Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education Library
Analytical Chemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

(紫外-可见) 的紫外-可见光谱法
 

(紫外-可见) 的紫外-可见光谱法

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

紫外-可见,或紫外-可见光谱法是最受欢迎的分析技术,在实验室之一。

在紫外-可见光谱,光通过样品在特定波长的紫外或可见光谱。如果样品吸收一些光,并不是所有的光线将通过,或传输。传输与入射光的透射光的强度之比和吸光度密切相关。吸光度可以以定量的方式,用于获得样品的浓度。它也可以以定性的方式,用来识别一种化合物称为吸收光谱对已发布数据的波长范围内匹配测得的吸光度。这个视频将介绍紫外-可见光谱和论证在实验室中测定样品的浓度和反应动力学中的应用。

当光子击中一种分子和被吸收时,分子从其基态提升到一个更高的能量状态中。两者之间的能量差是带隙。光子的能量必须完全匹配带隙光子被吸收的顺序。化学结构决定了带隙;因此每个分子具有独特的吸收光谱。

吸光度遵循啤酒的法,哪个国家吸光度等于摩尔衰减系数时代路径长度和浓度。摩尔的衰减系数与个别化合物吸收特定波长的光的能力有关。路径长度是指光线穿过样品,通常是为标准小试管 1 厘米的距离。啤酒的法律可以用于计算样品浓度,如果吸收率已知的或可以使用的校准曲线。

紫外-可见通常被称为通用的技术,如大多数分子吸收阳光中的紫外-可见光的波长范围。紫外范围从 100-400 毫微米和可见光谱范围从 400-700 nm 延伸。然而,大多数分光光度计不要操作在 100 — — 200 毫微米,深紫外光范围内,在这个范围内的光源却很贵。大多数的紫外-可见分光光度计使用氘灯产生光从 170 — — 375 nm 和钨丝白炽灯为可见的范围,产生光从 350-2,500 nm 的紫外线范围。

由于光源通常是一盏灯与宽广的波长范围,使用筛选器或单色器选择特定吸收波长。单色器是光的光的一种设备,空间,分离波长,然后将出射狭缝放置所需的波长在哪里。单色器可以在一个波长范围,以提供整个的吸收光谱扫描。这使得这项技术对于量化和识别的分子种类繁多非常有用。

既然概述了紫外-可见光谱的基本知识,让我们看看一个简单的紫外-可见实验在实验室里。

之前开始测量,分光光度计,打开,允许灯,以适当的一段时间,以稳定他们热身。

备清洁试管装满样品溶剂,一片空白,然后擦去外面起毛的纸来删除任何指纹。

确保试管正确对齐与任何槽边从梁路径,并将其插入到分光光度计。安全盖,防止光线进入系统。

测量在一个波长,或在一个波长范围内的空白吸光度。记录或保存吸光度,因为它必须减去样品的吸光度。

接下来,放弃了空白并冲洗两次与样本试管。然后,填写关于 ¾ 满样本试管。擦去外面的试管再一次,以确保它是清洁和畅通的指纹。

将试管放在正确的方向,分光光度计和安全盖。

收集作为空白吸光度测量或在同一波长或波长范围的频谱。减去空白频谱或测量,如果仪器没有自动这样做。

从收集的吸收光谱,确定吸光度最大值,或 λ最大。

以量化的抽样分析物的量,请创建使用一系列已知的分析物浓度的校准曲线。有关如何构建和使用的校准曲线的更多信息,请观看此集合的视频的"校准曲线"。

吸光度测量也可以用于计算反应动力学测定增加或减少整个反应的化合物浓度。开始采取样品,初始阅读时吸光度最大反应前后的在这种情况下,蓝色染料。

接下来,快速添加试剂,在此情况下,开始化学反应漂白。搅拌均匀,所以,它混合了与样品。

随着时间的推移测量吸光度最大处的吸光度。

所示的蓝色染料样品初始吸收光谱。背景颜色显示在可见光谱的光的颜色。蓝色染料有吸光度最大值在约 630 nm。

随着时间的推移,测定了蓝色染料和漂白剂之间反应的动力学。蓝染料的吸光度随时间的推移,它的反应与漂白剂。吸光度达到接近于零后 300 s,指示反应已接近完成。对动力学和反应的详细信息,请看朱庇特科学教育视频"反应速率定律"。

在许多不同的研究领域中大量使用紫外-可见光谱识别或量化的样本。

例如,紫外-可见光谱用于大量生物领域量化样品中蛋白质的量。布拉德福德测定常用来量化蛋白质,借助一种染料。首先,准备好了已知的蛋白质浓度的校准曲线,通常使用牛血清白蛋白或牛血清白蛋白。然后考马斯亮蓝染色被添加到每个标准和样品。吸收的蛋白质染料复杂然后测量在 595 nm。

或者,可以直接由他们 280 处的吸光度测量蛋白质毫微米。在此示例中,蛋白质浓度被量化用超低容量分光光度计。对于许多蛋白质,浓度为 1 毫克/毫升 1 相关因素的吸光度。

紫外-可见光谱还用于确定细胞培养液中的细菌细胞的数量。这种测量方法、 吸光度,或光密度,衡量在 600 毫微米。通常情况下,1 OD600测量指示 8 x 108每毫升细菌细胞的存在。整个文化生长的细胞密度测量使细菌的生长曲线,测定和可有助于确定当一种文化是在其呈指数级增长阶段。

一氧化氮和二氧化氮或没有x,是汽车尾气的副产品,可以是对环境有害的因为它形成破坏性的对流层臭氧。没有x可测定反应它与对氨基苯磺酸酸和观察其乙二胺的溶液。最终的解决方案是粉红色色偶氮类染料分子,其中强度直接与 NOx浓度相关。然后可以使用紫外可见分光光度计确定此浓度。

你刚看了紫外-可见光谱的朱庇特的简介。现在,您应该了解紫外-可见操作、 如何衡量使用紫外-可见的示例以及如何关联到样品浓度的吸光度基本的知识。

谢谢观赏 !

Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter