Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Analytical Chemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

הכנה לדוגמה לאפיון אנליטי
 
Click here for the English version

הכנה לדוגמה לאפיון אנליטי

Overview

מקור: המעבדה של ד"ר .B ג'יל וטון - אוניברסיטת וירג'יניה

הכנת מדגם היא האופן שבו מדגם מטופל כדי להתכונן לניתוח. הכנת מדגם זהירה היא קריטית בכימיה אנליטית כדי ליצור במדויק מדגם סטנדרטי או לא ידוע למדידה כימית. שגיאות בשיטות כימיה אנליטית מסווגות כאקראיות או שיטתיות. שגיאות אקראיות הן שגיאות עקב שינוי ולעתים קרובות הן נובעות מרעש במכשיר. שגיאות שיטתיות נובעות מהחוקר או מהטיה אינסטרומנטלית, המציגה קיזוז בערך הנמדד. שגיאות בהכנת המדגם הן שגיאות שיטתיות, אשר יתפשטו באמצעות ניתוח, גרימת אי ודאות או אי דיוקים באמצעות עקומות כיול לא נאותות. שגיאות שיטתיות ניתן לבטל באמצעות הכנת מדגם נכונה ושימוש נכון של המכשיר. הכנה מדגם לקוי יכול גם לפעמים לגרום נזק למכשיר.

Principles

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כדי להפוך את הפתרון, יש לשקול את המסיסות של החומר הנמדד. תרכובת העניין חייבת להתמוסס בממס על מנת להפוך פתרון. מסיסות היא גורם של אינטראקציות בין מולקולריות של הניתוח עם הממס, לעתים קרובות ניתן לתמרן על ידי שינוי סוג הממס או ה- pH.

הצעד הראשון ביצירת מדגם הוא בחירת כלי זכוכית מתאימים ויצירת פתרון. רוב הדגימות בשלב הנוזלי נעשות בבקבוקונים נפחיים. צלוחיות נפח עשויות להכיל נפח מסוים של נוזל בטמפרטורה נתונה (בדרך כלל 20 °C (20 °F), והם מכוילים להיות מדויקים פחות מ 0.02% אם הם כלי זכוכית מסוג A. צלוחיות נפחיות מדויקות הרבה יותר למדידת נוזלים מאשר צילינדרים מדורגים.

כדי ליצור פתרון של מוצק, מוצק חייב להיות תחילה מסה מדויקת עם קנה מידה מכויל. עם זאת, המסה של כמה ריאגנטים ומשקעים יכול להשתנות כי הם מים היגרוסקופיים ספיחות. אם ריאגנט יש מים ספיחות אי אפשר להשתמש במשקל המולקולרי שאינו hydrated כדי להשיג את המספר הנכון של שומות. כדי להסיר מים ספיחה, מוצקים כי הם יציבים תרמית מיובשים בתנור ב ~ 110 °C (50 °F). ריאגנטים מוצקים ומשקעים מאוחסנים לאחר מכן בחיטוי המכיל חיטוי שנופח כל מים הקיימים.

אם המדגם להיות מדולל הוא נוזל פיפטה משמש בדרך כלל כדי למדוד אותו. פיפטה העברת זכוכית מכויל בדרך כלל כדי לספק נפח מדויק אחד ואת הירידה האחרונה נשארת בפיפטה ולא צריך להיות פוצץ. על פיפטת מדידה יהיו סימונים מרובים — בדומה לבורט והיא פחות מדויקת אך רב-תכליתית יותר מפיפטת העברה. ניתן למדוד נפחים קטנים יותר באמצעות מיקרופיפטרים משתנים, עם טיפים חד פעמיים מפלסטיק, ואלה זמינים בנפחים של 1-5,000 μL. יש לכייל מיקרופיפטרים כל 6 חודשים כדי שיוכלו לשמור על דיוק. אם פלסטיק הוא בעיה, מיקרו-מזרקים קטנים יכולים לשמש גם למדידת נפחים בטווח המיקרוליטר.

לאחר פתרון נעשה ישנם אלמנטים אחרים של הכנת מדגם שעשויים להיות רלוונטיים. כל דגימה עם מוצק שנותר בנוזל צריך להיות מסונן. סינון מסורתי משתמש בהתקנה עם נייר סינון היושב במשפך זכוכית על גבי בקבוקון מסנן עם זרוע שבה ניתן למשוך ואקום. סוג זה של סינון משמש לאיסוף משקעים בניסויים כגון ניתוח כבידתי. דגימות קטנות יותר שיש לנתח ניתן לנקות באמצעות סינון מזרק שבו המדגם נטען במזרק ולאחר מכן עבר דרך מסנן פולימר עם רזולוציה של עד 0.2 ננומטר. בנוסף, מסנני ספין זמינים כאשר המדגם נטען בצינור microcentrifuge עם מסנן, הצינור ממוקם צנטריפוגה, ואת הנוזל המסונן הוא בתחתית לאחר צנטריפוגה. מסנני ספין משמשים גם לרכז ניתוחים גדולים יותר, כגון חלבונים. מסנני מזרק וסיבוב שימושיים לסינון מזהמים ומוצקים אחרים שעלולים להפריע למכשיר או למדידה. סוג הסינון המשמש תלוי בכמות המדגם ובגודל המוצק שיש לסנן.

הכנת מדגם יכולה גם לכלול חילוץ או מראש של מדגם. בעת לימוד יונים מתכת, כלציה יכולה לשמש לחילוץ סלקטיבי. יונים מתכת יהיה להיקשר לסוכן כלאט ולאחר מכן מתחם כלאט ניתן לחלץ. סוכני מיסוך משמשים לפני כלציה כדי לקשור יון מתכת מסוים אשר לאחר מכן לא כלאט על ידי סוכן כלאט. תגובה כימית demasking משמשת כדי לשחרר את יון המתכת הספציפי בחזרה בתמיסה. מיסוך מאפשר הכנה ספציפית יותר מדגם והגנה של יונים מתכת מסוימים.

מסיסות היא כמות החומר שיתמוסס בנוזל. בדרך כלל, אם פחות מ 0.1 גרם יתמוסס ב 100 מ"ל של ממס חומר נחשב מסיס. מסיסות תלויה באינטראקציות בין-מולקולריות עם הניתוח ולכן, הכלל הכללי במסיסות הוא "כמו מתמוסס כמו". חומרים קוטביים נוטים להתמוסס היטב בממסים בקטבים בעוד ניתוחים לא קוטביים מתמוססים היטב בממסים לא קוטביים. מסיסות של מוצקים בנוזל היא בדרך כלל גדולה יותר בטמפרטורות גבוהות יותר, בגלל תוספת האנרגיה והתנועה המולקולרית.

כלציה מושגת על ידי ליגנדים רב-תכליתיים שיש להם אתרי כריכה מרובים עבור מולקולה. סוכן הכלה הנפוץ ביותר עבור יונים מתכת הוא חומצה אתילנדימינטטראקטית (EDTA), שהיא hexadentate ונקשרת באמצעות 2 חנקן ו -4 אטומי חמצן. יש לו 6 פרוטונים חומציים שהוא יכול לאבד על היווצרות קומפלקס מתכת-EDTA. קבוע היווצרות כריכה הוא ספציפי pH ואת ה- pH מותאם לעתים קרובות כדי להתאים את הספציפיות של תגובת הקלאציה.

מכיוון ש- EDTA יכול להת מורכב עם מתכות רבות ושונות, יש צורך במסכה על מנת לבצע ניתוח של מתכת ספציפית. לפני התוספת של סוכן כלאט, סוכן מיסוך מתווסף כדי להגן על יון העניין מפני תגובה עם EDTA. קבוע היווצרות עבור קומפלקס סוכן מיסוך-מתכת חייב להיות גדול יותר מאשר קבוע היווצרות עבור קומפלקס מתכת EDTA, כך EDTA לא יגיב. לדוגמה, מסכות פלואוריד Al3+ ו Fe3 +. ציאניד הוא עוד סוכן מיסוך נפוץ שאינו מגיב עם Mg2 +, Ca2 +, או Pb2 + אך מגיב עם מתכות אחרות כגון Cd2 +, Hg2 +, Fe2 +, Fe3+ו- Ni+. ציאניד יכול ליצור גז רעיל ברמת pH נמוכה ולכן תמיד יש להשתמש בו בתמיסה מעל pH 11. Demasking משחרר את יון מתכת רעול פנים; לדוגמה ציאניד יכול להיות demasked על ידי תגובה כימית עם פורמלדהיד. מיסוך והפחתה מאפשרים סלקטיביות למדידת רכיבים של תערובות מורכבות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. יצירת פתרון ממוצק

  1. בחר את כלי הזכוכית הנכונים כדי להפוך את הפתרון.
  2. נקו את כלי הזכוכית ביסודיות באמצעות אמבט חומצה של 1% HCl או HNO 3 יחד עםסבון להסרת זיהומים כלשהם (אזהרת בטיחות: עם כל כפפות שימוש בחומצה חזקה, משקפי מגן וציוד מגן אישי מתאים אחר).
  3. לשטוף את כלי הזכוכית מספר פעמים עם מים מזוקקים. יבש בתנור במידת הצורך.
  4. כדי ליצור פתרון ממוצק, מסה את הכמות הנכונה של מוצק.
  5. שים את מוצק בבקבוק נפח ולאחר מכן למלא על 3/4 מלא עם ממס.
  6. מערבבים כדי להמיס את המוצק במלואו לפני מילוי הבקבוק הנפחי במלואו.
  7. מלא את הבקבוקון הנפחי לקו. המניסקוס צריך פשוט לגעת בקו המילוי. לאחר מכן הפוך את הבקבוקון מספר פעמים עם המכסה על לערבב עוד יותר במידת הצורך.

2. הכנת פתרון מנוזל

  1. בחר את כלי הזכוכית הנכונים כדי להפוך את הפתרון. כדי לספק נוזל באמצעות pipette העברה, למלא את הפיפטה לקו באמצעות נורת פיפטה.
  2. שחררו את הנוזל לתוך הבקבוקון הנפחי להכנת הפתרון. אל תפוצץ את הטיפה האחרונה.
  3. מלאו את הבקבוקון הנפחי לקו כדי שהמניסקוס ייגע בקו. מערבבים את הפתרון על ידי היפוך מספר פעמים.

3. סינון

  1. להגדרת בקבוקון מסנן, הנח פיסת נייר סינון על מסנן הזכוכית המנוזל.
  2. חבר את מסנן הזכוכית המנוזל לבקבוקון מסנן.
  3. חבר ואקום לזרוע בקבוקון המסנן. מלכודת יכולה לשמש גם כדי למנוע מכל נוזל להיכנס לוואקום.
  4. הפעל את הוואקום ויוצקים את הדגימה דרך נייר הסינון.
  5. מסננים עד לסיום אבקה יבשה. ממשיכים לייבש את הדגימה בתנור אם יש צורך במים יבשים.
  6. כדי לסנן מזרק, הוסף את הדוגמה למזרק נקי עם קצה מנעול Luer.
  7. תברג במסנן המזרק למנעול הלואר. דוחפים את הבוכנה על המזרק ואוספים את הנוזל לאחר המסנן.
  8. לקבלת מסנן ספין, יש לשטוף מראש את המסנן במים חוצצים או אולטרה-טורפים.
  9. הכנס את מסנן הסיבוב לתוך צינור microcentrifuge.
  10. טען את הדגימה על גבי המסנן וכובע הצינור.
  11. שים את הצינור לתוך צנטריפוגה, הקפד לאזן אותו כראוי עם צינור אחר בצד השני, וצנטריפוגה במשך 10-30 דקות, בהתאם לסוג של מסנן ספין.
  12. הסר את המסנן ואת הנוזל בתחתית הוא הפתרון מסונן.
  13. אם המדגם לא יכול לעבור דרך הממברנה — כגון חלבון גדול — הוא יישאר בחלק העליון של המסנן. במקרה זה, להפוך את המסנן, לשים אותו בצינור חדש, ולהסתובב שוב. זה יפיק מדגם מרוכז.

4. מיסוך וכלטינג

  1. עבור מיסוך וכלה, להתאים את ה- pH לערך מתאים בהתאם קבועי היווצרות של סוכן מיסוך וסוכן כלאט.
  2. הוסף את סוכן מיסוך לפתרון ולאפשר לו להגיב לפחות 10 דקות עם יון המתכת של בחירה.
  3. מוסיפים את ריאגנט כלאט. עבור EDTA, זה בדרך כלל יוצר קומפלקס 1:1 עם יון המתכת, אז להוסיף שומות רבות של EDTA כמו מתכת כי יהיה כלאט.
  4. לאחר כלציה, דמעה על ידי הוספת כימי שיגיב עם יון מתכת רעול פנים. לאחר מכן ניתן לנתח או לשחזר את החומר במסכה על ידי משקעים.

הכנת מדגם נכונה היא צעד ראשון קריטי בכל סוגי הניתוחים הכימיים.

הכנת מדגם מתאים חיונית כדי להפחית את פוטנציאל השגיאה. שגיאה ניתן להקל במספר דרכים: מבחירה של כלי זכוכית נכונה לתשומת לב לדמויות משמעותיות בחישובים.

עבור מכשירים אנליטיים רבים יש להכין תחילה פתרון אחיד של מדגם העניין. תהליך הפירוק — שבו מתמוסס ממס — מאפשר היווצרות של פתרון הומוגני שניתן למשוך לשימוש ניתוח אחד או יותר.

עם זאת, המדגם המומס לעתים קרובות דורש צעדי הכנה נוספים לפני שהוא מוכן לניתוח. טכניקות אלה כגון סינון, מיצוי או כלציה עשויות להתבצע גם לפני הניתוח.

וידאו זה יציג כמה צעדים מרכזיים בהכנה נכונה לדגימה לשימוש כימי עוקב.

שגיאות יכולות להיות מסווגות כשיטתיות או אקראיות. שגיאות אקראיות משויכות לשינוי בלתי צפוי, כגון תנאים סביבתיים כמו רוח.

שגיאות שיטתיות קשורות לנסיון או להטיית מכשירים. ניתן להימנע משגיאות אלה בהכנת המדגם על-ידי הבטחה כי הן ההליך והן ההתקנים - כגון איזון או פיפטה - משמשים כראוי.

בעת הכנת פתרון מדגם הבחירה של ממס חשוב, והוא יכול להיות מבוסס על הדרישות של המכשיר בשימוש. מכשירים מסוימים דורשים ממיסים מימיים בעוד שאחרים דורשים אורגני. יש צורך המדגם להתמוסס בנוזל שנבחר. מסיסות היא גורם של אינטראקציות בין מולקולריות של הניתוח עם הממס, ולעתים קרובות ניתן לתמרן על ידי שינוי סוג של ממס, טמפרטורה, או pH.

פתרון מדגם חייב להיות ריכוז מדויק. כדי להכין את הפתרון, המדגם המוצק נשקל על איזון אנליטי ולא על יתרת טעינה עליונה סטנדרטית לדיוק משופר. אם המדגם המוצק הוא היגרוסקופי ומכיל לחות, ייתכן שיהיה צורך לייבש אותו בתנור או במתייבש לפני השקילה.

אם המדגם הוא נוזלי, זה יכול להימדד לפי משקל או נפח. בעת שימוש במדידות נפח, הקפד להשתמש בבקבוק נפחי מכיוון שניתן להציג שגיאות בעת שימוש בכלי זכוכית אחרים למדידה כגון גליל נפחי עם סיום לימודים גדול. לחלופין, ניתן להשתמש בצינור נפחי מזכוכית. אלה מכוילים בדרך כלל כדי לספק נפח מדויק אחד עם הטיפה האחרונה שנותרה בפיפטה.

על מנת להכין את הפתרון, המדגם הנמדד במדויק מומס בבקבוק נפחי. בתחילה, להשתמש פחות מהנפח הסופי של ממס כדי להמיס את המדגם. לאחר ערבוב להוסיף ממס נוסף בזהירות כדי להביא את הפתרון לנפח הסופי שלה.

לאחר המסת רוב המדגם לתוך הממס ייתכן עדיין יש מוצקים נוכחים כי יש להסיר לפני הניתוח. מוצקים לא רצויים אלה ניתן להסיר על ידי סינון על מנת למנוע נזק המכשיר.

במקרים מסוימים, מתכת מומסת חייבת להיות קשורה לתרכובת אחרת — הנקראת חומר כלאט — כדי להתגלות. תהליך זה נקרא כלציה. כאשר מינים לא רצויים גם להיקשר לסוכן כלה, הם חייבים להיות רעולי פנים.

זה נעשה על ידי הוספת סוכן מיסוך אשר מעכב כלציה של מתכות מסוימות. פעולה זו מונעת את המתכות הלא רצויות מלהיות מזוהות. לאחר מכן ניתן לבצע את ההפרה של תרכובות מפריעות כדי לשחרר את יונים מתכת ולאפשר את הניתוח שלהם.

כעת, לאחר שהיסודות של הכנת המדגם תוארו, בואו נסתכל על אופן ביצועו במעבדה.

כדי להתחיל, בחר בקבוק נפחי בגודל המתאים.

השרו את הבקבוקון והעצירה ב-1% חומצה הידרוכלורית כדי להסיר את כל התפיחות הספוגות. מוציאים את הבקבוק ואת המעצור לאחר השריית לילה.

לאחר מכן, לשטוף את הבקבוק הנפחי פקק עם סבון ומים deionized, ולאחר מכן לשטוף ביסודיות.

מייבשים את הבקבוק ואת המעצור בתנור ייבוש עד לייבוש מלא.

ברגע הבקבוקון הוא מגניב, לשקול את המדגם הנדרש ולהוסיף אותו לבקבוקון. הקלט את המסה של המדגם שבו נעשה שימוש.

מוסיפים כ -3/4 של נפח הממס לבקבוקון, לשים את פקק במקום, בעדינות מערבולת כדי להמיס את המוצקים.

מוסיפים את שארית הממס עד שהמניסקוס נוגע בסימן הכיול על הבקבוקון. עוצרים את הבקבוקון והוות אותו מספר פעמים כדי לערבב אותו ביסודיות.

כדי להסיר מוצקים לא פתורים לטעון את המדגם לתוך מזרק, מניח מסנן מזרק על הקצה, ולחץ על הבוכנה כדי לדחוף את המדגם דרך המסנן. המדגם שנאסף מוכן כעת באופן מלא ומוכן לניתוח.

אם המדגם שיש לנתח הוא נוזל ולא מוצק, ניתן למדוד אותו בנפח באמצעות פיפטה. החל מבקבוק נפחי נקי ובעצור, הוסף נפח מתאים של המדגם לבקבוקון ורשום את עוצמת הקול.

מוסיפים את הממס ומסיימים להכין את המדגם כפי שנעשה עבור דגימות מוצקות.

אם המדגם המומס דורש כלציה מתכתית ומסכה, כגון בניתוח סידן מורכב בנוכחות ברזל, להתאים את המדגם ל- pH מתאים על ידי הוספת בסיס.

מוסיפים את חומר מיסוך הציאניד כדי להגן על הברזל מפני כלציה. אפשר לו להגיב לפחות 10 דקות.

מוסיפים את EDTA כדי לכלאט את הסידן ולאפשר לו לערבב. השתמש מספיק כדי ליצור קומפלקס 1:1. המדגם מוכן כעת לקביעת סידן.

כדי להשתמש באותה מדגם לניתוח ברזל, הסר את מסכת הברזל על ידי הוספת פורמלדהיד ומערבבים. המדגם מוכן כעת לניתוח ברזל.

הכנת מדגם היא צעד חשוב כמעט בכל ניסוי ושיטה אנליטית המשמשת כימאים.

גז פלא תעשייתי יכול לשמש כמקור של פחמן דו חמצני עבור פולחן מיקרו אצות. כדי להבין אם זיהום מתכת כבדה מהגז הוא בעיה, האצות שגדלו בדוגמה זו נותחו עבור תוכן מתכת כבדה.

לאחר תקופת הצמיחה האצות נאספו מנוזל הביו-ריאקטור על ידי צנטריפוגה והקפאה מיובשת לפני תחילת תהליך הכנת המדגם.

האצות המיובשות התעכלו באמצעות חום, חומצה חנקתית ומי חמצן על מנת להכין פתרון הומוגני המתאים לניתוח כימי. בדוגמה זו, התוכן של מתכות כבדות באצות מיובשות נותח באמצעות ספקטרומטריה מסת פלזמה מצמידה, או ICP-MS.

הטכניקה זיהתה בו זמנית 12 מתכות במדגם ללא הפרעה, וגילתה כי מזהמי מתכת מגז האילומה הגיעו לביומסה של האצות.

הכנת מדגם נכונה חשובה גם בעת לימוד חומרים מורכבים כגון קרקע באמצעות ספקטרוסקופיית ספיגה אטומית.

בניסוי זה, מדגם של אדמה יבשה הכביד לראשונה על איזון אנליטי. לאחר מכן הוא נוסף לצינור עיכול עם 1:1 מים וחומצה חנקתית מרוכזת באמצעות פיפטה.

לאחר מספר שלבי עיכול המדגם היה מסונן כדי להסיר מוצקים, ואז נאסף בקבוקון נפחי. מים נוספים נוספו כדי לדלל את הפתרון לניתוח.

פוליאסטרים שומנים מהווים את המרכיבים המבניים של חלקים של קירות התא. על מנת ללמוד כימיקלים אלה באמצעות GC-MS, רקמת הצמח נאספה תחילה ושקלה.

לאחר שלבי עיבוד וייבוש שונים, נוספה תערובת 1:1 של טולואן והפטאן כדי להמיס את הדגימה היבשה.

ה- Vial הוכנס למגש הטעינה האוטומטי של GC-MS לניתוח.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב להכנה לדוגמה. עכשיו אתה צריך להבין את היסודות של הכנת דגימות מוצקות ונוזל לניתוח הבא.

תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מסנני ספין משמשים לעתים קרובות ניתוחים ביולוגיים כדי לנקות דגימות. אם פסולת תאית מתסיסת תאים היא בעיה, אז הדגימה יכולה להיות מסוננת והסינון בתחתית יהיה חופשי מחלקיקים. אם ברצונך לרכז חלבון או ניתוח גדול יותר, מסנן עם קרום נקבובית קטן יכול לשמש כי החלבון לא יכול לעבור. לאחר סינון המולקולות הקטנות יותר יהיו בסינון בתחתית ויזרקו. כאשר המסנן הוא הפוך ומסתובב שוב בצינור אחר זה יכול להשתחרר מהמסנן ולאסוף בצורה מרוכזת. מסנני מזרק משמשים לעתים קרובות להסרת חלקיקי אבק וחלקיקים קטנים אחרים מדגימות כרומטוגרפיה, שכן החלקיקים יכולים לסתום את העמודה ולגרום לבעיות עם המכשיר.

EDTA משמש לעתים קרובות עבור titrations כדי לקבוע את תכולת המתכת. מספר השומות של EDTA שנוספו שווה למספר השומות של מתכת. כלציה משמשת גם עבור עקירות בניתוח מתכת עקבות. כלאט מתכת תנטרל את המטען ותאפשר לה לחלץ אותה לממס אורגני אם לסוכן הכלה יש קבוצה הידרופובית. מיסוך מונע מתכת מלהיות כלאט ולכן מלהיות מופק. שיטה זו יכולה לשמש לניקוי מדגם או שכיבות מקדים של מתכות עקבות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter