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Cromatografía en columna

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Cromatografía en columna es un método de purificación versátil que se utiliza para separar los compuestos en una solución. Una mezcla de solución es llevada por un disolvente a través de una columna que contiene un adsorbente sólido, llamado la fase estacionaria. La mezcla de solvente y la muestra se llama la fase móvil.

Moléculas en la fase móvil viajan a través de la columna a diferentes ritmos, basado en sus propiedades químicas y su afinidad por la fase estacionaria. Así, cada uno de ellos sale la columna a la vez diferentes. Una vez que los compuestos han sido separados y purificados pueden ser procesados o están listos para su distribución. Este video será introducir los fundamentos de la cromatografía de columna, luego Mostrar la técnica con la purificación de compuestos orgánicos.

En cromatografía en columna, las moléculas de absorber reversible a la fase estacionaria como fluyen a través de la columna, de tal modo retardando su progreso. Compuestos que interaccionan débilmente con la fase estacionaria son más rápidos salir de la columna, o eluir. Compuestos que interactúan fuertemente con la fase estacionaria son más lentos a fin de eluir. La fase estacionaria es un adsorbente en polvo o gel como gel de sílice o alúmina. Gel de sílice y alúmina son altamente polares por lo que interactúan fuertemente con disolventes y compuestos polares y débilmente con las moléculas no polares. La fase estacionaria es cargada a la columna como una mezcla con el solvente y luego es embalada por el flujo solvente a través de la fase estacionaria. Cuando está correctamente embalado, la fase estacionaria es homogénea de arriba a abajo y sin burbujas de aire o parches secos, como flujo irregular causado por estas irregularidades interfiere con la separación de compuestos. El disolvente o eluyente, es normalmente un disolvente orgánico de un embalse. En general, solventes no polares sólo elución los compuestos no polares, mientras que los solventes polares elución compuestos polares y no polares. Si una mezcla contiene compuestos de polaridad significativamente diferentes, puede utilizarse una serie de solventes polares cada vez más a fin de eluir todos los compuestos de interés. La tasa de flujo de fase móvil es generalmente controlada por una válvula de cierre en la parte inferior de la columna. Pausas en el flujo se mantienen al mínimo para evitar la difusión de los compuestos. La fase móvil, dejando la columna, el efluente se recoge en fracciones para preservar la separación de compuestos. Ahora que usted entiende los principios de la cromatografía en columna, vamos a ir a través de un procedimiento para la purificación de una mezcla de compuestos orgánicos.

Para comenzar el procedimiento, obtener el equipo como se indica en el texto. Pesar un matraz de fondo redondo para cada compuesto para aislarse y registrar la masa. A continuación, pesar la muestra y disolver en el mínimo volumen de disolvente necesitada. El disolvente apropiado debe predeterminado utilizando cromatografía en capa fina. El valor de Rf debe estar entre 0.2-0.3. Luego, determinar la cantidad de gel de sílice necesaria para la fase estacionaria, basada en el peso seco de la muestra y la diferencia en la distancia de migración de los compuestos de interés basándose en la proyección previa del TLC. Vierta la cantidad adecuada de gel de sílice en un matraz Erlenmeyer. Agregar el solvente al gel de silicona hasta que la mezcla es translúcida y se mueve libremente cuando se remolina el frasco. A continuación, seleccione una columna lo suficientemente grande como para que el gel de sílice se llenará hasta la mitad. Si la columna no tiene una frita de vidrio, colocar lana de vidrio en la columna y presione firmemente hacia abajo con una varilla larga. Cubrir la lana de vidrio con unos 2 cm de arena para impedir la pasando por la lana de vidrio de sílice. En una campana extractora abrazadera de la columna a un soporte de anillo, dejando espacio suficiente para alojar los tubos de ensayo.

Colocar un embudo en la columna y asegurar que la llave de paso esté cerrada. Vierta la mezcla en la columna, golpeando suavemente los lados como la mezcla se instala para excluir las burbujas de aire. Enjuagar el embudo, matraz y las paredes de la columna con el disolvente para transferir todo el gel en la columna.

Coloque un matraz Erlenmeyer debajo de la columna. Abrir la llave de paso permite el solvente drenar en el matraz hasta que el nivel de disolvente es justo sobre el gel de sílice y luego cierre la llave de paso. Verter unos 2 cm de arena sobre el gel. Enjuagar suavemente cualquier arena pegada a los lados de la columna con el disolvente. Drene el disolvente según sea necesario para que la arena es sobre todo seco, pero sigue siendo la silicona completamente cubierto.

Para iniciar la separación, añada la muestra a la columna sin molestar a la arena. Utilizar pequeñas porciones de disolvente para enjuagar cualquier muestra adhiriéndose a las paredes de la columna y enjuagar el recipiente de la muestra. Con cuidado drene el disolvente hasta que el nivel justo encima de la silicona. Luego, con una pipeta, añadir suavemente 4 – 5 mL de disolvente sin alterar la capa de arena. Colocar un embudo en la columna y llene lentamente con el solvente. Retirar el matraz y reemplácelo con un tubo de ensayo rotulado. Con el primer tubo en su lugar, abra la llave de paso y recoger el eluído hasta que el tubo está casi lleno.

Continuar recogiendo fracciones hasta que se eluyen todos los compuestos deseados, proceder secuencialmente a través de los tubos de ensayo etiquetados. Cuando haya terminado, cierre la llave de paso.

Para cada compuesto aislado, combinar las fracciones puras en un matraz de fondo redondo previamente pesado. Eliminar el solvente del frasco en un evaporador rotatorio y luego pesar el matraz de fondo redondo que contiene el compuesto seco. Para obtener más información, vea el vídeo de la colección en evaporación rotatoria.

Esta muestra contiene una mezcla de tetraphenylporphyrin, o TPP y Fluorenona. El TPP rojo púrpura oscuro eluyó en primer lugar, seguido por el amarillo Fluorenona. La pureza de cada compuesto aislado fue confirmada por espectroscopia de RMN.

Cromatografía en columna se utiliza en la purificación y análisis en una variedad de campos científicos.

Cromatografía líquida de alto rendimiento, o HPLC, es una forma de cromatografía en columna que proporciona excelente separación entre compuestos y puede incorporar detectores especializados como un detector de radiación radiactiva moléculas. Utilizando HPLC, un fosfolípido radiactivo puede fácilmente aislado de una mezcla de muchos otros aunque lo constituye un pequeño porcentaje de la mezcla. Esta información puede ayudar a aclarar la producción, regulación y funciones de muchas biomoléculas importantes.

La cromatografía flash es una variante de la cromatografía en columna en la que la fase móvil se mueve a través de la columna bajo la presión de aire o gas en lugar de flujo por gravedad solamente.

Esto crea un flujo más rápido, minimiza la difusión para una mejor separación. El compuesto deseado se recoge en unas fracciones puros, concentrados, como se muestra con cromatografía en capa fina, resultando en pureza y excelente rendimiento de la purificación.

El aparato de columna generalmente no es apropiado para la separación de pequeños volúmenes, pero algunas mezclas no son compatibles con técnicas especializadas como la HPLC. Purificación en pequeña escala se realiza con columnas de pipeta de vidrio, con un bulbo de pipeta usado para cromatografía flash en pequeña escala. Esto es particularmente útil al preparar una muestra para las técnicas de purificación especializada o como paso final después de la purificación a gran escala.

Sólo ha visto la introducción de Zeus para cromatografía en columna. Ahora debe estar familiarizado con los principios de la cromatografía de columna, un procedimiento para la cromatografía de columna de gel de silicona y algunas aplicaciones de la técnica.

¡Gracias por ver!

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