשקול מדגם 10 גרם באמצעות איזון אנליטי.
- לדלל את המדגם 1:10 לתוך 95 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (10 חלקים הקרקע שווה ערך 5 חלקים נוזל מימי), מערבולת לערבב(איור 2,שלב 1).
- בצע דילולים הבאים של 1:10 עד לפחות10-5 גרם אדמה למ"ל, ודילול נבחר של צלחת התפשטות בשכפולים של שניים או שלושה על מדיום אגר מיזיני נמוך(למשל,R2A)(איור 2,שלבים 2-3).
- לדגור על הצלחות במשך שבוע בטמפרטורת החדר(איור 2,שלב 4).
- בחרו מושבה אחת או שתיים לבידוד, והישארו על לוחות אגר טריים(איור 3,שלבים 1-3).
- לדגור על לוחות הפס במשך יומיים-שלושה בטמפרטורת החדר(איור 3,שלב 4).
2. הכנת מריחות חיידקיות
- שימו לב ללוחות הרצף למושבות מבודדות.
- כדי להכין כל הכנה להכתמה, טובלים לולאה מחוקנת באתנול, מעקרים להבה ומניחים 1 עד 2 לולאות של מים מזוקקים סטריליים על מרכז מגלשות זכוכית שניקו מראש.
- לחטא את לולאת החנק שוב כפי שתואר בעבר. לאחר התקררות, להסיר כמות קטנה של תרבות ממושבה מבודדת אחת ולערבב אותו עם טיפות מים על המגלשה (הכתם צריך להיות דומה חלב דל שומן מדולל). יש לקרר את לולאת החנק לפני בידוד המושבה. לולאה חמה מדי תגרום למושבה ו/או לבינונית להתיז, מה שעלול להוביל לתרסיס של חיידקים. בדרך כלל, כאשר הלולאה חמה מדי לשימוש, צליל "שורט" יישמע כאשר הוא מוחל על אגר או מושבה. קירור לא תקין של הלולאה עלול גם לגרום להעברת תרבות לשקופית יעילה פחות, ועיוות של מורפולוגיה של תאים.
- מורחים את הכתם על פני השטח של השקופית בגודל של כ-2.5 ס"מ על 2.5 ס"מ, ומאפשרים לו להתייבש באוויר. חשוב שייבוש אוויר יתרחש בתנאי זרימה למינאריים. אין לפוצץ שקופיות כדי לא לשבש את ההכפשה. כמו כן, שקופיות לא חייב להיות מיובש להבה, על מנת לשמור על מורפולוגיה התא.
- לאחר הייבוש, חום לתקן את הכתם על ידי העברת השקופית במהירות דרך להבה 2-3x. אין להחזיק את השקופית נייחת בלהבה, כדי למנוע עיוות של מורפולוגיה של תאים ו/או נזק למגלשת הזכוכית.
3. כתמי גרם
- אבטחו את השקופית בקצה אחד באמצעות סיכת כביסה נקייה.
- מכסים את הכתם עם סגול קריסטל (כתם ראשוני) ומחזיקים במשך 2 עד 3 דקות.
- לשטוף בזהירות את המגלשה עם מים מזוקקים. אין לכוון את זרם המים אל הכתם על מנת למנוע נזק ו/או ניתוק ממגלית הזכוכית.
- מכסים את הכתם ביוד של גרם ומחזיקים במשך 2 דקות, ואז שוטפים בעדינות את המגלשה במים.
- Decolorize את הכתם באמצעות 95% אתנול עד כתם כבר לא שוטף מן השקופית (זה בדרך כלל לוקח לא יותר מ 20 s בהתאם לעובי של כתם), ולאחר מכן מיד לשטוף עם מים מזוקקים. שלב זה הוא קריטי כדי למנוע צביעה יתר של השקופית, אשר עלול להוביל ייעוד כתם גרם כוזב (כלומר, משתנה גרם).
- מוסיפים את הכתם הנגדי (ספרנין) להכפשה ומחזיקים במשך 30 s. לאחר מכן יש לשטוף בעדינות את המגלשה במים מזוקקים ולייבש כתם באמצעות נייר סופג.
4. התבוננות מיקרוסקופית בשקופיות
- שים לב לשקופיות באמצעות מטרות נמוכות(למשל,פי 4 או פי 10), יבשות גבוהות(למשל,פי 40) וטבילת שמן (פי 100X). לטבילת שמן, מוסיפים את השמן ישירות למרוחה.
- לקבלת תוצאות מייצגות של חיידקי קרקע גראם-חיוביים וגרם שליליים, ראו איורים 4 ו-5 .
איור 2. טכניקת דילול וכתיבת ציפוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. בידוד המושבה באמצעות טכניקת לוח הרצף.
איור 4. חיידק קרקע גראם חיובי סטפילוקוקוס אאורוס.
איור 5. חיידק אדמה גרם שלילי Escherichia coli.
כתמי גרם מאפשרים הדמיה מהירה של מורפולוגיה חיידקית והבחנה תאית רחבה ממגוון רחב של דגימות סביבתיות. כדי להכתים חיידקים, מריחה אחידה מוחלת על צד זכוכית ומותר להתייבש. לאחר תיקון חום הכתם, סגול קריסטל מוחל.
חומר צביעה שוטף את הסגול הגבישי מתאי גרם שלילי, אך לא תאים חיוביים לגרם. צבע שני, בדרך כלל ספרנין, משמש כתם רקע כדי לדמיין את התאים גרם שלילי. לאחר הכתמתם, ניתן להעריך את התאים עבור מורפולוגיה של תאים, גודל וסידור, כגון שרשראות או אשכולות.
סרטון זה מדגים כיצד להכין דגימה סביבתית, לבודד את מיני החיידקים שנמצאו בו ולבצע כתם גרם על המושבות המבודדות
כתמי גרם מאפשרים סיווג של רוב החיידקים לשתי מחלקות מבניות רחבות: גרם חיובי וסבתא שלילית. בעוד שני המעמדות יש קרום פלזמה פוספוליפיד הבסיסי, המבנה של הקיר התאי משתנה מאוד. דופן התא החיובי גרם מורכב בעיקר משכבה עבה של peptidoglycan, שהוא פולימר המורכב סוכרים וחומצות אמינו. קירות תא גרם שלילי יש שכבה דקה יותר של peptidoglycan, תקוע בין קרום שומנים שני. קרום החיצוני הזה מכיל בדרך כלל ליפופוליסכרידים.
סגול הגביש הטעון לחיוב נקשר חלש לקיר התא החיידקי הטעון שלילית. היוד של גרם יוצר קומפלקס בלתי מסיס עם צבע סגול קריסטל, ובכך מתקן אותו בדופן התא.
במהלך שלב הצביעה, הפפטידוגליקן בתאים החיוביים גרם מיובש, מה שגורם לו להתכווץ וללכוד את קומפלקסים סגול-יוד קריסטל. בתאים גרם שלילי, סוכן decolorizing מתפשר על הממברנה החיצונית, הגדלת נקבוביות שלה. זה מאפשר לשטוף את תסביבי היוד הסגולים הגבישיים.
עכשיו שאתם מבינים את העקרונות שמאחורי חיידקי האדמה מכתימים גרם, בואו נראה את התהליך המבוצע על חיידקי קרקע במעבדה.
לאחר איסוף דגימת קרקע בשטח, להביא אותו למעבדה לניתוח. לחדד את המדגם עם מסננת, ולשקול 10 גרם של הקרקע מסונה באמצעות איזון אנליטי.
לדלל את המדגם לתוך 95 מ"ל של תמיסת מלח פוספט-חוצץ מערבולת לערבב. בצע 1 עד 10 דילול נוספים, מערבולת בין כל דילול. מעבירים עליקוטים של לפחות 3 דילולים רצופים, על צלחות אגרוז תזונתיות נמוכות.
לאחר עיקור להבת אתנול וקירור של מוט זכוכית מכופף על ידי הקשה על התקשורת, להפיץ את המדגם על פני השטח של הצלחות. לדגור על הצלחות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה במשך 3 עד 5 ימים, בחר את הדילול הגבוה ביותר עם 30 עד 300 מושבות נפרדות. עם לולאת חנק סטרילית, בחר מושבות מעניינות לבידוד.
תרצף את המושבה על חלק אחד של צלחת טרייה. עיקור הלולאה בין פסים, לעשות פסים רצופים בתבנית זיג-זג על כל קטע של הצלחת כדי לאפשר בידוד מאוחר יותר של מושבות בודדות נפרדות. לדגור על הצלחות במשך 1 עד 2 ימים בטמפרטורת החדר.
כדי להתחיל בהכנת מריחות חיידקיות, חברו קליפ למגלשת זכוכית שנוקתה מראש כדי להקל על הטיפול. עבור כל מריחה חיידקית, יש לנקות ולחטא לולאה מחנק. מניחים 2 לולאות של מים מזוקקים סטריליים על מרכז המגלשה.
לאחר עיקור הלולאה שוב, להסיר כמות קטנה של תרבות ממושבה מבודדת, ולערבב עם המים על המגלשה. חשוב לקרר את הלולאה לפני נגיעה בתרבות על ידי הקשה על חלק לא מסונן של אגר מספר פעמים. ההכפשה צריכה להיות דומה לחלב מדולל. אפשר למגלשה להתייבש בטמפרטורת החדר. לאחר הייבוש, חום לתקן את הכתם על ידי העברתו במהירות דרך להבה.
לאחר יבש, פיפטה קריסטל סגול על ההכפשה, ולתת לשבת במשך 2 - 3 דקות. לשטוף בזהירות את המגלשה עם מים מזוקקים על ידי מכוון הזרימה הישירה לכיוון החלק העליון של המגלשה, ומאפשר למים לזרום בעדינות למטה. אין לכוון את זרימת המים ישירות אל ההכפשה.
כסה את השקופית עם היוד של סבתא. לאחר 2 דקות, יש לשטוף בעדינות במים מזוקקים. להפוך את השקופית עם 95% אתנול עד כתם כבר לא לשטוף משם. יש לשטוף מיד במים מזוקקים. פעולה זו תגביל את צביעת יתר של הכתם.
מוסיפים ספרנין ככתם נגדי להכתמה במשך 30 s. זה יכתים את כל התאים גרם שלילי נוכח. יש לשטוף בעדינות במים מזוקקים ולייבש בנייר סופג. שים לב לשקופית המתקבלת באמצעות מיקרוסקופ. השתמש תחילה במטרה בעלת הספק נמוך כדי לבצע התאמות גסות ולמצוא חלק אידיאלי מההכפשה לפני שתעבור לשדה התצוגות הקטן יותר של ההגדלות הגבוהות יותר.
לאחר הדמיה נוספת והתאמת הכתם עם מטרת הספק בינוני, מוסיפים שמן טבילה ישירות למכתם. השמן נחוץ למטרות הספק גבוה שיספקו את המיקרוגרפים הטובים ביותר. חיידקים גראם חיוביים יופיעו כחולים או סגולים בצבע, בעוד תאים גרם שלילי יהיה אדום או ורוד. בנוסף למבנה דופן התא, הצורה וההסדר מנוכרים מהמיקרוגרפים המתקבלים.
היכולת של כתמי גרם לחקור חיידקים באופן איכותי חשובה למגוון רחב של תחומים מדעיים.
אדמה היא רק אחד המקורות הסביבתיים שמהם ניתן לבודד ולנתח חיידקים. עבור מי שתייה, יש לשנות את הכנת הדגימה. דגימות של מי ברז ניתן ללגום מברז, מצופה על מדיה צמיחה המאפשרת את הצמיחה של מושבות חיידקים מגוונות, הטרוטרופיות. עם ציפוי על מדיום כגון R2A, התהליך כמעט זהה להליך הקרקע.
עבור טכניקות זיהוי חיידקיות מסוימות, הפרמטרים תלויים בסוג דופן התא של החיידקים בעלי העניין. בדוגמה זו, נבדק דם של חולה ספיגה ונמצא כי הוא מעניק מחסה לחיידקים חיוביים לגרם.
עם מידע זה, נבחרו בדיקות חומצת גרעין פפטיד ספציפיות למינים שייקשרו ל- rRNA של התאים. בדיקות אלה היו קשורות צבעים פלואורסצנטיים ששימשו לזיהוי המינים הנוכחיים.
בגלל ההבדלים הבסיסיים במבנה התאי גראם חיובי ושלילי, לחיידקים יש תגובות ייחודיות לתרכובות אחרות מלבד סגול קריסטל. ניסוי זה ביקש לבודד את קלוסטרידיום דיפיציל, חיידק גרם חיובי, מדגימות צואה. ציקלוזרין, אשר מעכב את הצמיחה של תאים גרם שלילי, נוספה צלחת אגר. התאים החיוביים גרם שגדלו על הלוח היו מבודדים עוד יותר באמצעות שיטות אחרות.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לגראם מכתים ללימודי סביבה. עכשיו אתה צריך להבין את היתרונות של התהליך וכיצד לבצע את הטכניקה ולהשתמש בתוצאות. תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
כתם גרם משמש בתת-תחומים רבים של מיקרוביולוגיה סביבתית וקלינית. מדענים באיכות מים עשויים להשתמש בכתם גרם ככלי מאשר לגילוי חיידקים צואתיים בדגימות מים. מבודדים חיידקיים מקרקע מוכתמים גרם על מנת לאפיין עוד יותר קהילות קרקע פולחניות. עבור מיקרוביולוגים סביבתיים, כתם גרם מסייע בסיווג של אוכלוסיות חיידקים על פי מבנה דופן התא. זה, בתורו, מספק מידע על היכולת הכללית של קהילה מיקרוביאלית נתונה לעמוד בפני ייבוש ולחצים סביבתיים אחרים. הידע של כיתורי כתמי גרם הוא גם בעל חשיבות במחקר ופיתוח של חיטוי ומיקרוביאלים אחרים, כמו חיידקים גראם חיובי נוטים להיות עמידים יותר בפני אי-פעילות על ידי כימיה מסוימת מאשר חיידקים גרם שלילי.
עבור יישומי מיקרוביולוגיה קלינית, כתם גרם משמש כדי לאשר את זהותם של סוכני מחלות בקטריולוגיות יחד עם שיטות אבחון מסורתיות. זה גם של סיוע רב כאשר פולחן נכשל, או לא אופציה. כתמי גרם של דגימות קליניות יכול לחשוף את נוכחותם של סוכנים אטיולוגיים כי ייתכן שלא נצפו אחרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
