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Preparação da Amostra para Caracterização Analítica
 
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Preparação da Amostra para Caracterização Analítica

Overview

Fonte: Laboratório da Dra.B. Jill Venton - Universidade da Virgínia

A preparação da amostra é a forma como uma amostra é tratada para se preparar para análise. A preparação cuidadosa da amostra é fundamental em química analítica para gerar com precisão uma amostra padrão ou desconhecida para uma medição química. Erros nos métodos de química analítica são categorizados como aleatórios ou sistemáticos. Erros aleatórios são erros devido à alteração e muitas vezes são devido ao ruído no instrumento. Erros sistemáticos se devem ao viés investigativo ou instrumental, que introduz uma compensação no valor medido. Erros na preparação da amostra são erros sistemáticos, que se propagarão através da análise, causando incerteza ou imprecisões através de curvas de calibração inadequadas. Erros sistemáticos podem ser eliminados através da preparação correta da amostra e uso adequado do instrumento. A má preparação da amostra também pode, por vezes, causar danos ao instrumento.

Principles

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Para fazer uma solução, deve-se considerar a solubilidade da substância que está sendo medida. O composto de juros deve dissolver-se no solvente para fazer uma solução. A solubilidade é um fator de interações intermoleculares do analito com o solvente e muitas vezes pode ser manipulada alterando o tipo do solvente ou do pH.

O primeiro passo para fazer uma amostra é escolher vidros adequados e fazer uma solução. A maioria das amostras na fase líquida são feitas em frascos volumosos. Frascos volumosos são feitos para conter um certo volume de líquido a uma determinada temperatura (normalmente 20 °C), e são calibrados para serem precisos menos de 0,02% se forem vidros classe A. Frascos volumosos são muito mais precisos para medir líquidos do que cilindros graduados.

Para fazer uma solução de um sólido, o sólido deve primeiro ser massa com precisão com uma escala calibrada. No entanto, a massa de alguns reagentes e precipitados pode mudar porque são água higroscópica e adsorb. Se o reagente tiver água adsorvida é impossível usar o peso molecular não hidratado para obter o número correto de mols. Para remover água adsorvida, os sólidos que são termicamente estáveis são secos em um forno a ~110 °C. Reagentes sólidos e precipitados são então armazenados em um dessecador contendo um dessecante que adsorva qualquer água presente.

Se a amostra a ser diluída for um líquido, uma pipeta é normalmente usada para mensurá-la. Uma pipeta de transferência de vidro é tipicamente calibrada para fornecer um volume preciso e a última gota permanece na pipeta e não deve ser soprada para fora. Uma pipeta de medição terá várias marcas - semelhantes a uma burette - e é menos precisa, mas mais versátil do que uma pipeta de transferência. Volumes menores podem ser medidos usando micropipetters variáveis, com pontas plásticas descartáveis, e estes estão disponíveis em volumes de 1-5.000 μL. Os micropipetters devem ser calibrados a cada 6 meses para que eles mantenham a precisão. Se o plástico for um problema, pequenas microsiingas também podem ser usadas para medir volumes na faixa de microliter.

Depois que uma solução é feita há outros elementos de preparação da amostra que podem ser pertinentes. Qualquer amostra com sólido restante no líquido deve ser filtrada. A filtragem tradicional usa uma configuração com um papel filtro que fica em um funil de vidro frito em cima de um frasco de filtro com um braço onde o vácuo pode ser puxado. Este tipo de filtragem é usado para coletar um precipitado em experimentos como análise gravimétrica. Amostras menores a serem analisadas podem ser limpas através da filtragem de seringas onde a amostra é carregada em uma seringa e, em seguida, passada através de um filtro de polímero com resolução de até 0,2 nm. Além disso, filtros de spin estão disponíveis onde a amostra é carregada em um tubo de microcentrifuuge com um filtro, o tubo é colocado em uma centrífuga, e o líquido filtrado está na parte inferior após a centrifugação. Filtros de spin também são usados para concentrar analitos maiores, como proteínas. Filtros de seringa e spin são úteis para filtrar contaminantes e outros sólidos que possam interferir no instrumento ou medição. O tipo de filtragem utilizada depende da quantidade de amostra e do tamanho do sólido que precisa ser filtrado.

A preparação da amostra também pode envolver a extração ou pré-concentra de uma amostra. Ao estudar íons metálicos, a quelação pode ser usada para extração seletiva. Íons metálicos se ligarão a um agente quelaante e, em seguida, o complexo quelaado pode ser extraído. Agentes mascarados são usados antes da quelação para ligar um íon metálico específico que não é então quelatado pelo agente quelaante. Uma reação química demasking é usada para liberar o íon metálico específico de volta em solução. O mascaramento permite uma preparação de amostra mais específica e proteção de certos íons metálicos.

Solubilidade é a quantidade de substância que se dissolverá em um líquido. Geralmente, se menos de 0,1 g se dissolver em 100 mL de solvente uma substância é considerada insolúvel. A solubilidade depende de interações intermoleculares com o analito e, portanto, a regra geral na solubilidade é "como dissolve como se". Substâncias polares tendem a dissolver-se bem em solventes polares, enquanto analitos não polares dissolvem-se bem em solventes não polares. A solubilidade dos sólidos em um líquido é geralmente maior em temperaturas mais altas, devido à energia adicionada e movimento molecular.

A quelação é realizada por ligantes multidentais que têm múltiplos locais de ligação para uma molécula. O agente de quenteamento mais comum para íons metálicos é o ácido triáctico etilenodiaminete (EDTA), que é hexadentato e se liga através de 2 átomos de nitrogênio e 4 átomos de oxigênio. Tem 6 prótons ácidos que pode perder na formação do complexo metal-EDTA. A constante de formação para ligação é específica de pH e o pH é frequentemente ajustado para ajustar a especificidade da reação de quelação.

Como o EDTA pode ser complexo com muitos metais diferentes, a máscara é necessária para realizar a análise de um metal específico. Antes da adição do agente de quesquente, um agente mascarado é adicionado para proteger o íon de interesse de reagir com o EDTA. A constante de formação para o complexo agente-metal mascarado deve ser maior do que a constante de formação para o complexo edta-metal para que o EDTA não reaja. Por exemplo, máscaras de flúor Al3+ e Fe3+. Cianeto é outro agente mascarado comum que não reage com Mg2+, Ca2+ou Pb2+ mas reage com outros metais como Cd2+, Hg2+, Fe2+, Fe3+e Ni+. O cianeto pode formar um gás tóxico em pH baixo, por isso deve ser sempre usado em uma solução acima do pH 11. Demasking libera o íon metálico mascarado; por exemplo, cianeto pode ser desmascarado por uma reação química com formaldeído. Mascaramento e desmascaramento permitem a seletividade para medir componentes de misturas complexas.

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Procedure

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1. Fazer uma solução a partir de um sólido

  1. Escolha o vidro correto para fazer a solução.
  2. Limpe bem os vidros através de um banho ácido de 1% HCl ou HNO3, juntamente com sabão para remover quaisquer impurezas (aviso de segurança: com qualquer forte uso de ácido luvas, óculos e outros equipamentos de proteção individual apropriados).
  3. Enxágüe o vidro várias vezes com água destilada. Seque em um forno, se necessário.
  4. Para fazer uma solução a partir de uma massa sólida e massa a quantidade correta de sólido.
  5. Coloque o sólido no frasco volumoso e depois encha cerca de 3/4 cheio com solvente.
  6. Gire para dissolver totalmente o sólido antes de encher o frasco volumoso completamente.
  7. Encha o frasco volumoso até a linha. O menisco deve tocar na linha de enchimento. Em seguida, inverta o frasco várias vezes com a tampa para misturar ainda mais, se necessário.

2. Fazer uma solução a partir de um líquido

  1. Escolha o vidro correto para fazer a solução. Para entregar um líquido usando uma pipeta de transferência, encha a pipeta na linha usando uma lâmpada de pipeta.
  2. Solte o líquido no frasco volumoso para fazer a solução. Não exploda a última gota.
  3. Encha o frasco volumoso até a linha para que o menisco toque a linha. Misture a solução invertendo várias vezes.

3. Filtragem

  1. Para uma configuração de frasco de filtro, coloque um pedaço de papel filtro no filtro de vidro frito.
  2. Conecte o filtro de vidro frito a um frasco de filtro.
  3. Coloque um vácuo no braço do frasco do filtro. Uma armadilha também pode ser usada para evitar que qualquer líquido entre no vácuo.
  4. Ligue o vácuo e despeje a amostra através do papel do filtro.
  5. Filtre até que um pó seco seja deixado. Continue a secar a amostra em um forno se desejar um precipitado seco.
  6. Para o filtro de seringa, adicione a amostra a uma seringa limpa com uma extremidade de bloqueio Luer.
  7. Enrosque o filtro de seringa na trava Luer. Empurre o êmbolo sobre a seringa e colete o líquido após o filtro.
  8. Para um filtro de giro, pré-enxágue o filtro com tampão ou água ultrapura.
  9. Insira o filtro de giro em um tubo de microcentrifuuagem.
  10. Carregue a amostra em cima do filtro e cubra o tubo.
  11. Coloque o tubo em uma centrífuga, certificando-se de equilibrá-lo corretamente com outro tubo do outro lado, e centrífuga por 10-30 min, dependendo do tipo de filtro de giro.
  12. Remova o filtro e o líquido na parte inferior é a solução filtrada.
  13. Se a amostra não puder passar pela membrana — como uma grande proteína — ela permanecerá no topo do filtro. Neste caso, vire o filtro, coloque-o em um novo tubo e gire novamente. Isso produzirá uma amostra concentrada.

4. Mascaramento e Chelating

  1. Para mascarar e quesla, ajuste o pH a um valor apropriado, dependendo das constantes de formação do agente mascarador e do agente quelaante.
  2. Adicione o agente de mascaramento à solução e deixe que ele reaja por pelo menos 10 minutos com o íon metálico de escolha.
  3. Adicione o reagente de quesequente. Para EDTA, ele normalmente forma um complexo 1:1 com o íon metálico, por isso adicione o máximo de mols de EDTA como o metal que será quelaado.
  4. Após a quelação, demask adicionando um produto químico que reagirá com o íon de metal mascarado. A substância mascarada pode então ser analisada ou recuperada por precipitação.

A preparação adequada da amostra é um primeiro passo crítico em todos os tipos de análises químicas.

A preparação adequada da amostra é essencial para reduzir o potencial de erro. O erro pode ser mitigado de várias maneiras: desde a seleção de vidros adequados até a atenção a números significativos nos cálculos.

Para muitos instrumentos analíticos, uma solução uniforme da amostra de interesse deve primeiro ser preparada. O processo de dissolução — onde um soluto se dissolve em um solvente — permite a formação de uma solução homogênea que pode então ser retirada para uso em uma ou mais análises.

No entanto, a amostra dissolvida muitas vezes requer passos adicionais de preparação antes de estar pronto para análise. Essas técnicas como filtração, extração ou quelação também podem ser realizadas antes da análise.

Este vídeo demonstrará alguns passos-chave na preparação adequada da amostra para posterior uso químico.

Erros podem ser classificados como sistemáticos ou aleatórios. Erros aleatórios estão associados a mudanças inesperadas, como condições ambientais como o vento.

Erros sistemáticos estão associados ao viés experimentador ou instrumento. Esses erros na preparação da amostra podem ser evitados, garantindo que tanto o procedimento quanto os dispositivos - como um equilíbrio ou pipeta - sejam usados corretamente.

Ao preparar uma solução amostral, a escolha do solvente é importante, podendo ser baseada nos requisitos do instrumento que está sendo utilizado. Alguns instrumentos requerem solventes aquosos, enquanto outros requeremorgânicos. É necessário que a amostra se dissolva no líquido selecionado. Solubilidade é um fator de interações intermoleculares do analito com o solvente, e muitas vezes pode ser manipulado alterando o tipo de solvente, temperatura ou pH.

Uma solução amostral deve ter uma concentração precisa. Para preparar a solução, a amostra sólida é ponderada sobre um equilíbrio analítico em vez de um equilíbrio padrão de carregamento superior para uma melhor precisão. Se a amostra sólida for higroscópica e conter umidade, pode precisar ser seca em um forno ou dessecador antes da pesagem.

Se a amostra for líquida, pode ser medida em peso ou volume. Ao usar as medidas de volume, certifique-se de usar um frasco volumoso, pois erros podem ser introduzidos ao usar outros vidros de medição, como um cilindro volumoso com grandes graduações. Alternativamente, uma pipeta volumosa de vidro pode ser usada. Estes são tipicamente calibrados para fornecer um volume preciso com a última gota restante na pipeta.

Para preparar a solução, a amostra medida com precisão é dissolvida em um frasco volumoso. Inicialmente, use menos do que o volume final de solvente para dissolver a amostra. Depois de misturar adicione solvente adicional cuidadosamente para trazer a solução ao seu volume final.

Após a dissolução da maior parte da amostra no solvente, ainda pode haver sólidos presentes que precisam ser removidos antes da análise. Esses sólidos indesejados podem ser removidos por filtragem, a fim de evitar danificar o instrumento.

Em alguns casos, um metal dissolvido deve ser ligado a outro composto - chamado de agente quelaante - para ser detectado. Esse processo é chamado de quelação. Quando espécies indesejadas também se ligam ao agente quelaante, elas devem ser mascaradas.

Isso é feito adicionando um agente mascarado que inibe a quelação de certos metais. Isso evita que os metais indesejados sejam detectados. Desmascarar os compostos interferentes pode então ser realizado para liberar os íons metálicos e permitir sua análise.

Agora que os fundamentos da preparação da amostra foram delineados, vamos dar uma olhada em como é realizado em laboratório.

Para começar, selecione um frasco volumoso de tamanho apropriado.

Mergulhe o frasco volumoso e rolha em ácido clorídrico de 1% para remover quaisquer cáras adsorvidas. Remova o frasco e a rolha depois de encharcar durante a noite.

Em seguida, lave o frasco volumoso e rolha com sabão e água desionizada e enxágue bem.

Seque o frasco e a rolha em um forno de secagem até secar completamente.

Uma vez que o frasco esteja frio, pese a amostra necessária e adicione-a ao frasco. Regisso da massa da amostra utilizada.

Adicione cerca de 3/4 do volume do solvente ao frasco, coloque a rolha no lugar e gire suavemente para dissolver os sólidos.

Adicione o restante do solvente até que o menisco toque a marca de calibração no frasco. Roe o frasco e inverta-o várias vezes para misturar completamente.

Para remover sólidos não resolvidos, carregue a amostra em uma seringa, coloque um filtro de seringa na ponta e pressione o êmbolo para empurrar a amostra através do filtro. A amostra coletada está agora totalmente preparada e pronta para análise.

Se a amostra a ser analisada for um líquido e não um sólido, pode ser medido volumétricamente usando uma pipeta. Começando com um frasco volumoso limpo e rolha, adicione um volume apropriado da amostra ao frasco e grave o volume.

Adicione o solvente e finalize a preparação da amostra como é feito para amostras sólidas.

Se a amostra dissolvida exigir que a quelação metálica e o mascaramento, como em uma análise complexométrica de cálcio na presença de ferro, ajuste a amostra para um pH apropriado adicionando base.

Adicione o agente de mascaramento de cianeto para proteger o ferro da quelação. Deixe-o reagir por pelo menos 10 minutos.

Adicione EDTA para quelatar o cálcio e deixe-o misturar. Use o suficiente para formar um complexo 1:1. A amostra está pronta para determinação de cálcio.

Para usar a mesma amostra para análise de ferro, demasque o ferro adicionando formaldeído e mistura. A amostra está pronta para análise de ferro.

A preparação da amostra é um passo importante em quase todos os experimentos e métodos analíticos utilizados pelos químicos.

O gás de chaminuto industrial pode ser usado como fonte de dióxido de carbono para cultivar microalgas. Para entender se a contaminação por metais pesados do gás é um problema, as algas cultivadas neste exemplo foram analisadas para o conteúdo de metais pesados.

Após o período de crescimento, as algas foram coletadas do fluido bioreator por centrifugação e congelamento seco antes do início do processo de preparação da amostra.

As algas secas foram digeridas usando calor, ácido nítrico e peróxido de hidrogênio para preparar uma solução homogênea adequada para análise química. Neste exemplo, o teor de metais pesados em algas secas foi analisado utilizando espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplado, ou ICP-MS.

A técnica detectou simultaneamente 12 metais na amostra sem interferência, e revelou que contaminantes metálicos do gás de chaminução acabaram na biomassa das algas.

A preparação adequada da amostra também é importante ao estudar materiais complexos, como o solo usando espectroscopia de absorção atômica.

Neste experimento, uma amostra de solo seco foi primeiramente ponderada sobre um equilíbrio analítico. Em seguida, foi adicionado a um tubo de digestão com água 1:1 e ácido nítrico concentrado usando uma pipeta.

Após várias etapas de digestão, a amostra foi filtrada para remover quaisquer sólidos, em seguida, foi coletada em um frasco volumoso. Água adicional foi adicionada para diluir a solução para análise.

Poliésteres lipídicos constituem os componentes estruturais de partes das paredes celulares. Para estudar esses produtos químicos utilizando GC-MS, o tecido vegetal foi coletado e pesado pela primeira vez.

Após várias etapas de processamento e secagem, uma mistura de 1:1 de tolueno e heptano foi adicionada para dissolver a amostra seca.

O frasco foi inserido na bandeja de carregamento automático de um GC-MS para análise.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à Preparação de Amostras. Agora você deve entender o básico da preparação de amostras sólidas e líquidas para análise posterior.

Obrigado por assistir!

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Applications and Summary

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Filtros de spin são frequentemente usados em análises biológicas para limpar amostras. Se os detritos celulares da lise celular forem um problema, então a amostra pode ser filtrada e o filtrado na parte inferior estará livre de partículas. Se você deseja concentrar uma proteína ou outro analito maior, um filtro com uma pequena membrana porosa pode ser usado que a proteína não pode passar. Após a filtragem do giro, as moléculas menores estarão no filtrado na parte inferior e serão descartadas. Quando o filtro é invertido e girado novamente em outro tubo, ele pode ser liberado do filtro e coletado de forma concentrada. Filtros de seringa são frequentemente usados para remover partículas de poeira e outras pequenas partículas de amostras de cromatografia, pois as partículas poderiam entupir a coluna e causar problemas com o instrumento.

EDTA é frequentemente usado para titulações para determinar o conteúdo metálico. O número de verrugas de EDTA adicionadas é igual ao número de mols de metal. A quelação também é usada para extrações em análise de metais de traço. A estação de um metal neutralizará a carga e permitirá que ela seja extraída em um solvente orgânico se o agente quelaante tiver um grupo hidrofóbico. A mascaração impede que um metal seja quelatado e, portanto, seja extraído. Este método pode ser usado para limpeza de amostras ou pré-concentração de metais de rastreamento.

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