Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Environmental Microbiology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

בידוד חיידקים צואתיים מדגימות מים על ידי סינון
 
Click here for the English version

בידוד חיידקים צואתיים מדגימות מים על ידי סינון

Overview

מקור: מעבדות של ד"ר איאן פפר וד"ר צ'ארלס גרבה - אוניברסיטת אריזונה
הפגנה סופרת: לואיזה איקנר

איכות המים המיועדים לשימוש במסגרות חקלאיות, פנאי ומקומיות היא בעלת חשיבות רבה בשל הפוטנציאל להתפרצויות של מחלות המועברות במים. חומרים מיקרוביאליים מעורבים באירועים כאלה כוללים טפילים, חיידקים, ווירוסים כי הם לשפך במספרים גבוהים בצואה של אנשים ובעלי חיים נגועים. העברה למארחים חדשים ורגישים עלולה להתרחש לאחר מכן דרך המסלול הצואה-אוראלי על בליעה של מים מזוהמים. לכן, היכולת לפקח על מקורות מים לנוכחות של מיקרואורגניזמים פתוגניים היא משמעותית על מנת להבטיח את בריאות הציבור.

בשל המספר העצום והמגוון של פתוגנים צואה-אוראליים פוטנציאליים שעשויים להיות נוכחים במים ובריכוזים המשתנים שלהם, זה לא מעשי ויקר לבדיקה ישירה עבור כל אחד מהם על בסיס קבוע. לכן, בדיקות מיקרוביולוגיות לניטור איכות המים מעסיקות חיידקי אינדיקטור קוליפורמיים. קוליפורמים מהווים, בין השאר, את המיקרופלורה במעיים הרגילה של יונקים בעלי דם חם, אינם פתוגניים, ומופרשים בעקביות בצואה. לכן, זיהוי של חיידקים קוליפורמיים במים פירושו כי שחרור צואה התרחש, וכי מיקרואורגניזמים פתוגניים מזיקים עשויים להיות נוכחים גם.

Principles

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

טכניקת סינון הממברנה משמשת להערכת האיכות המיקרוביולוגית של המים על ידי בדיקת חיידקי אינדיקטור צואתי. כמות מים(למשל 100 מ"ל) מועברת דרך מסנן ממברנה מיוחד עם גודל נקבובית ממוצע מינימלי של 0.45 מיקרומטר, להקל על לכידת חיידקים, כפי שהם כ 1-מיקרומטר בגודל. לאחר סינון, הממברנה מוחלת בקפידה על מדיום תרבות אגרוז מיוחד, ודגור בתנאים המתאימים לתרבות המיקרואורגניזמים היעד.

כאשר מוחל לשימוש בניטור איכות המים, סינון ממברנה הוא האידיאלי ביותר עבור מקורות עכוז נמוכה כגון מי שתייה, בריכות שחייה, ומים טבעיים פנאי כגון אגמים ומאגרים. מים גבוהים בחומר חלקיקי (למשל ביוב גולמי) יגרמו לפגיעה במסנן; לכן, ניתן לנתח רק אמצעי אחסון קטנים יותר ( למשל 100מ"ל). סינון ממברנה הוא גם לא מעשי עבור מקורות מים עם מספר גדול של רקע (או לא קוליפורם) חיידקים, אשר יכול להגביר את הקושי של הספירה של חיידקי קוליפורם היעד על המדיום אגרוז לאחר הדגירה.

וידאו זה מדגים את האוסף של מי שתייה ודגימות מים סביבתיים, סינון הממברנה של הדגימות, ואת הספירה של מספר סוגים של מושבות חיידקים אינדיקטור צואה באמצעות מדיה צמיחה אגרוז מיוחדים כולל קוליפורמים הכוללים, קוליפורמים צואה, ו enterococci צואה. בדיקות שנערכו עוד יותר על מנת לאמת מושבות חזקות מוצגות גם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. איסוף ועיבוד דוגמאות מים

  1. לאסוף כמה דגימות מים 1-L ממקור המים הבדיקה (למשל מזרקות מים, בריכות שחייה, מאגרים, מערכות חלוקת מים, שפכים גולמיים או מטופלים), והובלה על קרח למעבדה לניתוח מיקרוביאלי.
  2. לחטא או לחטא את ההרכבה סעפת סינון הממברנה לפני השימוש על ידי autoclaving, חשיפה לקרינת UV (2 דקות), או הצתת להבת אתנול.
  3. עם קירור כל החלקים, חברו כראוי את הסעפת למשאבת ואקום ולבקבוקון פסולת סינון ואקום המכיל אקונומיקה.
  4. להבת אתנול מחטאת זוג מלקחיים ואיתם מסירים מסנן ממברנה סטרילי ומרושת מאריזה. ממברנות בקוטר 47 מ"מ עם גודל נקבובית 0.45-מיקרומטר משמשים בדרך כלל. עם זאת, ניתן להשתמש בקטרים חלופיים ובגודלי נקבוביות בתנאי שגודל הנקבבובית יכול ללכוד במידה מספקת את המיקרואורגניזמים של היעד, ולפחות 70% משטח המסנן מורכב משטח נקבוביות.
  5. מניחים את המסנן על מרכז אזור סינון הממברנה של הסעפת, ומחילים משפך מסנן סטרילי על היחידה ומאבטחים אותו במקומו.
  6. מדוד את הנפח הרצוי של מי בדיקה(למשל 100 מ"ל) והוסף אותו למשפך (סימן קו 100 מ"ל גלוי על המשפך).
  7. החל ואקום חלקי [הפרש לחץ של 34 עד 51 kPa (קילוPascals)] על מנת לצייר את דגימת הבדיקה דרך המסנן. סה"כ חומר מוצק מושעה, כולל חיידקים וחומר אורגני מתפורר, גדול יותר מאשר גודל הנקבבובית הממוצע מסנן של 0.45 מיקרומטר לכודים על המסנן. חלקיקים קטנים יותר כולל וירוסים ומוצקים מומסים כגון כמויות קטנות של חומר אורגני ומלחים, יעברו דרך הממברנה לתוך בקבוק ואקום מיכל הפסולת המכיל אקונומיקה.
  8. לאחר מעבר מלא של המדגם דרך המסנן, לשטוף את הפנים של המשפך עם שניים עד שלושה 20-30 מ"ל כמויות של מים סטריליים.
  9. לכבות את הוואקום ולהסיר את המשפך מן הסעפת עם סגירת השטיפה הסופית.
  10. עם מלקחיים מעוקרים להבת אתנול, הסר מיד את מסנן הממברנה מהיחידה והנח אותו מיד על מדיום הצמיחה המתאים למיקרואורגניזם היעד (טבלה 1 מפרטת את אמצעי הצמיחה ותנאי הדגירה המומלצים לכל אחד מהם).
  11. החל את מסנן הממברנה על משטח אגרוז עם תנועה מסוג גליל כדי להבטיח מגע מלא של הממברנה עם מדיום הצמיחה, כדי למנוע את מלכוד של בועות אוויר.
  12. החלף את משפך הסינון המשומש ביחידה סטרילית בין העיבוד של כל דגימה, וחטא אתל סעפת נירוסטה כדי למנוע זיהום צולב.

2. הספירה למושבה

  1. לאחר תקופת הדגירה, להסיר את לוחות הצמיחה מן האינקובטור לספירה.
  2. באופן אידיאלי, בצע את ספירת המושבה תחת הגדלה של צריכת חשמל נמוכה באמצעות מקור אור לבן וקריר.
  3. סה"כ קוליפורמים
    1. מושבות קוליפורם הכוללות הן בדרך כלל ורודות עד אדומות כהות בצבע עם ביהק משטח מתכתי. ההבהמה עצמה עשויה לכסות חלקית או מלאה את המושבה. מורפולוגיות מושבה קוליפורמיות לא טיפוסיות עשויות להיות אדומות כהות, ריריות או מגושמת ללא ברק.
    2. מושבות ורודות, כחולות, לבנות או חסרות צבע בהיעדר ביהר נחשבות ללא קוליפורמים.
  4. קוליפורמים צואתיים
    1. מושבות קוליפורם צואתיות מופיעות כגוונים שונים של כחול.
    2. מושבות קוליפורם לא דביקות אפורות לקרם בצבע.
  5. צואה אנת'קוקוצ'י
    1. מושבות צואה אנתרוקוצ'י נעות בין ורוד לאדום כהה בצבע.

3. אימות מושבה

  1. סה"כ קוליפורמים
    1. לאימות נוכחות-היעדרות, ספוגית הממברנה כולה באמצעות לולאת חנק סטרילית. עבור מושבות, עדיף לאמת לפחות חמש כל אחת מהמורפולוגיות האופייניות והבלתי טיפוסיות.
    2. מעבירים את המושבה שנבחרה לכלי זכוכית המכיל ציר טריפטוז לאוריל עם צינור דורהאם. לדגור על הצינורות המחוסנים ב 35±0.5 °C (5 °F) עבור 48 שעות. נוכחות של עכוז המציין צמיחה בשילוב עם הפקת גז מאמתת את המושבה כקולפורם.
  2. קוליפורמים צואתיים
    1. העבר מושבות כחולות בצבע באופן הפוך לכלי זכוכית המכילים מדיום EC סטרילי עם צינור דורהאם. לדגור על הצינורות המחוסנים ב 44.5 ± 0.2 °C (24 °F). נוכחות של עכוז המציין צמיחה בשילוב עם הפקת גז מאמתת את המושבה כקולפורם צואתי.
  3. צואה אנת'קוקוצ'י
    1. מושבות שביתה המאפות את המורפולוגיה של אנתרוקוצ'י צואה לבידוד באופן אסטפטי על אגר עירוי המוח-לב (BHIA), ודגרה ב 35 ± 0.5 °C (5 °F) עבור 24 עד 48 שעות.
    2. העבר צמיחה ממושבה מבודדת על BHIA על שתי שקופיות זכוכית מנוקה מראש.
    3. הוסף שתיים עד שלוש טיפות של 3% מי חמצן כדי להכין מריחות על השקופיות. המראה המהיר של בועות מצביע על תוצאה "קטלס חיובית", ואת לבודד אינו חיידק סטרפטוקוקוס צואה.
    4. בצע כתם גרם לבדיקות מבודדות כ"קטלס שלילי " (לא נצפו בועות). צואה enterococci הם גרם חיובי, ביצות, ומופיע בעיקר בזוגות או שרשראות קצרות.
מחוון חיידקי צואתי מדיה מומלצת
(טמפרטורת הדגירה, זמן) 1
סה"כ קוליפורמים LES אנדו אגר (35 ± 5 °C (5 °F), 24 שעות)
M-Endo בינוני (35 ± 5 °C (5 °C), 24 שעות)
קוליפורמים צואתיים בינוני m-FC (44.5 ± 0.2 °C (5 °F), 24 שעות)
צואה אנת'קוקוצ'י m אנטרוקוקוס אגר (35 ± 0.5 °C (5 °F), 48 שעות)

טבלה 1. מדיה צמיחת תרבית נפוצה לאיתור אינדיקטורים חיידקיים צואתיים בדגימות סביבתיות
1 כפי שהומלץ על ידי השיטות הסטנדרטיות לבחינת מים ושפכים (איגוד בריאות הציבור האמריקאי והאגודה האמריקאית לעבודות מים, מהדורה22, 2012)

סינון ממברנה ואת פולחן לאחר מכן של חיידקים שנאספו היא טכניקה שימושית כדי להעריך את האיכות והניקיון של מקור מים.

איכות המים המיועדים לשימוש במסגרות חקלאיות, פנאי או ביתיות היא בעלת חשיבות רבה, בשל הפוטנציאל להתפרצויות של מחלות המועברות במים. אם מים מזוהמים בחומר צואתי מבעלי חיים או מבני אדם, טפילים, חיידקים או וירוסים פתוגניים עשויים להתפשט לפונדקאים חדשים עם בליעתם. ניטור מקורות מים עבור אורגניזמים גורמי מחלות כאלה הוא אפוא קריטי כדי להבטיח את בריאות הציבור.

המספר העצום והמגוון של פתוגנים צואה-אוראליים שעשויים להיות נוכחים במקור מים עושה את זה לא מעשי כדי assay עבור כל באופן עצמאי על בסיס קבוע. במקום זאת, בדיקות מיקרוביולוגיות נפוצות לאיכות המים משתמשות בחיידקי אינדיקטור קוליפורם. לקבלת מידע נוסף אודות תהליך זה, עיין בסרטון של אוסף זה על אורגניזמים מחווינים.

וידאו זה ימחיש את תהליך סינון הממברנה על דגימת מים סביבתית, להדגים כיצד תרבית מספר סוגים של חיידקי אינדיקטור צואה כולל קוליפורמים הכוללים, קוליפורמים צואתיים, ו entercocci צואה, ולתאר כיצד לאמת את נוכחותו של זיהום צואה.

טכניקת סינון הממברנה משתמשת בלחץ שלילי כדי לצייר דגימות מים על פני מסנן ולתפוס חיידקים. המסנן הוא קרום מיוחד עם גודל נקבובית ממוצע מינימלי של 0.45 מיקרומטר המאפשר לכידת חיידקים, אשר בדרך כלל סביב 1 מיקרומטר בגודל. לאחר סינון, הממברנה מוחלת על מדיה צמיחה agarose, ודגרה בתנאים המתאימים לתרבות מיקרואורגניזמים היעד.

טכניקה זו היא אידיאלית ביותר עבור מקורות עכוז נמוך כגון מי שתייה, בריכות שחייה, או אגמים ומאגרים. מים גבוהים בתוכן חומר חלקיקי עלולים לגרום לעבירה או לסתימה של המסנן, ולהגביל את הנפח שניתן לעבד. בנוסף, סינון ממברנה אינו מעשי עבור מקורות מים המכילים מספר רב של רקע, או חיידקים שאינם קוליפורם, כמו ביוב גולמי, שכן זה יכול להגביר את הקושי של חלוקת coliforms היעד על תרבות ודגרה.

לאחר דגימות חיידקים נלכדו במסנן, הם יכולים להיות מועברים לוחות צמיחה כדי לקבוע את סוגי חיידקי אינדיקטור נוכח דגימות המים. ציפוי על סוגי מדיה שונים בוחר לסוגי חיידקים שונים, ויכול לאפשר זיהוי מהיר.

לאחר צמיחה על לוחות ספציפיים לתרבות, אישור נוסף של זהויות חיידקי אינדיקטור יכול להתבצע באמצעות טכניקות כגון לקטוף מושבות למדיה נוזלית ושימוש בצינורות דורהאם כדי ללכוד גזים, אשר צריך להיות מיוצר רק בנוכחות קוליפורמים צואה או קוליפורמים הכוללים. בנוסף, enterococci צואה חשוד יכול להיות מאושר על ידי שילוב של כתמי גרם חיובי, יחד עם בדיקת מי חמצן-קטלאז שלילית.

עכשיו שאנחנו מכירים את העקרונות מאחורי סינון הממברנה של דגימות מים, בואו נסתכל על איך הליך זה מתבצע.

כדי להתחיל את ההליך, תחילה לאסוף דגימות מים ממקורות מים לבדוק של עניין. ודא שהדגימות נאספות בבקבוקי 1-L סטריליים. לאחר השלמת האיסוף, הניחו את הדגימות על קרח והעבירו אותן למעבדה לניתוח מיקרוביאלי.

כדי להתחיל בניתוח, תחילה לעקר סעפת סינון ממברנה. לאחר מכן, חברו את הסעפת למשאבת ואקום ובקבוקון פסולת סינון המכיל אקונומיקה.

אתנול מחטא להבה ומסיר קרום מגולע סטרילי מהאריזה. מניחים את המסנן על מרכז אזור סינון הממברנה של הסעפת, ומחילים משפך מסנן סטרילי על היחידה, ולאחר מכן מאובטח במקום.

למדוד את הנפח הרצוי של מי בדיקה לתוך המשפך. יש למרוח ואקום חלקי כדי לצייר את דגימת הבדיקה דרך המסנן. חומר מוצק מושעה, כולל חיידקים וחומר אורגני אחר, גדול מ 0.45 מיקרומטר יהיה לכוד על או בתוך המסנן, בעוד חלקיקים קטנים יותר, וירוסים, מוצקים מומסים יעברו אם כי לתוך בקבוקון הפסולת המכיל אקונומיקה.

לאחר המדגם עבר דרך המסנן, לשטוף את הפנים של משפך עם 25 מ"ל של מים סטריליים 3 פעמים, ומאפשר לזה לעבור דרך המסנן. כאשר השטיפה הסופית הושלמה, לנתק את הוואקום ולהסיר את המשפך מן הסעפת.

לאחר מכן, אתנול לחטא את המלקחיים ומיד להסיר את מסנן הממברנה מהיחידה. הנח אותו על צלחת הצמיחה המתאימה למיקרואורגניזם היעד באמצעות תנועה מתגלגלת כדי להבטיח מגע מלא עם פני השטח ולהימנע מלכידת בועות אוויר.

לעיבוד של כל דגימה נוספת, לחטא את סעפת נירוסטה ולהשתמש משפך סטרילי כדי למנוע זיהום צולב. לבסוף, מניחים את הצלחות לתוך אינקובטור לתקופת הדגירה המתאימה.

לאחר תקופת הדגירה, להסיר את הצלחות מן האינקובטור לספירה. במידת האפשר, בצע את ספירת המושבה תחת הגדלה של צריכת חשמל נמוכה באמצעות מקור אור לבן קריר. כדי לקבוע קוליפורמים הכוללים, לזהות ולספור מושבות שנראות ורודות עד אדומות כהות בצבע, ויש להן גוון משטח מתכתי המכסה באופן מלא או חלקי את המושבה. מושבות קוליפורם מוחלטות לא טיפוסיות עשויות להיראות אדומות כהות, ריריות או מנוכרות ללא ביהוק.

מושבות שנראות כחולות, לבנות, חסרות צבע או ורודות ללא ברק נחשבות ללא קוליפורמים, ואין לכלול בהן את ספירת הקוליפים הכוללת.

מושבות קוליפורם צואתיות יופיעו כגוונים שונים של כחול, ואלה יש לספור כקטגוריה נפרדת. מושבות קוליפורם שאינן צואתיות הן בדרך כלל אפורות לקרם בצבע, ויש לרשום גם בקטגוריה בודדת. לבסוף, מושבות אנתרוקוצ'י צואתיות ינועו בין ורוד לאדום כהה בצבע ויש לספור בנפרד.

כדי לאמת מושבות קוליפורמיות מוחלטות, יש למרוח לולאת חנק מעוקרת מקוררת על מושבה אחת בעלת עניין. מעבירים את המושבה שנבחרה לכלי זכוכית המכיל ציר טריפטוז לאוריל וצינור דורהאם. לאחר מכן, למקם את התרבויות לתוך אינקובטור. נוכחות של עכוז יחד עם הפקת גז שנתפסה על ידי צינור דורהאם מאמתת את המושבה כקולפורם מוחלט.

לאימות קוליפורם צואתי, מעבירים מושבות בצבע כחול לכלי זכוכית המכילים מדיום EC סטרילי וצינור דורהאם. מניחים את הצינורות המחוסנים לתוך אינקובטור. לאחר הדגירה, מחוסנים עטוריים בשילוב עם הפקת גז לאשר המושבה להיות קוליפורם צואה.

כדי לאשר enterococci צואה, aseptically להעביר מושבות חשודות עם המורפולוגיה הנכונה על המוח-לב עירוי אגר לוחות, ודגרה. לאחר מכן, העבר צמיחה ממושבה מבודדת על BHIA על שתי שקופיות זכוכית סטריליות.

הוסף 2-3 טיפות של 3% מי חמצן לאחת מגלשות הזכוכית. ייצור גז מהיר מצביע על חיידק קטלאז חיובי כגון סיטרובקטריה. חיידקי אנטוקוקי צואה הם קטלאז שליליים; לכן, לא נצפה מבעבע. עבור מושבות קטלס שליליות שאינן מציגות מבעבעות, בצעו כתם גרם. כמו אנתרוקוצ'י צואה, אלה צריכים להיראות חיובי גרם, ביצות בצורה, ולהיות מקובצים בעיקר בזוגות או שרשראות קצרות.

מציאת כל חיידקי אינדיקטור אלה במקור מים מצביעה על נוכחות של זיהום. אם יותר מ -5% מהדגימות נמצאו מזוהמות על פני תקופה של חודש, המקור עשוי להיחשב לא מתאים לצריכה אנושית.

סינון ממברנה משמש בדרך כלל במספר יישומים ביולוגיים, ואורגניזמים אינדיקטור צואה ניתן לזהות גם על ידי הליכים ניסיוניים אחרים. חלק מהיישומים האלה נחקרים כאן.

סינון ממברנה יכול לשמש גם ללכוד וירוס מדגימות מים. כמו וירוסים יהיו בדרך כלל נוכחים ברמות נמוכות מאוד, דגימות מים חייב להיות מרוכז על מנת ללכוד אותם לניתוח. לאחר מכן ניתן לשחרר וירוסים שנתפסו מהמסננים, ולזוהה באמצעות טכניקות כגון תתופעות של הדבקה בתרבית תאים או PCR.

סינון ממברנה משמש גם בייצור של מי טוהר גבוה לשימוש תעשייתי או במעבדה. תעשיות רבות דורשות מים מטוהרים מאוד לתהליכים התפעוליים שלהן, וסינון ממברנה יכול לשמש להסרת מזהמים, כולל מתכות ומלחים מומסים לא רצויים מהמים. זה יכול לשמש גם בהתפלה של מי מלח כדי לייצר מים ראויים לשתייה.

הרגע צפיתם בהקדמה של JoVE לזיהוי אורגניזמים אינדיקטוריים במים על ידי סינון ממברנה. עכשיו אתה צריך להבין איך ממברנה לסנן דגימות מים, איך תרבית כמה סוגים של חיידקי אינדיקטור צואה מן הממברנה, וכיצד לאשר אלה כמו אורגניזמים אינדיקטור. תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

סינון ממברנה משמש לכידת וירוס וריכוז ממים. וירוסים פתוגניים אנושיים נושאים מטען שלילי נטו בפתרונות ימיים, ולעתים קרובות נמצאים ברמות נמוכות במקורות מים. לכן הם חייבים להיות מרוכזים לפני הניתוח. סינון ממברנה הוא רק שיטת לכידה אחת למטרה זו, ומפעיל מסנן טעון שלילית. דגימות מים(למשל 1-L) של עניין מתוקנות עם תמיסת מלח(למשלמגנזיום כלוריד) כדי להקנות מטען חיובי לווירוסים, ובכך להקל על ספיחות שלהם למסנן קרום HA טעון שלילית כמו המים מסוננים. תמיסת חומצה בריכוז נמוך משמשת לשטיפת הממברנה ולהיפטר מלחים עודפים. ריכוז נמוך ונפח של נתרן הידרוקסיד משמש לאחר מכן כדי לשחרר את הווירוסים מהמסנן לפני ריכוזים ניתוחים נוספים (למשל בדיקות זיהום תרבית התא או PCR כמותי).

סינון ממברנה משמש גם בייצור של מים תהליך טוהר גבוה לשימוש תעשייתי. תעשיות רבות דורשות מים מטוהרים מאוד לתהליכים התפעוליים שלהן. סינון ממברנה(למשל ננו-סינון) משמש להסרת מזהמים כולל מתכות מומסות ומלחים מהמים. סינון ממברנה משמש גם בהתפלת מי מלח כדי לייצר מים ראויים לשתייה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter