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Spectroscopie ultraviolet-Visible (UV-Vis)

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Spectroscopie ultraviolet-visible ou UV-visible, est l’une des techniques analytiques plus populaires dans le laboratoire.

En spectroscopie UV-Vis, lumière passe à travers un échantillon à une longueur d’onde spécifique dans l’UV ou le spectre visible. Si l’échantillon absorbe une partie de la lumière, pas tous de la lumière sera passer à travers, ou être transmis. Transmission est le rapport entre l’intensité de la lumière transmise à la lumière incidente et est corrélée à l’absorbance. L’absorption peut être utilisée de manière quantitative, pour obtenir la concentration d’un échantillon. Il peut être également utilisé de manière qualitative, afin d’identifier un composé en faisant correspondre l’absorbance mesurée sur une plage de longueurs d’onde, appelé le spectre d’absorbance, aux données publiées. Cette vidéo présentera la spectroscopie UV-Vis et son utilisation en laboratoire pour déterminer l’échantillon concentration et réaction cinétique.

Quand un photon frappe une molécule et est absorbé, la molécule est promue de son état fondamental dans un état d’énergie plus élevé. La différence d’énergie entre les deux est la bande interdite. L’énergie du photon doit correspondre exactement à la bande interdite dans l’ordre pour le photon à absorber. La structure chimique détermine la bande interdite ; C’est pourquoi molécules chaque ont des spectres d’absorbance unique.

Absorbance suit la Loi de Beer, laquelle absorbance États équivaut au coefficient d’atténuation molaire fois la longueur du trajet et la concentration. Le coefficient d’atténuation molaire est lié à la capacité du composé individuels d’absorber la lumière d’une longueur d’onde spécifique. Longueur du chemin se réfère à la distance parcourue par la lumière à travers l’échantillon, qui est généralement de 1 cm pour les cuves standards. Loi de Beer peut être utilisé pour calculer la concentration de l’échantillon, si la capacité d’absorption est connue, ou une courbe d’étalonnage peut être utilisée.

UV-Vis est souvent appelé une technique générale, comme la plupart des molécules absorbent la lumière dans la gamme de longueur d’onde UV-visible. La gamme UV s’étend de 100 à 400 nm et les plages du spectre visible entre 400 et 700 nm. Cependant, la plupart spectrophotomètres ne fonctionnent pas dans l’ultraviolet profond de 100 à 200 nm, car les sources lumineuses dans cette gamme sont coûteux. La plupart des spectrophotomètres UV-Vis utilisent une lampe au deutérium pour la gamme UV, qui produit de lumière de 170 – 375 nm et une lampe à incandescence de tungstène pour le domaine du visible, qui produit de lumière de 350 – 2 500 nm.

La source lumineuse étant généralement une lampe avec des gammes de grande longueur d’onde, la longueur d’onde d’absorbance spécifique est sélectionnée à l’aide de filtres ou un monochromateur. Un monochromateur est un dispositif qui sépare les longueurs d’onde de la lumière dans l’espace et puis place une fente de sortie correspondant à la longueur d’onde désirée de la lumière. Le monochromateur peut être scanné sur une plage de longueur d’onde de fournir un spectre d’absorbance ensemble. Cela rend la technique utile pour quantifier et identifier un large éventail de molécules.

Maintenant que les bases de la spectroscopie UV-Vis ont été soulignées, jetons un oeil à une simple expérience UV-Vis dans le laboratoire.

Avant de commencer la mesure, mettre sur le spectrophotomètre et laisser les lampes chauffer pendant une période appropriée pour stabiliser leur.

Préparer un blanc en remplissant une cuvette propre avec le solvant de l’échantillon et puis essuyer l’extérieur avec du papier non pelucheux pour enlever les traces de doigts.

S’assurer que la cuve est bien alignée avec toute surface rainurée sur la marche des rayons et l’insérer dans le spectrophotomètre. Fixez le couvercle pour empêcher la lumière ambiante de pénétrer dans le système.

Mesurer l’absorbance de l’essai à blanc à une longueur d’onde, ou sur une plage de longueur d’onde. Enregistrer ou sur enregistrer l’absorbance, comme elle doit être soustraite de l’absorbance de l’échantillon.

Ensuite, jeter le blanc et rincer la cuvette deux fois avec l’échantillon. Puis, remplir la cuvette sur ¾ pleine avec l’échantillon. Essuyez l’extérieur de la cuve, encore une fois, pour s’assurer qu’il est propre et exempt de traces de doigts.

Placez la cuve dans le spectrophotomètre dans le bon sens et fixez le couvercle.

Recueillir une mesure de l’absorbance ou le spectre à la même longueur d’onde ou de la plage de longueur d’onde comme le blanc. Soustraire le spectre blanc ou la mesure, si l’instrument ne le font pas automatiquement.

À partir du spectre d’absorbance collectées, déterminer l’absorbance maximum ou λmax.

Afin de quantifier la quantité d’analyte dans l’échantillon, créer une courbe d’étalonnage à l’aide d’une fourchette de concentrations d’analyte connues. Pour plus d’informations sur la façon de construire et d’utiliser une courbe d’étalonnage, regardez la vidéo « courbes d’étalonnage » de cette collection.

La mesure de l’absorbance peut également être utilisée pour calculer cinétique des réactions en mesurant l’augmentation ou diminution dans une concentration de composés tout au long de la réaction. Commencez par prendre une lecture initiale de l’échantillon, bleu colorant dans ce cas, à l’absorbance maximale avant la réaction.

Ensuite, rapidement ajouter le réactif, eau de Javel dans ce cas, pour commencer la réaction chimique. Remuez bien, pour qu’il se mélange avec l’échantillon.

Mesurer l’absorbance à l’absorbance maximale dans le temps.

Le spectre d’absorbance initiale de l’échantillon de colorant bleu apparaît. Les couleurs d’arrière-plan montrent les couleurs de la lumière dans le spectre visible. Le colorant bleu a un maximum d’absorbance à environ 630 nm.

La cinétique de la réaction entre la teinture bleue et l’eau de Javel a été mesurée au fil du temps. L’absorbance du colorant bleu diminue au fil du temps, car il réagit avec l’eau de Javel. L’absorbance atteint près de zéro après 300 s, indiquant que la réaction a s’approchait d’achèvement. Pour plus d’informations sur la cinétique et les réactions, s’il vous plaît regarder le JoVE Science Education vidéo « lois de taux de réaction ».

Spectroscopie ultraviolet-visible est utilisée largement dans de nombreux domaines de recherche différentes d’identifier ou de quantifier un échantillon.

Par exemple, spectroscopie ultraviolet-visible est utilisée largement dans les domaines biologiques afin de quantifier la quantité de protéines dans un échantillon. Une analyse de Bradford est souvent utilisée pour quantifier les protéines, avec l’aide d’un colorant. Tout d’abord, une courbe d’étalonnage des concentrations de protéines connues est prêt, généralement à l’aide de l’albumine sérique Bovine, ou BSA. Ensuite, teinté de bleu de Coomassie est ajoutée à toutes les normes et à l’échantillon. L’absorbance du complexe protéine-colorant est alors mesurée à 595 nm.

Alternativement, des protéines peuvent être mesurées directement par leur absorption à 280 nm. Dans cet exemple, la concentration de protéines est quantifiée à l’aide d’un spectrophotomètre à ultra bas volume. Pour beaucoup de protéines, une absorbance de 1 correspond à une concentration de 1 mg/mL.

Spectroscopie ultraviolet-visible est également utilisée pour quantifier la quantité de cellules bactériennes dans une culture cellulaire. Pour cette mesure, l’absorbance ou densité optique, est mesurée à 600 nm. En règle générale, une mesure de600 OD 1 indique la présence de 8 x 108 bactéries / mL. Mesure de la densité cellulaire durant toute la croissance de la culture permet la détermination de la courbe de croissance bactérienne et peut aider à identifier lorsqu’une culture est dans sa phase de croissance exponentielle.

L’oxyde d’azote et dioxyde d’azote ou NOx, est un sous-produit des gaz d’échappement automobile et peut être nocifs pour l’environnement parce qu’il forme l’ozone troposphérique néfaste. PAS dex peut être mesurée par la réaction avec une solution d’acide sulfanilique et naphtyl-éthylènediamine. La solution obtenue est une molécule de rose couleur azo dye, dont l’intensité est directement corrélée à la concentration de NOx . Cette concentration peut ensuite être déterminée à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis.

Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à la spectroscopie UV-visible. Vous devez maintenant comprendre les bases de fonctionnement UV-Vis, comment mesurer un échantillon à l’aide d’un UV-Vis et de corréler l’absorbance à la concentration de l’échantillon.

Merci de regarder !

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