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Analytical Chemistry

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Overview

출처: 박사의 실험실.B 질 벤턴 - 버지니아 대학

많은 화학 분석의 목표는 정량 분석이며, 시료의 물질의 양이 결정됩니다. 시료로부터 알 수 없는 농도를 정확하게 계산하기 위해서는 주의 깊은 시료 준비가 핵심이다. 샘플을 처리하거나 전송할 때마다 일부 샘플을 손실할 수 있습니다. 그러나 샘플 손실을 최소화하기 위한 전략이 있습니다. 또한 시료 손실에 대처하고 농도를 정확하게 측정하기 위한 전략도 있습니다.

샘플 손실을 최소화하기 위해 시료 처리 및 전송 단계 수를 최소화하는 것이 이상적입니다. 예를 들어, 솔리드 샘플을 플라스크에 직접 매스하여 용액이 전달 단계를 감소시키는 데 필요한 경우 한 플라스크에서 다른 플라스크로 전송해야 하고 희석이 이루어지고 있는 경우 유리 제품을 헹구면 모든 샘플이 전송되도록 합니다. 다른 전략은 샘플에 더 구체적입니다. 예를 들어, 단백질과 같은 유리에 흡착하는 샘플은 폴리프로필렌 일회용 튜브에서 더 잘 처리될 수 있습니다. 튜브는 친수성이 아니기 때문에 소량의 시료가 물에 배관될 경우 이미 튜브에 물을 첨가하여 샘플을 용매로 직접 배관할 수 있습니다. 수화 후 용성으로 인한 손실로 인해 샘플을 완전히 건조시키기보다는 농축하는 것이 더 좋을 수 있습니다.

샘플 손실의 또 다른 원인은 불완전한 샘플 조작을 통해서입니다. 예를 들어, 파생 프로시저가 사용되고 파생이 불완전한 경우 전체 양의 샘플이 관찰되지 않습니다. 이와 같은 오류는 체계적인 오류이며, 파생 절차 변경과 같은 문제를 수정하여 해결할 수 있다. 측정에서 체계적인 오류의 또 다른 원인은 매트릭스 효과입니다. 이들은 특정 물질의 측정을 방해하고 샘플이 효과를 줄일 수있는 샘플과 동일한 매트릭스에서 교정을 수행 할 수 있습니다.

정량 분석은 일반적으로 외부 또는 내부 표준을 사용하여 수행됩니다. 외부 표준의 경우, 교정 곡선은 관심 있는 별분의 상이한 공지된 농도를 측정하여 이루어집니다. 그런 다음 샘플은 표준과 별도로 실행됩니다. 내부 표준의 경우 표준은 관심 있는 단언과 동일한 샘플에 있으므로 동시에 측정을 수행할 수 있습니다. 전형적으로, 다른 종은 내부 표준이라고 불리며 그 내부 표준및 분석물의 반응 비율이 계산된다. 응답 계수라고 하는 응답 비율이 농도에 비례한다는 것이 아이디어입니다. 방법은 관심 분석기와 내부 표준을 구별할 수 있어야 하지만 내부 표준이 추가된 후에 발생하는 모든 샘플 손실은 두 물질 모두에 대해 유사해야 하므로 응답 비율은 동일하게 유지됩니다. 내부 표준을 사용하는 특별한 경우는 표준 추가 방법이며, 여기서 는 Aalyte의 양이 증가함에 따라 솔루션에 추가되고 원래의 양의 딜리바이트가 다시 계산됩니다. 내부 표준은 크로마토그래피, 전기화학 및 분광법에 사용될 수 있습니다.

Principles

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내부 표준은 분석에서 샘플, 블랭크 및 표준에 일정한 양으로 첨가된 물질입니다. 내부 표준은 체계적이고 임의적인 오류를 모두 보정할 수 있습니다. 예를 들어 측정에 임의 오류를 유발하는 계측기 변동이 있는 경우 이러한 변동은 내부 표준과 분석물 모두에 대해 동일하므로 신호 의 비율이 변경되지 않습니다. 용매의 매트릭스 효과와 같은 체계적인 오류의 경우 표준 및 분석물의 효과가 같을 때 비율이 다시 영향을 받지 않습니다.

내부 표준의 단점은 적합한 내부 표준을 찾기 어렵다는 것입니다. 내부 표준에는 분석기와 유사하지만 계측기로 구별될 수 있을 만큼 충분히 다른 신호가 있어야 합니다. 또한, 내부 표준은 추가된 표준이 표준의 유일한 소스이기 때문에 샘플 매트릭스에 존재해서는 안 됩니다. 때때로, 농도가 일정한 샘플의 주요 성분은 추가 표준 대신 내부 표준으로 사용될 수 있지만, 농도는 그 성분에 대해 잘 알려져 있어야 한다. 내부 표준은 또한 아닐리바이트의 신호를 억제하거나 향상시켜서는 안 됩니다.

크로마토그래피에서 가장 큰 오류 원인 중 하나는 종종 주사입니다. 수동 주사를 사용하는 경우 주사기를 올바르게 로드하는 데 오류가 있을 수 있습니다. 볼륨은 일반적으로 작기 때문에 이 작은 부피를 재현하여 주입하는 데 불확실성이 있으며, 종종 상대 표준 편차(RSD)의 몇 가지 가있습니다. 가스 크로마토그래피(GC)에서, 시료는 가열된 포트로 주입되고 바늘 끝에서 증발하면 주입된 부피의 변동이 발생할 수 있다. 자동 샘플러는 주사기를 로드하는 오류와 GC의 증발을 피하기 위해 신속하게 주입하는 오류모두에 도움이되지만 오류는 여전히 1-2 % RSD일 수 있습니다. 크로마토그래피를 사용하면 피크가 시간이 지남에 따라 더 넓고 짧아지지만 피크 영역은 일정하기 때문에 피크 영역은 일반적으로 피크 높이 대신 사용됩니다. 따라서 내부 표준의 경우 피크 영역의 비율이 피크 높이 대신 크로마토그래피에서 사용됩니다.

내부 표준이 있는 교정의 경우 응답 계수가 계산됩니다. 응답계수(R)는 X가 분석체이고 IS가 내부 표준인 농도의 비율에 비해 피크의 비율이다.

Equation 1

크로마토그래피 영역(A)이 사용됩니다. 응답 계수는 응답 계수가 경사이고 y-intercept가 0으로 추정되는 AX/IS대 CX/CIS의교정 플롯에서 계산될 수 있다. 응답 계수가 표준으로 알려지면 알 수 없는 응답은 실험에서 측정된 영역 비율에서 계산할 수 있습니다.

Equation 2

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Procedure

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1. 적절한 샘플 처리: 솔루션 만들기

  1. 깨끗한 비커를 가지고 정확한 양의 샘플을 대량으로 넣습니다. 사용된 실제 질량을 기록합니다. 이 예에서 아데닌의 용액은 다음 분석을 위한 내부 표준으로 사용하기 위해 볼륨 플라스크에서 만들어집니다. 아데닌의 질량은 100 mg. 긴 목을 가지고 있고 아데닌을 쉽게 추가하거나 제거할 수 없기 때문에 체적 플라스크에 직접 질량을 두지 마십시오.
  2. 약 25mL의 용매(이 경우 디메틸 설산화물(DMSO)를 비커에 넣고 저어서 용해하도록 한다. 이 예에서 최종 용액은 50mL 체피 플라스크로 만들어지므로 약 25mL만 추가하여 비커를 헹구고 최종 볼륨으로 구성된 솔루션이 가능합니다.
  3. 고체가 용해되면 용액을 체적 플라스크에 붓습니다.
  4. 비커와 교반바를 소량의 용매로 헹구고 약 10mL로 헹구고 헹구는 플라스크에 붓습니다. 두 번 더 반복합니다. 이렇게 하면 적절한 솔루션 전송을 보장할 수 있습니다.

2. 내부 표준 교정 곡선 준비

  1. 가스 크로마토그래피 분석을 위해 원하는 표준 샘플을 준비합니다. 이 예에서 카페인은 아세토닐릴을 사용하여 커피에서 추출한 다음 아데닌을 측정을 위한 내부 표준으로 사용됩니다.
  2. 카페인 샘플의 경우 1 mg/mL 샘플을 만드는 데 필요한 샘플의 양을 측정합니다. 10 mL 볼륨 플라스크를 사용하는 경우, 즉, 10 mg입니다.
  3. 분석물의 무게를 비커로 계량하고 용매(here methanol)를 몇 mL에 추가하여 용해한 다음 3개의 헹구기를 사용하여 체피 플라스크로 정량적으로 전달합니다.
  4. 0.2, 0.5, 2 mg/mL 카페인과 비슷한 방식으로 3 가지 표준을 더 확인하십시오.
  5. 각 카페인 표준의 1mL을 샘플 바이알에 넣습니다.
  6. 각 시료 바이알에 2 mg/mL 아데닌 내부 표준의 0.2mL을 추가합니다.
  7. 각 카페인 표준으로 가스 크로마토그래피 실험을 실행합니다. 각 크로마토그램에 대해 카페인과 표준에 대한 피크 영역의 비율을 계산합니다.
  8. 면적 비율 대 농도 비율을 플롯합니다. 해당 플롯의 기울기는 응답 계수입니다.

3. 가스 크로마토그래피를 위한 내부 표준이 있는 실제 시료 준비

  1. 가스 크로마토그래피 분석을 위해 원하는 샘플을 준비합니다. 이 예에서, 카페인은 아세트트론트트릴을 사용하여 커피에서 추출됩니다.
  2. 커피 샘플의 경우 커피 2g을 100mL 비커에 넣습니다. 커피의 정확한 무게를 기록합니다.
  3. 20mL의 아세토닐트리어를 비커에 넣습니다.
  4. 자주 저어, 20 분 동안 앉아 있도록.
  5. 깔때기의 필터 용지를 사용하여 커피 찌꺼기를 필터링합니다.
  6. 소량의 아세토닐릴(5mL)으로 필터 용지 3x를 헹구는 다.
  7. 여과물의 최종 볼륨을 측정합니다. 약 35mL이어야 합니다.

4. 샘플을 실행하고 농도를 계산

  1. 커피 추출물 샘플 1mL을 추출하고 바이알에 내부 표준0.2mL를 추가합니다. 유리병을 자동 샘플러 랙에 넣습니다.
  2. 샘플의 GC 분석을 실행합니다. GC 조건이 카페인과 아데닌이 분리되도록 하십시오. 이 예에서, 이소체 분리는 200°C에서 수행된다.
  3. 분석 후 내부 표준 피크와 분석피크 모두에 대한 피크 영역을 계산합니다. 그들의 비율을 사용하여, 샘플에 카페인의 양을 계산합니다.

5. 결과: 내부 표준카페인 GC 분석

  1. 카페인의 GC 분석은 도 1에도시된다. 아데닌은 내부 표준으로 사용됩니다. 피크 영역의 비율을 측정하고 농도의 비율에 비해 플롯할 수 있습니다. 플롯의 기울기는 응답 계수(이 경우 1.8)입니다.
  2. 도 2는 아데닌 내부 표준을 가진 커피 샘플의 크로마토그램을 나타낸다. 피크 영역의 비율은 1.78입니다. 반응 인자 및 아데닌의 알려진 농도(0.33 mg/mL)를 사용하여 알 수 없는 시료의 카페인 농도는 0.33 mg/mL로 계산됩니다.

Figure 1
그림 1. 내부 표준을 사용하여 교정 플롯을 사용합니다. 각각에 0.33 mg/mL 아데닌 내부 표준이 추가된 3개의 표준 카페인 샘플(1, 0.5 및 0.2 mg/mL)에 대한 면적 비율 대 농도 비율의 플롯. 선의 기울기는 응답 계수인 1.8입니다.

Figure 2
그림 2. 아데닌 내부 표준 커피의 크로마토그램. 샘플에 대한 FID 검출기의 응답 플롯입니다. 세 가지 주요 봉우리는 아데닌 (IS), 카페인, 팔미티산입니다.

시료를 처리하거나 전송할 때마다 시료 손실이 발생할 수 있으므로 정확한 농도 계산이 어려워질 수 있습니다.

정확성을 보장하기 위해 신중한 샘플 준비를 사용하여 시료 처리 및 전송 단계수를 제한하여 샘플 손실의 효과를 최소화해야 합니다. 그러나 불완전한 샘플 조작, 매트릭스 효과 및 분석 절차의 변화와 같은 체계적인 오류로 인해 샘플 손실이 발생할 수도 있습니다.

이러한 손실 원천은 관심의 화합물과 유사하지만 동일하지 않은 종의 알려진 농도를 추가하여 설명할 수 있습니다. 이를 내부 표준이라고 합니다. 내부 표준에 발생하는 모든 샘플 손실은 질량에 대해 유사해야 하므로 농도가 정확하게 계산될 수 있습니다.

이 비디오는 알 수 없는 농도를 결정할 때 샘플 손실을 설명하기 위해 내부 표준 및 적절한 실험실 기술을 사용하는 것을 보여줍니다.

내부 표준은 분석 중에 표준, 샘플 및 공백에 알려진 양에 첨가된 물질입니다.

크로마토그래피 및 분광법에서 내부 표준 및 분석체에 대한 신호의 비율이 계산됩니다. 응답 계수라고 하는 이 비율은 분석기 및 표준 농도의 비율에 비례합니다.

응답 계수, R은, A가 샘플 및 내부 표준 및 C의 분석 신호를 나타내는 다음 방정식에 의해 발현될 수 있으며 C는 시료 및 내부 표준의 농도를 나타낸다.

내부 표준은 체계적이고 임의적인 오류를 모두 보정할 수 있습니다. 예를 들어, 샘플을 측정할 때 불일치와 같은 임의오류는내부 표준과 분석을 모두 동일하게 합니다. 따라서 신호의 비율은 변경되지 않습니다.

솔루션의 매트릭스 효과와 같은 체계적인 오류의 경우 매트릭스 효과가 표준 및 분석기 모두에 대해 동일한 한 비율은 영향을 받지 않습니다.

내부 표준은 큰 이점을 제공하지만 적합한 표준을 선택하는 것은 어려울 수 있습니다. 내부 표준에는 아닐 수 있는 신호가 있는 경우, 아닐 수 있는 신호가 있는 경우, 아닐 수 있습니다. 또한 어떤 식으로든 마취제의 측정에 영향을 미칠 수 없습니다.

마지막으로, 농도는 잘 알려져 있어야합니다. 이것은 내부 표준이 기본적으로 샘플에 존재하지 않도록 함으로써 달성됩니다. 따라서, 용액에서 그것의 유일한 근원은 추가된 알려진 농도입니다.

다음 실험에서, 알 수 없는 샘플에서 카페인의 농도는 가스 크로마토그래피에 의해 결정될 것이다.

이는 알려진 카페인 용액을 사용하여 교정 곡선을 생성하여 달성되며, 아데닌은 내부 표준으로 사용됩니다. 교정 곡선의 기울기는 응답 계수와 같습니다.

응답 계수가 알려지면, 알 수 없는 의 농도는 측정된 크로마토그램 면적 비로부터 계산될 수 있다.

이제 내부 표준의 기본을 이해하게 되었으므로 절차를 살펴보겠습니다.

절차를 시작하려면, 정확하게 무게를 100 내부 표준의 mg, 아데닌, 깨끗한 비커로.

다음으로, 약 20mL의 디메틸 설프리산화물에 녹여 용액을 혼합한다.

아데닌이 용해되면 용액을 50mL 볼륨 플라스크에 붓습니다.

비커를 헹구고 10mL의 DMSO로 바를 저어서 헹구고 헹구는 것을 플라스크에 붓습니다. 적절한 솔루션 전송을 보장하기 위해 이 헹도 헹도 을 두 번 반복하십시오. 교정 마크를 채우고 2 mg/mL농도의 내부 표준을 생성합니다.

다음으로, 무게 100 주식 솔루션을 준비 하는 비커에 카페인의 mg. 소량의 메탄올로 카페인을 녹입니다. 그런 다음 3 개의 헹구기를 사용하여이 솔루션을 신선한 25 mL 볼륨 플라스크로 전송하십시오. 이것은 4 mg /mL 재고 솔루션입니다. 그것을 만드는 데 사용 3 카페인 기준.

다음으로 각 플라스크에 내부 표준 인 adenine의 0.2 mL을 추가합니다. 각 볼륨을 메탄올로 채웁니다. 각 솔루션을 샘플 바이알로 전송합니다.

가스 크로마토그래프를 통해 각 카페인 표준을 실행합니다. 카페인과 아데닌 표준의 피크 영역 비율을 계산합니다.

첫째, 커피 2g을 100mL 비커에 넣고 무게를 기록합니다.

다음으로, 커피에서 카페인을 추출하기 위해 메탄올 20mL를 추가합니다. 용액이 20 분 동안 저어 줍니다.

뷔흐너 깔때기를 사용하여 커피 찌꺼기를 걸러내세요. 소량의 메탄올로 비커를 헹구고 이 헹구기를 깔때기에 붓습니다. 헹도을 두 번 반복합니다.

여과물의 최종 부피를 측정합니다. 약 35mL이어야 합니다.

분석을 위해 샘플을 준비하려면 샘플 바이알에 커피 추출물 1mL을 추가합니다. 그런 다음, 아데닌 내부 표준의 0.2 mL을 추가하고, 악기의 자동 샘플러 랙에 유리병을 배치합니다.

샘플의 가스 크로마토그래피 분석을 실행하여 카페인과 아데닌이 분리되도록 조건이 되도록 합니다.

분석을 완료한 후 내부 표준과 분석기 모두에 대해 피크 영역을 계산합니다.

모든 샘플을 분석한 후, 표준 교정 곡선은 농도의 비율에 비해 피크 영역의 비율을 플로팅하여 카페인/아데닌 용액에 대해 결정될 수 있다. 응답 계수를 나타내는 이 선의 기울기는 1.8이었습니다.

다음으로, 추출된 커피 샘플로부터의 GC 데이터를 분석한다. 피크 영역의 비율은 1.78로 계산되었습니다. 반응 인자 및 내부 표준의 공지된 농도를 사용하여, 아데닌, 알 수 없는 샘플에서의 카페인 농도는 0.33 mg/mL로 계산되었다.

다양한 과학적 제자들에 걸쳐 다양한 유형의 반응은 내부 표준을 활용하여 오류 및 샘플 손실의 영향을 최소화합니다.

샘플 준비 중에 발생하는 샘플 손실의 효과는 내부 표준을 사용하여 최소화할 수 있으며 농도 비율을 거의 일정하게 유지합니다.

이 예에서, 생리활성 지질은 액체 액체 추출 공정을 사용하여 용액 세포로부터 추출되었다. 추출 초기에 는 시료 준비 중 오류를 고려하여 안정적인 동위원소 내부 표준이 추가되었습니다.

내부 표준은 생리활성 지질의 제조뿐만 아니라 분석에도 중요했습니다. 지질은 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 분리하고 질량 분석법을 통해 분석되었습니다.

분광법에서 내부 표준은 광원 강도의 변화로 인해 임의 오류를 수정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 램프 또는 다른 광원이 가변 전력을 가지고 있는 경우, 이는 시료의 흡수에 영향을 미치고 결과적으로 시료의 방출에 영향을 미칩니다. 그러나 광원이 없는 경우에도 내부 표준에서 분석기의 비율은 일정하게 유지됩니다.

크로마토그래피에서 가장 큰 오류 원인 중 하나는 주사입니다. 자동 샘플러는 이를 최소화하는 데 도움이 되지만 오류는 여전히 1-2%의 상대 표준 편차가 될 수 있습니다.

이 예에서, 내부 표준을 포함하는 증기 표준을 분석하여 가스 크로마토그래피를 사용하여 교정 곡선을 확립했다. 이 작업이 완료되면 알 수 없는 샘플을 측정하고 샘플의 변동성으로 인한 손실을 측정할 수 있습니다.

당신은 단지 내부 표준에 대한 JoVE의 소개를 보았다. 이제 샘플 손실, 내부 표준 및 응답 요소를 최소화하기 위한 모범 사례를 이해해야 합니다.

시청해 주셔서 감사합니다!

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내부 표준은 분광및 크로마토그래피를 포함하여 많은 분야에서 사용됩니다. 분광법에서 내부 표준은 광원 강도의 변화로 인해 임의 오류를 수정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 램프 또는 다른 광원이 가변 전력을 가지고 있는 경우, 이는 시료의 흡수에 영향을 미치고 결과적으로 시료의 방출에 영향을 미칩니다. 그러나 광원이 없는 경우에도 내부 표준에서 분석기의 비율은 일정하게 유지됩니다. 이것의 한 예는 리튬 (Li)를 화염 분광법에 의한 혈액 샘플에서 나트륨의 분석을위한 내부 표준으로 사용하는 것입니다. 리 나트륨과 화학적으로 유사하지만 혈액에서 기본적으로 발견되지 않습니다.

크로마토그래피의 경우 내부 표준은 가스 크로마토그래피와 액체 크로마토그래피 모두에서 종종 사용됩니다. 검출기로 질량 분광법을 가진 응용의 경우, 내부 표준은 동위원소 표지 분석기가 될 수 있으므로 분자량 (MW)이 관심 분석기와 다를 수 있습니다. 내부 표준은 일반적으로 제약 또는 환경 분석에 사용됩니다.

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