Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Analytical Chemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

תקנים פנימיים

Overview

מקור: המעבדה של ד"ר .B ג'יל וטון - אוניברסיטת וירג'יניה

המטרה של ניתוחים כימיים רבים היא ניתוח כמותי, שבו נקבעת כמות החומר במדגם. על מנת לחשב במדויק את הריכוז של לא ידוע מדגם, הכנת מדגם זהיר הוא המפתח. בכל פעם שדגימה מטופלת או מועברת, חלק מהדגימה עלולה ללכת לאיבוד. עם זאת, ישנן אסטרטגיות למזעור אובדן מדגם. ישנן גם אסטרטגיות להתמודדות עם אובדן מדגם ועדיין לבצע מדידות מדויקות של ריכוז.

כדי למזער אובדן מדגם, האידיאל הוא למזער את מספר שלבי הטיפול וההעברה לדוגמה. לדוגמה, עיסוי מדגם מוצק ישירות לתוך בקבוקון שפתרון ייעשה בהפחתת שלב העברה. אם יש צורך לעבור מבקבוקון אחד למשנהו ודילול נעשה, אז שטיפה משולשת של כלי הזכוכית מסייעת להבטיח את כל המדגם מועבר. אסטרטגיות אחרות ספציפיות יותר לדגימה. לדוגמה, דגימות כי ספיחות לזכוכית, כגון חלבונים, עשוי להיות מטופל טוב יותר צינורות חד פעמיים פוליפרופילן. הצינורות אינם הידרופיליים, כך שאם יש להזרים כמות קטנה של דגימה במים, עדיף שכבר הוסיפו את המים לצינור, כך שניתן יהיה להזרים את הדגימה ישירות לממס. זה יכול להיות טוב יותר להתרכז, ולא יבש לחלוטין מדגם, עקב הפסדים של אי-מסיסות לאחר rehydration.

מקור נוסף לאובדן מדגם הוא באמצעות מניפולציות מדגם לא שלמות. לדוגמה, אם נעשה שימוש בהליך נגזרת והנגזרת אינה שלמה, לא נצפתה כמות הדגימה המלאה. שגיאות כגון זו הן שגיאות שיטתיות, וניתן לפתור אותן על-ידי תיקון הבעיה, כגון שינוי הליך ההפקה. סיבה נוספת לשגיאה שיטתית במדידות היא אפקטי מטריצה. אלה יכולים להפריע למדידה של חומרים מסוימים וביצוע כיולים באותה מטריצה כמו המדגם יכול להפחית את האפקט הזה.

ניתוח כמותי מתבצע בדרך כלל באמצעות תקנים חיצוניים או פנימיים. עבור סטנדרטים חיצוניים, עקומת כיול נעשית על ידי מדידת ריכוזים ידועים שונים של ניתוח העניין. לאחר מכן, המדגם מופעל בנפרד מהתקן. עבור סטנדרטים פנימיים, התקן נמצא באותה מדגם כמו ניתוח העניין, ומאפשר את המדידה להילקח בו זמנית. בדרך כלל, מינים שונים מתווספים הנקראים התקן הפנימי והיחס בין התגובה עבור תקן פנימי זה לבין הניתוח מחושב. הרעיון הוא שהיחס בין התגובה, הנקרא גורם התגובה, הוא פרופורציונלי לריכוז שלהם. בעוד שהשיטה חייבת להיות מסוגלת להבחין בין ניתוח העניין לבין התקן הפנימי, כל הפסדי מדגם המתרחשים לאחר הוספת התקן הפנימי צריכים להיות דומים עבור שני החומרים ולכן היחס של התגובה נשאר זהה. מקרה מיוחד של שימוש בתקנים פנימיים הוא השיטה של תוספות סטנדרטיות, שבה כמויות הולכות וגדלות של הניתוח מתווספות לפתרון והכמות המקורית של הניתוח מחושבת לאחור. תקנים פנימיים יכולים לשמש כרומטוגרפיה, אלקטרוכימיה, ספקטרוסקופיה.

Principles

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תקן פנימי הוא חומר המתווסף בכמות קבועה לדגימה, ריקה וסטנדרט בניתוח. תקן פנימי יכול לפצות על שגיאות שיטתיות ואקראיות כאחד. לדוגמה, אם יש תנודות מכשיר הגורמות לשגיאות אקראיות במדידה, תנודות אלה צפויות להיות זהות הן עבור התקן הפנימי והן עבור הניתוח ולכן יחס האותות אינו משתנה. עבור שגיאות שיטתיות, כגון השפעות מטריצה של הממס, כל עוד האפקט שווה הן לתקן והן לאנתח, היחס שוב אינו מושפע.

החיסרון של סטנדרטים פנימיים הוא שקשה למצוא סטנדרט פנימי מתאים. התקן הפנימי חייב להיות אות הדומה לאנתח, אך שונה מספיק כדי שניתן להבחין בו על ידי המכשיר. כמו כן, התקן הפנימי לא צריך להיות נוכח במטריצה לדוגמה, כך התקן הנוסף הוא המקור היחיד של התקן. מדי פעם, מרכיב מרכזי של מדגם כי הוא קבוע בריכוז יכול לשמש כסטנדרט הפנימי במקום תקן נוסף, אבל הריכוז חייב להיות ידוע היטב עבור בוחר זה. התקן הפנימי גם לא צריך לדכא או לשפר את האות של הניתוח.

בכרומטוגרפיה, אחד ממקורות השגיאה הגדולים ביותר הוא לעתים קרובות הזריקה. אם נעשה שימוש בזריקות ידניות, ייתכנו שגיאות בטעינת המזרק כראוי. נפחים הם בדרך כלל קטנים (~ 1 μL) ולכן יש אי ודאות בהזרקה לנפח קטן זה, לעתים קרובות כמה אחוזים סטיית תקן יחסית (RSD). בכרומטוגרפיה של גז (GC), המדגם מוזרק ליציאה מחוממת ואידוי מקצה המחט יכול לגרום לשינויים בנפח המוזרק. דוגמים אוטומטיים עוזרים הן עם השגיאה בטעינת המזרק והן עם השגיאה בהזרקה מהירה כדי למנוע אידוי ב- GC, אך השגיאה עדיין יכולה להיות RSD של 1-2%. עם כרומטוגרפיה, אזור השיא משמש בדרך כלל במקום גובה שיא, כמו הפסגות לקבל רחב יותר וקצר יותר עם הזמן אבל אזור השיא הוא קבוע. לכן, עבור סטנדרטים פנימיים, היחסים של אזורי שיא משמשים כרומטוגרפיה במקום גבהים שיא.

עבור כיול עם תקן פנימי, מחושב גורם תגובה. גורם התגובה (R) הוא היחס בין הפסגות בהשוואה ליחס הריכוזים שבהם X הוא הניתוח ו- IS הוא התקן הפנימי.

Equation 1

עבור אזור כרומטוגרפיה (A) משמש. ניתן לחשב את גורם התגובה מתיבת כיול שלA X/AIS לעומת CX/CIS, כאשר גורם התגובה הוא השיפוע והניחו את יירוט ה- y כ- 0. לאחר שגורם התגובה ידוע בתקנים, ניתן לחשב את תגובת הלא נודע מיחס השטח הנמדד מהניסוי.

Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. טיפול נכון בדוגמיות: יצירת פתרון

  1. קח נקייה מסה את הכמות הנכונה של מדגם לתוכו. הקלט את המסה בפועל בשימוש. בדוגמה זו, פתרון של אדנין נעשה בקבוק נפחי לשימוש כסטנדרט פנימי לניתוח הבא. המסה של אדנין היא 100 מ"ג. אין להמיס ישירות לתוך בקבוק נפחי מכיוון שיש לו צוואר ארוך ולא ניתן להוסיף או להסיר את האדנין בקלות.
  2. הוסף בערך 25 מל של ממס (במקרה זה דימתיל סולפוקסיד (DMSO)) על ולתת לו לערבב להתמוסס. בדוגמה זו, הפתרון הסופי נעשה בבקבוק נפחי של 50 מ"ל, כך שרק להוסיף כ 25 מ"ל כך שניתן לשטוף את הכיס ואת הפתרון מורכב עד הנפח הסופי.
  3. לאחר המוצק נמס, לשפוך את הפתרון לתוך הבקבוק נפחי.
  4. שוטפים את הכיס ואת בר המערבבים בכמויות קטנות של ממס, כ -10 מ"ל, ויוצקים את השטיפה לתוך הבקבוק הנפחי. חזור פעמיים נוספות. פעולה זו מסייעת להבטיח העברת פתרון נכונה.

2. הכנת עקומת כיול סטנדרטית פנימית

  1. הכן את הדגימות הסטנדרטיות הרצויות לניתוח כרומטוגרפיה של גז. בדוגמה זו, קפאין מופק מקפה באמצעות acetonitrile ולאחר מכן אדנין משמש כסטנדרט פנימי למדידה.
  2. עבור דגימות קפאין, לשקול את כמות המדגם הדרוש כדי להפוך 1 מ"ג / מ"ל מדגם. אם משתמשים בבקבוק נפחי של 10 מ"ל, זה 10 מ"ג.
  3. שוקלים את הניתוח לכוס, מוסיפים כמה מ"ל של ממס (כאן מתנול) להתמוסס, ואז מעבירים כמותית לבקבוק הנפחי באמצעות 3 שטיפות.
  4. הפוך 3 סטנדרטים נוספים באופן דומה עם 0.2, 0.5, ו 2 מ"ג / מ"ל קפאין.
  5. שים 1 מ"ל של כל תקן קפאין לתוך בון מדגם.
  6. יש להוסיף 0.2 מ"ל של 2 מ"ג/מ"ל תקן פנימי של אדנין לכל מקטורן מדגם.
  7. תריץ את ניסוי הכרומטוגרפיה של הגז עם כל תקן קפאין. עבור כל כרומטוגרמה, לחשב את היחס של אזורי שיא עבור קפאין לעומת התקן.
  8. הפוך חלקה של יחס השטח לעומת יחס הריכוז. השיפוע של העלילה הזו הוא גורם התגובה.

3. הכנת מדגם אמיתי עם תקן פנימי לכרומטוגרפיה של גז

  1. הכן את המדגם הרצוי לניתוח כרומטוגרפיה גז. בדוגמה זו, קפאין מופק מקפה באמצעות acetrontrile.
  2. לדגימת הקפה, יש להוציא 2 גרם קפה לתוך של 100 מל. תקליט את המשקל המדויק של הקפה.
  3. הוסף 20 מ"ל של acetonitrile לכלוב.
  4. אפשר לו לשבת במשך 20 דקות, תוך ערבוב לעתים קרובות.
  5. מסננים את טחנות הקפה באמצעות נייר סינון במשפך.
  6. לשטוף את נייר המסנן 3x עם כמויות קטנות של acetonitrile (5 מ"ל).
  7. מדוד את עוצמת הקול הסופית של הסינון. זה צריך להיות בערך 35 מ"ל.

4. הפעל את המדגם וחשב את הריכוז

  1. קח 1 מ"ל של דגימת תמצית קפה ולהוסיף 0.2 מ"ל של התקן הפנימי בוויאל. מקם את הקרבון בארון סמפלר אוטומטי.
  2. תריץ ניתוח GC של המדגם. ודא כי תנאי GC הם כאלה קפאין ואדנין להפריד. בדוגמה זו, הפרדות איזותרמיות מבוצעות ב 200 °C (50 °F).
  3. לאחר הניתוח, לחשב את אזור השיא הן עבור פסגת הסטנדרט הפנימית ואת שיא האנליטים. באמצעות היחסים שלהם, לחשב את כמות הקפאין במדגם.

5. תוצאות: ניתוח GC של קפאין עם תקן פנימי

  1. ניתוח GC של קפאין מוצג באיור 1. אדנין משמש כסטנדרט פנימי. ניתן למדוד ולתוות את היחס בין אזורי השיא לעומת היחס בין הריכוזים. השיפוע של העלילה הוא גורם התגובה (במקרה זה 1.8).
  2. איור 2 מציג כרומטוגרמה של דגימת קפה עם תקן פנימי של אדנין. היחס של אזור השיא הוא 1.78. באמצעות גורם התגובה ואת הריכוז הידוע של אדנין (0.33 מ"ג/מ"ל), ריכוז הקפאין במדגם הלא ידוע מחושב להיות 0.33 מ"ג/מ"ל.

Figure 1
איור 1. התוויית כיול באמצעות תקן פנימי. חלקה של יחסי השטח לעומת יחסי ריכוז עבור 3 דגימות סטנדרטיות של קפאין (1, 0.5, ו 0.2 מ"ג / מ"ל) עם תקן פנימי אדנין 0.33 מ"ג / מ"ל הוסיף לכל אחד. השיפוע של הקו הוא 1.8, שהוא גורם התגובה.

Figure 2
איור 2. כרומטוגרמה של קפה עם תקן פנימי אדנין. עלילה של התגובה של גלאי FID לדגימות. שלוש הפסגות העיקריות הן אדנין (IS), קפאין וחומצה פלמיטית.

אובדן מדגם יכול להתרחש בכל פעם מדגם מטופל או מועבר, ובכך עושה חישובים מדויקים של ריכוז קשה.

כדי להבטיח דיוק, יש למזער את ההשפעות של אובדן מדגם באמצעות הכנת מדגם זהירה ועל ידי הגבלת מספר שלבי הטיפול וההעברה לדוגמה. עם זאת, אובדן מדגם יכול להתרחש גם עקב שגיאות שיטתיות, כגון מניפולציה מדגם לא שלם, אפקטי מטריצה, וריאציות בהליך אנליטי.

מקורות אובדן אלה ניתן להסביר על ידי הוספת ריכוז ידוע של מין דומה, אך לא זהה, לתרכובת העניין. זה נקרא תקן פנימי. כל אובדן מדגם המתרחשים בתקן הפנימי צריך להיות דומה עבור הניתוח, ומאפשר את הריכוז להיות מחושב במדויק.

וידאו זה ימחיש את השימוש בטכניקת מעבדה סטנדרטית ונכונה פנימית כדי להסביר אובדן מדגם בעת קביעת הריכוז של לא ידוע.

תקן פנימי הוא חומר שנוסף בכמות ידועה לתקנים, דגימות וריק במהלך ניתוח.

בכרומטוגרפיה וספקטרוסקופיה, היחס בין האות עבור התקן הפנימי והניתח מחושב. יחס זה, הנקרא גורם התגובה, הוא פרופורציונלי ליחס של הניתוח והריכוזים הסטנדרטיים.

גורם התגובה, R, יכול לבוא לידי ביטוי על ידי המשוואה הבאה, כאשר A מייצג את האותות האנליטיים של המדגם ואת התקן הפנימי ו- C מייצג את הריכוזים של המדגם ואת התקן הפנימי.

תקן פנימי יכול לפצות על שגיאות שיטתיות ואקראיות כאחד. לדוגמה, שגיאות אקראיות - כגון חוסר עקביות בעת מדידת מדגם-יהיו זהות הן עבור התקן הפנימי והן עבור הניתוח. לכן, היחס של האותות שלהם לא ישתנה.

עבור שגיאות שיטתיות, כגון אפקטי מטריצה בפתרון, היחס לא יושפע כל עוד אפקט המטריצה שווה הן לתקן והן לאנתח.

בעוד סטנדרטים פנימיים מספקים תועלת רבה, זה יכול להיות קשה לבחור אחד מתאים. תקן פנימי חייב להיות אות דומה, אך לא זהה, לאנתח. זה גם לא יכול להשפיע על מדידת הניתוח בכל דרך שהיא.

לבסוף, הריכוז חייב להיות ידוע היטב. זה מושג על ידי הבטחת כי התקן הפנימי אינו נוכח באופן מקורי במדגם; לכן, המקור היחיד של זה בפתרון הוא הריכוז הידוע הוסיף.

בניסוי הבא, ריכוז הקפאין במדגם לא ידוע ייקבע על ידי כרומטוגרפיה גז.

זה מושגת על ידי יצירת עקומת כיול באמצעות פתרונות קפאין ידועים, עם אדנין כסטנדרט הפנימי. השיפוע של עקומת הכיול שווה לגורם התגובה.

ברגע שגורם התגובה ידוע, ניתן לחשב את הריכוז של הלא נודע מיחס אזור הכרומטוגרמה הנמדד שלו.

עכשיו שאתם מבינים את היסודות של סטנדרטים פנימיים, בואו נסתכל על ההליך.

כדי להתחיל את ההליך, לשקול במדויק 100 מג של התקן הפנימי, אדנין, לתוך נקייה.

לאחר מכן, להמיס אותו בערך 20 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד, ולערבב את הפתרון.

לאחר אדנין נמס, לשפוך את הפתרון לתוך בקבוק נפחי 50 מ"ל.

שוטפים את הכיס ומערבבים בר עם 10 מ"ל של DMSO, ויוצקים את השטיפה לתוך הבקבוקון. חזור על שטיפה זו פעמיים, כדי להבטיח העברת פתרון נכונה. מלא לסימן הכיול, וכתוצאה מכך תקן פנימי עם ריכוז של 2 מ"ג / מ"ל.

לאחר מכן, לשקול 100 מג קפאין לתוך כדי להכין פתרון מלאי. ממיסים את הקפאין עם כמות קטנה של מתנול. לאחר מכן, השתמש 3 שטיפות כדי להעביר פתרון זה בקבוק נפחי טרי 25 מ"ל. זהו פתרון מלאי 4 mg / mL. השתמש בו כדי ליצור 3 תקני קפאין.

לאחר מכן, הוסף 0.2 מ"ל מהתקן הפנימי, אדנין, לכל בקבוקון. מלאו כל אחד עד הכרך הסופי במתנול. מעבירים כל פתרון לתקלה לדוגמה.

הפעל כל תקן קפאין באמצעות כרומטוגרפיה גז. לחשב את היחס של אזורי שיא עבור קפאין לעומת תקן אדנין.

ראשית, לשקול 2 גרם של קפה לתוך 100 מל, ולרשום את המשקל.

לאחר מכן, להוסיף 20 מ"ל של מתנול כדי לחלץ את הקפאין מן הקפה. אפשר לפתרון לערבב במשך 20 דקות.

באמצעות משפך Büchner, לסנן את טחנות הקפה. לשטוף את עם כמות קטנה של מתנול, ויוצקים את השטיפה לתוך משפך. חזור על השטיפה פעמיים.

מדוד את הנפח הסופי של הסינון; זה צריך להיות בערך 35 מ"ל.

כדי להכין את המדגם לניתוח, להוסיף 1 מ"ל של תמצית קפה לפקיל מדגם. לאחר מכן, הוסף 0.2 מ"ל מהתקן הפנימי של אדנין, והכנס את הקרבון לארון הדגימה האוטומטי של המכשיר.

הפעל ניתוח כרומטוגרפיה גז של המדגם, להבטיח כי התנאים הם כאלה כי קפאין ואדנין הם נפרדים.

לאחר השלמת הניתוח, חשב את אזור השיא הן עבור התקן הפנימי והן עבור הניתוח.

לאחר כל הדגימות נותחו, ניתן לקבוע את עקומת הכיול הסטנדרטית עבור פתרונות הקפאין/ אדנין על ידי התוויית היחסים של אזורי השיא לעומת היחסים של הריכוזים. השיפוע של קו זה, המייצג את גורם התגובה, היה 1.8.

לאחר מכן, נתוני GC מדגם הקפה שחולץ מנותח. היחס בין אזורי השיא חושב להיות 1.78. באמצעות גורם התגובה ואת הריכוז הידוע של התקן הפנימי, אדנין, ריכוז הקפאין במדגם הלא ידוע חושב להיות 0.33 מ"ג / מ"ל.

סוגים רבים ושונים של תגובות, על פני תלמידים מדעיים שונים, משתמשים בסטנדרטים פנימיים כדי למזער את ההשפעות של טעויות ואובדן מדגם.

ההשפעות של אובדן מדגם נתקל במהלך הכנת מדגם ניתן למזער באמצעות סטנדרטים פנימיים, שמירה על יחס הריכוז שלהם כמעט קבוע.

בדוגמה זו, שומנים ביואקטיביים חולצו מתאים lysed באמצעות תהליך מיצוי נוזל נוזלי. תקנים פנימיים איזוטופ יציב נוספו בתחילת החילוץ כדי להסביר שגיאות במהלך הכנת המדגם.

סטנדרטים פנימיים היו לא רק קריטיים להכנת שומנים ביואקטיביים, אלא גם לניתוח. השומנים הופרדו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, ונותחו באמצעות ספקטרומטריית מסה.

בספקטרוסקופיה, תקנים פנימיים יכולים לעזור לתקן שגיאות אקראיות עקב שינויים בעוצמת מקור האור. אם מנורה או מקור אור אחר יש כוח משתנה, זה ישפיע על הספיגה וכתוצאה מכך, פליטה של מדגם. עם זאת, היחס בין תקן פנימי לאנתח יישאר קבוע, גם אם מקור האור לא.

בכרומטוגרפיה, אחד ממקורות השגיאה הגדולים ביותר הוא ההזרקה. דוגמים אוטומטיים מסייעים למזער זאת, אך שגיאה עדיין יכולה להיות סטיית תקן יחסית של 1%-2%.

בדוגמה זו, תקני אדים המכילים תקן פנימי נותחו באמצעות כרומטוגרפיה של גז כדי ליצור עקומת כיול. לאחר השלמת זה, המדגם הלא ידוע יכול להימדד ואז ההפסדים עקב התנודתיות של המדגם היוו.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לסטנדרטים פנימיים. כעת עליך להבין שיטות עבודה מומלצות למזעור אובדן מדגם, תקנים פנימיים וגורמי תגובה.

תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תקנים פנימיים משמשים בתחומים רבים, כולל ספקטרוסקופיה וכרומטוגרפיה. בספקטרוסקופיה, תקנים פנימיים יכולים לעזור לתקן שגיאות אקראיות עקב שינויים בעוצמת מקור האור. אם מנורה או מקור אור אחר יש כוח משתנה, זה ישפיע על הספיגה וכתוצאה מכך, פליטה של מדגם. עם זאת, היחס בין תקן פנימי לאנתח יישאר קבוע, גם אם מקור האור לא. דוגמה אחת לכך היא שימוש ליתיום (Li) כסטנדרט פנימי לניתוח של נתרן בדגימת דם על ידי ספקטרוסקופיית להבה. לי דומה מבחינה כימית לנתרן אך אינו נמצא באופן מקומי בדם.

עבור כרומטוגרפיה, סטנדרטים פנימיים משמשים לעתים קרובות הן כרומטוגרפיה גז כרומטוגרפיה נוזלית. עבור יישומים עם ספקטרומטריית מסה כמו הגלאי, התקן הפנימי יכול להיות ניתוח איזוטופי שכותרתו, כך המשקל המולקולרי (MW) יהיה שונה מאשר ניתוח של עניין. תקנים פנימיים משמשים בדרך כלל ניתוחים פרמצבטיים או סביבתיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter