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Isolamento dei batteri fecali da campioni di acqua mediante filtrazione
 
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Isolamento dei batteri fecali da campioni di acqua mediante filtrazione

Overview

Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba - Università dell'Arizona
Autore dimostrativo: Luisa Ikner

La qualità dell'acqua destinata all'uso in ambienti agricoli, ricreativi e domestici è di grande importanza a causa del potenziale di epidemie di malattie trasmesse dall'acqua. Gli agenti microbici implicati in tali eventi includono parassiti, batteri e virus che vengono versati in numero elevato nelle feci di persone e animali infetti. La trasmissione a ospiti nuovi e sensibili può quindi avvenire per via fecale-orale dopo l'ingestione di acqua contaminata. Pertanto, la capacità di monitorare le fonti d'acqua per la presenza di microrganismi patogeni è significativa al fine di garantire la salute pubblica.

A causa del numero e della varietà di potenziali patogeni fecali-orali che possono essere presenti nell'acqua e delle loro concentrazioni variabili, è poco pratico e costoso testare direttamente per ciascuno di essi su base regolare. Pertanto, i saggi microbiologici per il monitoraggio della qualità dell'acqua impiegano batteri indicatori coliformi. I coliformi comprendono, in parte, la normale microflora intestinale dei mammiferi a sangue caldo, non sono patogeni e sono costantemente escreti nelle feci. Pertanto, il rilevamento di batteri coliformi nell'acqua significa che si è verificato un rilascio fecale e che possono essere presenti anche microrganismi patogeni dannosi.

Principles

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La tecnica di filtrazione a membrana viene utilizzata per valutare la qualità microbiologica dell'acqua mediante analisi per i batteri indicatori fecali. Una quantità di acqua(ad esempio 100 ml) viene fatta passare attraverso un filtro a membrana specializzato con una dimensione media minima dei pori di 0,45 μm, facilitando la cattura dei batteri, poiché hanno una dimensione di circa 1 μm. Dopo la filtrazione, la membrana viene accuratamente applicata a un terreno di coltura specializzato di agarose e incubata nelle condizioni appropriate per la coltura dei microrganismi bersaglio.

Se applicata per l'uso nel monitoraggio della qualità dell'acqua, la filtrazione a membrana è ideale soprattutto per fonti a bassa torbidità come acqua potabile, piscine e acque ricreative naturali come laghi e bacini idrici. Le acque ad alto contenuto di particolato (ad esempio liquamigrezzi) provocano incrostazioni del filtro; pertanto, è possibile analizzare solo volumi più piccoli(ad esempio 100 ml). La filtrazione a membrana non è inoltre pratica per le fonti d'acqua con un gran numero di batteri di fondo (o non coliformi), il che può aumentare la difficoltà di enumerare i batteri coliformi bersaglio sul mezzo dell'acarosio dopo l'incubazione.

Questo video mostra la raccolta di acqua potabile e campioni di acqua ambientale, la filtrazione a membrana dei campioni e l'enumerazione di diversi tipi di colonie batteriche indicatori fecali utilizzando mezzi di crescita specializzati in agarose tra cui coliformi totali, coliformi fecali e enterococchi fecali. Vengono inoltre mostrati test condotti ulteriormente al fine di verificare le colonie presuntive.

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Procedure

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1. Raccolta e lavorazione dei campioni d'acqua

  1. Raccogliere diversi campioni di acqua da 1 L dalla fonte d'acqua di prova(ad esempio fontane d'acqua, piscine, serbatoi, sistemi di distribuzione dell'acqua, acque reflue grezze o trattate) e trasportare sul ghiaccio al laboratorio per l'analisi microbica.
  2. Sterilizzare o disinfettare il gruppo del collettore di filtrazione a membrana prima dell'uso in autoclave, esposizione a radiazioni UV (2 min) o accensione a fiamma di etanolo.
  3. Dopo il raffreddamento di tutte le parti, collegare correttamente il collettore a una pompa per vuoto e a un pallone per rifiuti di filtrazione sotto vuoto contenente candeggina.
  4. La fiamma di etanolo sterilizza un paio di pinze e con esse rimuove un filtro a membrana sterile e grigliato dalla sua confezione. In genere vengono utilizzate membrane di 47 mm di diametro con una dimensione dei pori di 0,45 μm. Tuttavia, è possibile utilizzare diametri e dimensioni dei pori alternativi a condizione che la dimensione dei pori possa intrappolare sufficientemente i microrganismi bersaglio e che almeno il 70% dell'area del filtro sia composta da spazio dei pori.
  5. Posizionare il filtro al centro dell'area di filtrazione a membrana del collettore e applicare un imbuto filtrante sterile all'unità e fissarlo in posizione.
  6. Misurare un volume desiderato di acqua di prova(ad esempio 100 ml) e aggiungerlo all'imbuto (un segno di linea di 100 ml è visibile sull'imbuto).
  7. Applicare un vuoto parziale [differenziale di pressione da 34 a 51 kPa (kiloPascal)] per prelevare il campione di prova attraverso il filtro. Il materiale solido sospeso totale, compresi i batteri e la materia organica in decomposizione, maggiore della dimensione media dei pori del filtro di 0,45 μm è intrappolato sul filtro. Particelle più piccole, inclusi virus e solidi disciolti come piccole quantità di materia organica e sali, passeranno attraverso la membrana e nel contenitore dei rifiuti contenente candeggina.
  8. Dopo il passaggio completo del campione attraverso il filtro, sciacquare l'interno dell'imbuto con due o tre volumi da 20-30 ml di acqua sterile.
  9. Spegnere il vuoto e rimuovere l'imbuto dal collettore alla chiusura del risciacquo finale.
  10. Con una pinzedina sterilizzata a fiamma di etanolo, rimuovere immediatamente il filtro a membrana dall'unità e posizionarlo prontamente sul mezzo di crescita agarose appropriato per il microrganismo bersaglio(la Tabella 1 elenca i mezzi di crescita raccomandati e le condizioni di incubazione per ciascuno).
  11. Applicare il filtro a membrana sulla superficie dell'agarose con un movimento a rullo per garantire il completo contatto della membrana con il mezzo di crescita ed evitare l'intrappolamento di bolle d'aria.
  12. Sostituire l'imbuto di filtrazione utilizzato con un'unità sterile tra la lavorazione di ciascun campione e disinfettare l'etanolo del collettore in acciaio inossidabile per prevenire la contaminazione incrociata.

2. Enumerazione delle colonie

  1. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere le piastre di crescita dall'incubatore per l'enumerazione.
  2. Idealmente, esegui i conteggi delle colonie con ingrandimento a bassa potenza utilizzando una fonte di luce bianca fredda.
  3. Coliformi totali
    1. Le colonie coliformi totali sono tipicamente di colore da rosa a rosso scuro con una lucentezza superficiale metallica. La lucentezza stessa può coprire parzialmente o completamente la colonia. Le morfologie atipiche delle colonie coliformi totali possono essere rosso scuro, mucoide o nucleate senza lucentezza.
    2. Le colonie che sono rosa, blu, bianche o incolori mentre mancano di lucentezza sono considerate non coliformi.
  4. Coliformi fecali
    1. Le colonie coliformi fecali appaiono come varie tonalità di blu.
    2. Le colonie coliformi non fecali sono di colore da grigio a crema.
  5. Enterococchi fecali
    1. Le colonie di enterococchi fecali vanno dal rosa al rosso scuro.

3. Verifica della colonia

  1. Coliformi totali
    1. Per una verifica presenza-assenza, tamponare l'intera membrana utilizzando un anello di inoculazione sterile. Per le colonie è preferibile verificarne almeno cinque ciascuna di morfologie tipiche e atipiche.
    2. Trasferire la colonia selezionata in un recipiente di vetro contenente brodo di lauril triptosio con un tubo di Durham. Incubare i tubi inoculati a 35±0,5 °C per 48 ore. La presenza di torbidità che indica la crescita in combinazione con la produzione di gas verifica la colonia come coliforme.
  2. Coliformi fecali
    1. Trasferire le colonie di colore blu in modo asettico in recipienti di vetro contenenti mezzo EC sterile con un tubo di Durham. Incubare i tubi inoculati a 44,5 ± 0,2 °C per 24 ore. La presenza di torbidità che indica la crescita in combinazione con la produzione di gas verifica la colonia come coliforme fecale.
  3. Enterococchi fecali
    1. Colpisci le colonie che caratterizzano la morfologia degli enterococchi fecali per l'isolamento in modo asettico sull'Agar per infusione cerebrale-cardiaca (BHIA) e incuba a 35 ± 0,5 °C per 24-48 ore.
    2. Trasferire la crescita da una colonia isolata su BHIA su due vetrini pre-puliti.
    3. Aggiungere da due a tre gocce di perossido di idrogeno al 3% agli strisci preparati sui vetrini. La rapida comparsa di bolle indica un risultato "catalasi positiva" e l'isolato non è un batterio streptococco fecale.
    4. Eseguire una colorazione di Gram per il test degli isolati come "catalasi negativa" (nessuna bolla osservata). Gli enterococchi fecali sono Gram-positivi, ovoidali e appaiono per lo più in coppie o catene corte.
Indicatore batterico fecale Supporti consigliati
(Temperatura di incubazione, tempo) 1
Coliformi totali LES Endo Agar (35 ± 5 °C, 24 h)
M-Endo Medium (35 ± 5 °C, 24 h)
Coliformi fecali m-FC Medium (44.5 ± 0.2 °C, 24 h)
Enterococchi fecali m Enterococcus Agar (35 ± 0.5 °C, 48 h)

Tabella 1. Mezzi di coltura di crescita comunemente utilizzati per la rilevazione di indicatori batterici fecali in campioni ambientali
1 Come raccomandato dai metodi standard per l'esame delle acque e delle acque reflue (American Public Health Asssociation and the American Water Works Association, 22nd Edition, 2012)

La filtrazione a membrana e la successiva coltura dei batteri raccolti è una tecnica utile per valutare la qualità e la pulizia di una fonte d'acqua.

La qualità dell'acqua destinata all'uso in ambienti agricoli, ricreativi o domestici è di grande importanza, a causa del potenziale di focolai di malattie trasmesse dall'acqua. Se l'acqua è contaminata da materia fecale proveniente da animali o esseri umani, parassiti patogeni, batteri o virus possono essere diffusi a nuovi ospiti al momento della loro ingestione. Il monitoraggio delle fonti d'acqua per tali organismi che causano malattie è quindi fondamentale per garantire la salute pubblica.

Il numero e la varietà di agenti patogeni fecali-orali che possono essere presenti in una fonte d'acqua rende poco pratico il dosaggio per ciascuno in modo indipendente e regolare. Invece, i comuni saggi microbiologici per la qualità dell'acqua utilizzano batteri indicatori coliformi. Per ulteriori informazioni su questo processo, vedere il video di questa raccolta sugli organismi indicatori.

Questo video illustrerà il processo di filtrazione a membrana su un campione di acqua ambientale, dimostrerà come coltura di diversi tipi di batteri indicatori fecali tra cui coliformi totali, coliformi fecali e entercocchi fecali e descriverà come verificare la presenza di contaminazione fecale.

La tecnica di filtrazione a membrana utilizza la pressione negativa per prelevare campioni d'acqua attraverso un filtro e intrappolare i batteri. Il filtro è una membrana specializzata con una dimensione media minima dei pori di 0,45 μm che consente la cattura di batteri, che in genere hanno una dimensione di circa 1 μm. Dopo la filtrazione, la membrana viene applicata ai mezzi di crescita dell'agarose e incubata in condizioni appropriate per la coltura dei microrganismi bersaglio.

Questa tecnica è ideale soprattutto per fonti a bassa torbidità come acqua potabile, piscine o laghi e bacini idrici. L'acqua ad alto contenuto di particolato può causare incrostazioni o intasamenti del filtro, limitando il volume che può essere elaborato. Inoltre, la filtrazione a membrana non è pratica per le fonti d'acqua contenenti un gran numero di batteri di fondo o non coliformi, come le acque reflue grezze, in quanto ciò può aumentare la difficoltà di enumerare i coliformi bersaglio durante la coltura e l'incubazione.

Una volta che i campioni batterici sono stati intrappolati nel filtro, possono essere trasferiti alle piastre di crescita per determinare i tipi di batteri indicatori presenti nei campioni di acqua. La placcatura su diversi tipi di supporti seleziona diversi tipi di batteri e può consentire una rapida identificazione.

Dopo la crescita su piastre specifiche di coltura, un'ulteriore conferma delle identità dei batteri indicatori può essere effettuata utilizzando tecniche come la raccolta di colonie in mezzi liquidi e l'utilizzo di tubi di Durham per catturare i gas, che dovrebbero essere prodotti solo in presenza di coliformi fecali o coliformi totali. Inoltre, i sospetti enterococchi fecali possono essere confermati da una combinazione di una colorazione di Gram positiva, insieme a un test negativo perossido-catalasi di idrogeno.

Ora che abbiamo familiarità con i principi alla base della filtrazione a membrana dei campioni d'acqua, diamo un'occhiata a come viene eseguita questa procedura.

Per iniziare la procedura, raccogliere prima i campioni d'acqua dalle fonti idriche di prova di interesse. Assicurarsi che i campioni siano raccolti in flaconi sterili da 1 L. Una volta completata la raccolta, mettere i campioni su ghiaccio e trasportarli in laboratorio per l'analisi microbica.

Per iniziare l'analisi, prima sterilizzare un collettore di filtrazione a membrana. Quindi, collegare il collettore a una pompa per vuoto e a un pallone per rifiuti di filtrazione contenente candeggina.

Le pinze a fiamma a etanolo sterilizzano e rimuovono una membrana sterile grigliata dalla confezione. Posizionare il filtro al centro dell'area di filtrazione a membrana del collettore e applicare un imbuto filtrante sterile all'unità, quindi fissarlo in posizione.

Misurare un volume desiderato di acqua di prova nell'imbuto. Applicare un vuoto parziale per disegnare il campione di prova attraverso il filtro. Il materiale solido sospeso, compresi batteri e altra materia organica, superiore a 0,45 μm sarà intrappolato su o all'interno del filtro, mentre particelle più piccole, virus e solidi disciolti passeranno nel pallone di scarto contenente candeggina.

Dopo che il campione è passato attraverso il filtro, risciacquare l'interno dell'imbuto con 25 ml di acqua sterile 3 volte, lasciando che questo passi attraverso il filtro. Quando il risciacquo finale è completo, scollegare il vuoto e rimuovere l'imbuto dal collettore.

Successivamente, l'etanolo sterilizza le pinze a fiamma e rimuove immediatamente il filtro a membrana dall'unità. Posizionarlo sulla piastra di crescita appropriata per il microrganismo bersaglio utilizzando un movimento di rotolamento per garantire il completo contatto con la superficie ed evitare di intrappolare bolle d'aria.

Per la lavorazione di ogni ulteriore campione, sanificare il collettore in acciaio inossidabile e utilizzare un imbuto sterile per prevenire la contaminazione incrociata. Infine, posizionare le piastre in un'incubatrice per il periodo di incubazione appropriato.

Dopo il periodo di incubazione, rimuovere le piastre dall'incubatore per l'enumerazione. Se possibile, eseguire i conteggi delle colonie con ingrandimento a bassa potenza utilizzando una fonte di luce bianca fredda. Per determinare i coliformi totali, identificare e contare le colonie che appaiono di colore da rosa a rosso scuro e hanno una lucentezza superficiale metallica che copre completamente o parzialmente la colonia. Le colonie di coliformi totali atipiche possono apparire rosso scuro, mucoide o nucleate senza lucentezza.

Le colonie che appaiono blu, bianche, incolori o rosa senza lucentezza sono considerate non coliformi e non dovrebbero essere incluse nel conteggio totale dei coliformi.

Le colonie di coliformi fecali appariranno come varie tonalità di blu e queste dovrebbero essere contate come una categoria separata. Le colonie coliformi non fecali sono tipicamente di colore da grigio a crema e dovrebbero anche essere registrate in una singola categoria. Infine, le colonie di enterococchi fecali andranno dal rosa al rosso scuro e dovrebbero essere contate separatamente.

Per verificare le colonie coliformi totali, applicare un ciclo di inoculazione sterilizzato e raffreddato a una singola colonia di interesse. Trasferire la colonia selezionata in un recipiente di vetro contenente brodo di lauril triptosio e un tubo di Durham. Quindi, posiziona le culture in un'incubatrice. La presenza di torbidità insieme alla produzione di gas catturato dal tubo di Durham verifica la colonia come un coliforme totale.

Per la verifica dei coliformi fecali, trasferire asetticamente colonie di colore blu in recipienti di vetro contenenti mezzo EC sterile e un tubo di Durham. Posizionare i tubi inoculati in un'incubatrice. Dopo l'incubazione, gli inoculati torbidi in combinazione con la produzione di gas confermano che la colonia è un coliforme fecale.

Per confermare gli enterococchi fecali, trasferire asetticamente le colonie sospette con la morfologia corretta su piastre di Agar per infusione cervello-cuore e incubare. Successivamente, trasferire la crescita da una colonia isolata su BHIA su due vetrini sterili.

Aggiungere 2-3 gocce di perossido di idrogeno al 3% su uno dei vetrini. La rapida produzione di gas indica un batterio positivo alla catalasi come Citrobacter. I batteri enterococchi fecali sono negativi alla catalasi; pertanto, non si osserva alcun gorgogliamento. Per le colonie negative alla catalasi che non mostrano gorgogliamento, eseguire una macchia di Gram. Come enterococchi fecali, questi dovrebbero apparire Gram positivi, di forma ovoidale, ed essere raggruppati per lo più in coppie o catene corte.

Trovare uno di questi batteri indicatori in una fonte d'acqua indica la presenza di una contaminazione. Se più del 5% dei campioni risulta contaminato per un periodo di un mese, la fonte può essere considerata inadatta al consumo umano.

La filtrazione a membrana è comunemente usata in una serie di applicazioni biologiche e gli organismi indicatori fecali possono anche essere rilevati da altre procedure sperimentali. Alcune di queste applicazioni sono esplorate qui.

La filtrazione a membrana può essere utilizzata anche nella cattura di virus da campioni d'acqua. Poiché i virus saranno in genere presenti a livelli molto bassi, i campioni di acqua devono essere concentrati per catturarli per l'analisi. I virus catturati possono quindi essere rilasciati dai filtri e identificati utilizzando tecniche come i saggi di infettività delle colture cellulari o la PCR.

La filtrazione a membrana viene anche utilizzata nella produzione di acqua ad alta purezza per uso industriale o di laboratorio. Molte industrie richiedono acqua altamente purificata per i loro processi operativi e la filtrazione a membrana può servire a rimuovere i contaminanti, compresi i metalli disciolti indesiderati e i sali dall'acqua. Può anche essere utilizzato nella desalinizzazione dell'acqua salata per produrre acqua potabile.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'identificazione degli organismi indicatori nell'acqua mediante filtrazione a membrana. Ora dovresti capire come filtrare i campioni di acqua a membrana, come coltura di diversi tipi di batteri indicatori fecali dalla membrana e come confermarli come organismi indicatori. Grazie per l'attenzione!

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Applications and Summary

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La filtrazione a membrana viene utilizzata nella cattura e nella concentrazione del virus dall'acqua. I virus patogeni umani portano una carica negativa netta nelle soluzioni acquatiche e sono spesso presenti a bassi livelli nelle fonti d'acqua. Pertanto devono essere concentrati prima dell'analisi. La filtrazione a membrana è solo un metodo di cattura per questo scopo e impiega un filtro caricato negativamente. I campioni di acqua(ad es. 1-L) di interesse vengono modificati con una soluzione salina(ad esempiocloruro di magnesio) per conferire una carica positiva ai virus, facilitando così il loro adsorbimento al filtro a membrana HA caricato negativamente mentre l'acqua viene filtrata. Una soluzione acida a bassa concentrazione viene utilizzata per risciacquare la membrana e liberarla dai sali in eccesso. Una bassa concentrazione e volume di idrossido di sodio viene quindi utilizzato per rilasciare i virus dal filtro prima di ulteriori concentrazioni e analisi(ad esempio saggi di infettività delle colture cellulari o PCR quantitativa).

La filtrazione a membrana viene anche utilizzata nella produzione di acqua di processo ad alta purezza per uso industriale. Molte industrie richiedono acqua altamente purificata per i loro processi operativi. La filtrazione a membrana(ad esempio la nanofiltrazione) serve a rimuovere i contaminanti, compresi i metalli disciolti e i sali dall'acqua. La filtrazione a membrana viene anche utilizzata nella desalinizzazione dell'acqua salata per produrre acqua potabile.

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