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Analytical Chemistry

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Overview

Fonte: Laboratório da Dra.B. Jill Venton - Universidade da Virgínia

O objetivo de muitas análises químicas é uma análise quantitativa, onde a quantidade de uma substância em uma amostra é determinada. Para calcular com precisão a concentração de uma amostra desconhecida, a preparação cuidadosa da amostra é fundamental. Toda vez que uma amostra é manuseada ou transferida, parte da amostra pode ser perdida. Existem estratégias, porém, para minimizar a perda de amostras. Há também estratégias para lidar com a perda de amostras e ainda fazer medições precisas de concentração.

Para minimizar a perda de amostra, o ideal é minimizar o número de etapas de manuseio e transferência de amostras. Por exemplo, a massagem de uma amostra sólida diretamente em um frasco de que uma solução será feita reduz uma etapa de transferência. Se for necessário transferir de um frasco para outro e uma diluição estiver sendo feita, então enxaguar três 30 ções ajudam a garantir que toda a amostra seja transferida. Outras estratégias são mais específicas para a amostra. Por exemplo, amostras que adsorb para vidro, como proteínas, podem ser melhor manuseadas em tubos descartáveis de polipropileno. Os tubos não são hidrofílicos, por isso, se uma pequena quantidade de amostra deve ser cantada em água, é melhor já ter adicionado a água ao tubo, para que a amostra possa ser pipetada diretamente no solvente. Pode ser melhor concentrar-se, em vez de secar completamente uma amostra, devido a perdas de insolubilidades após a reidratação.

Outra fonte de perda amostral é através de manipulações amostrais incompletas. Por exemplo, se um procedimento de derivatização é usado e a derivatização está incompleta, então a quantidade total de amostra não é observada. Erros como esse são erros sistemáticos e podem ser resolvidos corrigindo o problema, como a alteração do procedimento de derivatização. Outra causa de erro sistemático nas medições são os efeitos matriciais. Estes podem interferir com a medição de certas substâncias e a realização de calibrações na mesma matriz que a amostra pode reduzir esse efeito.

A análise quantitativa é normalmente realizada utilizando-se normas externas ou internas. Para padrões externos, uma curva de calibração é feita medindo diferentes concentrações conhecidas do analito de interesse. Em seguida, a amostra é executada separadamente do padrão. Para as normas internas, a norma está na mesma amostra do analito de interesse, permitindo que a medida seja tomada simultaneamente. Tipicamente, uma espécie diferente é adicionada chamada padrão interno e a razão da resposta para esse padrão interno e o analito é calculado. A ideia é que a razão da resposta, chamada fator de resposta, seja proporcional à sua concentração. Embora o método deva ser capaz de distinguir entre o analito de interesse e o padrão interno, quaisquer perdas amostrais que ocorram após o padrão interno ser adicionado devem ser semelhantes para ambas as substâncias e, portanto, a razão da resposta permanece a mesma. Um caso especial de utilização de normas internas é o método de adições padrão, onde quantidades crescentes do analito são adicionadas à solução e a quantidade original de analito é calculada em segundo lugar. Padrões internos podem ser usados em cromatografia, eletroquímica e espectroscopia.

Principles

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Um padrão interno é uma substância adicionada em uma quantidade constante a uma amostra, em branco e padrão em uma análise. Um padrão interno pode compensar erros sistemáticos e aleatórios. Por exemplo, se houver flutuações de instrumentos que causem erros aleatórios na medição, espera-se que essas flutuações sejam as mesmas tanto para o padrão interno quanto para o analito e, portanto, a razão de sinais não muda. Para erros sistemáticos, como efeitos matriciais do solvente, desde que o efeito seja igual tanto para o padrão quanto para o analito, a razão não é afetada novamente.

A desvantagem das normas internas é que é difícil encontrar um padrão interno adequado. O padrão interno deve ter um sinal semelhante ao analito, mas diferente o suficiente para que possa ser distinguido pelo instrumento. Além disso, o padrão interno não deve estar presente na matriz amostral, de modo que o padrão adicionado seja a única fonte do padrão. Ocasionalmente, um constituinte principal de uma amostra que é constante em concentração pode ser usado como padrão interno em vez de um padrão adicional, mas a concentração deve ser bem conhecida por esse constituinte. O padrão interno também não deve suprimir ou melhorar o sinal do analito.

Na cromatografia, uma das maiores fontes de erro é muitas vezes a injeção. Se forem utilizadas injeções manuais, pode haver erros no carregamento da seringa corretamente. Os volumes são tipicamente pequenos (~1 μL) então há incertezas em injetar reproduzivelmente este pequeno volume, muitas vezes um par de por cento de desvio padrão relativo (RSD). Na cromatografia gasosa (GC), a amostra é injetada em uma porta aquecida e a evaporação da ponta da agulha pode resultar em variações no volume injetado. Os amostradores automáticos ajudam tanto com o erro no carregamento da seringa quanto o erro na injeção rapidamente para evitar a evaporação em GC, mas o erro ainda pode ser de 1 a 2% de RSD. Com cromatografia, a área de pico é geralmente usada em vez de altura máxima, à medida que os picos ficam mais largos e mais curtos com o tempo, mas a área de pico é constante. Assim, para os padrões internos, as proporções de áreas de pico são utilizadas na cromatografia em vez de alturas máximas.

Para uma calibração com um padrão interno, um fator de resposta é calculado. O fator de resposta (R) é a razão dos picos em comparação com a razão das concentrações onde X é o analito e o IS é o padrão interno.

Equation 1

Para a área de cromatografia (A) é utilizado. O fator de resposta pode ser calculado a partir de uma parcela de calibração de AX/AIS vs CX/CIS, onde o fator de resposta é a inclinação e a interceptação y é assumida como sendo 0. Uma vez que o fator de resposta é conhecido pelos padrões, a resposta do desconhecido pode ser calculada a partir da razão de área medida do experimento.

Equation 2

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Procedure

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1. Manuseio adequado da amostra: Fazer uma solução

  1. Leve um béquer limpo e massa a quantidade correta de amostra nele. Grave a massa real usada. Neste exemplo, uma solução de adenina é feita em um frasco volumoso para uso como padrão interno para a próxima análise. A massa de adenina é de 100 mgs. Não entre diretamente em um frasco volumoso porque tem um pescoço longo e a adenina não pode ser facilmente adicionada ou removida.
  2. Adicione cerca de 25 mL de solvente (neste caso, sulfóxido de dimetil (DMSO)) ao béquer e deixe-o mexer para dissolver. Neste exemplo, a solução final é feita em um frasco volumoso de 50 mL, por isso adicione apenas cerca de 25 mL para que o béquer possa ser enxaguado e a solução feita até o volume final.
  3. Uma vez que o sólido tenha dissolvido, despeje a solução no frasco volumoso.
  4. Enxágüe o béquer e a barra de mexida com pequenas quantidades de solvente, cerca de 10 mL, e despeje a enxágue no frasco volumoso. Repita mais duas vezes. Isso ajuda a garantir a transferência adequada da solução.

2. Preparação de uma curva de calibração padrão interna

  1. Prepare as amostras padrão desejadas para análise de cromatografia a gás. Neste exemplo, a cafeína é extraída do café usando acetonitrilo e, em seguida, a adenina é usada como um padrão interno para medição.
  2. Para as amostras de cafeína, pese a quantidade de amostra necessária para fazer 1 mg/mL de amostra. Se usar um frasco volumoso de 10 mL, são 10 mgs.
  3. Pesar o analito em um béquer, adicionar alguns mL de solvente (aqui metanol) para dissolver e, em seguida, transferir quantitativamente para o frasco volumoso usando 3 enxágues.
  4. Faça mais 3 padrões de forma semelhante com 0,2, 0,5 e 2 mg/mL de cafeína.
  5. Coloque 1 mL de cada padrão de cafeína em um frasco de amostra.
  6. Adicione 0,2 mL de padrão interno de adenina de 2 mg/mL a cada frasco de amostra.
  7. Execute o experimento de cromatografia gasosa com cada padrão de cafeína. Para cada cromatograma, calcule a razão das áreas de pico para a cafeína versus o padrão.
  8. Faça um gráfico da razão de área versus a razão de concentração. A inclinação desse enredo é o fator de resposta.

3. Preparação de uma amostra real com padrão interno para cromatografia gasosa

  1. Prepare a amostra desejada para análise de cromatografia gasosa. Neste exemplo, a cafeína é extraída do café usando acetrontrila.
  2. Para a amostra de café, massa 2 g de café em um béquer de 100 mL. Regisso o peso exato do café.
  3. Adicione 20 mL de acetonitrila ao béquer.
  4. Deixe descansar por 20 minutos, mexendo com frequência.
  5. Filtre a borra de café usando um papel filtro em um funil.
  6. Enxágüe o papel filtro 3x com pequenas quantidades de acetonitrilo (5 mL).
  7. Meça o volume final do filtrado. Deve ser cerca de 35 mL.

4. Execute a amostra e calcule a concentração

  1. Pegue 1 mL da amostra do extrato de café e adicione 0,2 mL do padrão interno em um frasco. Coloque o frasco no rack de amostrador automático.
  2. Execute uma análise gc da amostra. Certifique-se de que as condições de GC são de tal forma que a cafeína e a adenina separem. Neste exemplo, as separações istermais são realizadas a 200 °C.
  3. Após a análise, calcule a área de pico tanto para o pico padrão interno quanto para o pico de analito. Usando suas proporções, calcule a quantidade de cafeína na amostra.

5. Resultados: Análise gc da cafeína com padrão interno

  1. A análise gc da cafeína é mostrada na Figura 1. Adenina é usada como padrão interno. A razão das áreas de pico pode ser medida e plotada versus a razão das concentrações. A inclinação da trama é o fator de resposta (neste caso 1,8).
  2. A Figura 2 mostra um cromatograma de uma amostra de café com padrão interno de adenina. A proporção da área de pico é de 1,78. Utilizando o fator de resposta e a concentração conhecida de adenina (0,33 mg/mL), calcula-se a concentração de cafeína na amostra desconhecida de 0,33 mg/mL.

Figure 1
Figura 1. Gráfico de calibração usando um padrão interno. Um gráfico das razões de área versus razão de concentração para 3 amostras padrão de cafeína (1, 0,5 e 0,2 mg/mL) com 0,33 mg/mL padrão interno adicionado a cada um. A inclinação da linha é 1.8, que é o fator de resposta.

Figure 2
Figura 2. Cromograma de café com padrão interno de adenina. Um gráfico da resposta do detector fid para amostras. Os três principais picos são adenina (IS), cafeína e ácido palmítico.

A perda da amostra pode ocorrer toda vez que uma amostra é manipulada ou transferida, dificultando os cálculos precisos de concentração.

Para garantir a precisão, os efeitos da perda da amostra devem ser minimizados utilizando-se uma cuidadosa preparação da amostra e limitando o número de etapas de manuseio e transferência de amostras. No entanto, a perda de amostra também pode ocorrer devido a erros sistemáticos, como manipulação incompleta da amostra, efeitos matriciais e variações no procedimento analítico.

Essas fontes de perda podem ser contabilizadas adicionando uma concentração conhecida de uma espécie semelhante, mas não idêntica, ao composto de interesse. Isso é chamado de padrão interno. Quaisquer perdas amostrais que ocorram ao padrão interno devem ser semelhantes para o analito, permitindo que a concentração seja calculada com precisão.

Este vídeo ilustrará o uso de uma técnica de laboratório padrão interna e adequada para explicar a perda de amostras ao determinar a concentração de um desconhecido.

Um padrão interno é uma substância adicionada em uma quantidade conhecida a padrões, amostras e espaços em branco durante uma análise.

Na cromatografia e espectroscopia, calcula-se a razão do sinal para o padrão interno e o analito. Essa razão, chamada de fator de resposta, é proporcional à razão das concentrações analitos e padrão.

O fator de resposta, R, pode ser expresso pela seguinte equação, onde A representa os sinais analíticos da amostra e padrão interno e C representa as concentrações da amostra e do padrão interno.

Um padrão interno pode compensar erros sistemáticos e aleatórios. Por exemplo, erros aleatórios — como inconsistências ao medir uma amostraserão os mesmos tanto para o padrão interno quanto para o analito. Portanto, a razão de seus sinais não mudará.

Para erros sistemáticos, como efeitos matriciais na solução, a razão não será afetada, desde que o efeito matricial seja igual tanto para o padrão quanto para o analito.

Embora as normas internas proporcionem grande benefício, pode ser difícil escolher um que seja adequado. Um padrão interno deve ter um sinal semelhante, mas não idêntico, ao analito. Também não pode afetar a medição do analito de forma alguma.

Finalmente, a concentração deve ser bem conhecida. Isso é conseguido garantindo que o padrão interno não esteja nativamente presente na amostra; assim, a única fonte dela em solução é a concentração conhecida adicionada.

No experimento seguinte, a concentração de cafeína em uma amostra desconhecida será determinada por cromatografia gasosa.

Isso é conseguido através da criação de uma curva de calibração usando soluções conhecidas de cafeína, com a adenina como padrão interno. A inclinação da curva de calibração é igual ao fator de resposta.

Uma vez que o fator de resposta é conhecido, a concentração do desconhecido pode ser calculada a partir de sua razão de área de cromatograma medido.

Agora que você entende o básico dos padrões internos, vamos dar uma olhada no procedimento.

Para iniciar o procedimento, pesar com precisão 100 mg do padrão interno, adenina, em um béquer limpo.

Em seguida, dissolva-o em cerca de 20 mL de sulfóxido de dimetila, e misture a solução.

Uma vez que a adenina tenha dissolvido, despeje a solução em um frasco volumoso de 50 mL.

Enxágüe o béquer e mexa com 10 mL de DMSO, e despeje a enxágue no frasco. Repita esta lavagem duas vezes, para garantir a transferência adequada da solução. Encha a marca de calibração, resultando em um padrão interno com uma concentração de 2 mg/mL.

Em seguida, pesar 100 mg de cafeína em um béquer para preparar uma solução de estoque. Dissolva a cafeína com uma pequena quantidade de metanol. Em seguida, use 3 enxágues para transferir esta solução para um frasco volumoso fresco de 25 mL. Esta é a solução de estoque de 4 mg/mL. Use-o para criar 3 padrões de cafeína.

Em seguida, adicione 0,2 mL do padrão interno, adenina, a cada frasco. Encha cada um com o volume final com metanol. Transfira cada solução para um frasco de amostra.

Execute cada padrão de cafeína através de um cromatógrafo a gás. Calcule a razão das áreas de pico para a cafeína versus o padrão adenina.

Primeiro, pese 2 g de café em um copo de 100 mL, e grave o peso.

Em seguida, adicione 20 mL de metanol para extrair a cafeína do café. Deixe a solução mexer por 20 minutos.

Usando um funil Büchner, filtre as borras de café. Enxágüe o béquer com uma pequena quantidade de metanol, e despeje este enxágue no funil. Repita a lavagem duas vezes.

Medir o volume final do filtrado; deve ser aproximadamente 35 mL.

Para preparar a amostra para análise, adicione 1 mL do extrato de café a um frasco de amostra. Em seguida, adicione 0,2 mL do padrão interno da adenina e coloque o frasco no rack de amostrador automático do instrumento.

Execute uma análise cromatografia gasosa da amostra, garantindo que as condições sejam de tal forma que a cafeína e a adenina estejam separadas.

Após concluir a análise, calcule a área de pico tanto para o padrão interno quanto para o analito.

Uma vez analisadas todas as amostras, a curva de calibração padrão pode ser determinada para as soluções de cafeína/adenina, plotando as razões das áreas de pico versus as proporções das concentrações. A inclinação dessa linha, que representa o fator resposta, foi de 1,8.

Em seguida, são analisados os dados de GC da amostra de café extraído. A razão das áreas de pico foi calculada em 1,78. Utilizando-se o fator de resposta e a concentração conhecida do padrão interno, a adenina, calculou-se a concentração de cafeína na amostra desconhecida de 0,33 mg/mL.

Muitos tipos diferentes de reações, entre vários discípulos científicos, utilizam padrões internos para minimizar os efeitos de erros e perda de amostras.

Os efeitos da perda amostral encontrada durante a preparação da amostra podem ser minimizados usando padrões internos, mantendo sua razão de concentração quase constante.

Neste exemplo, lipídios bioativos foram extraídos de células líssedas usando um processo de extração líquido-líquido. Foram adicionadas normas internas de isótopo estável no início da extração para contabilizar erros durante a preparação da amostra.

As normas internas não foram apenas críticas para a preparação dos lipídios bioativos, mas também para a análise. Os lipídios foram separados por cromatografia líquida de alto desempenho e analisados por espectrometria de massa.

Na espectroscopia, os padrões internos podem ajudar a corrigir erros aleatórios devido a alterações na intensidade da fonte de luz. Se uma lâmpada ou outra fonte de luz tiver potência variável, afetará a absorção e, consequentemente, a emissão de uma amostra. No entanto, a razão de um padrão interno para analito permanecerá constante, mesmo que a fonte de luz não o faça.

Na cromatografia, uma das maiores fontes de erro é a injeção. Os amostradores automáticos ajudam a minimizar isso, mas o erro ainda pode ser um desvio padrão relativo de 1 a 2%.

Neste exemplo, foram analisadas normas de vapor contendo padrão interno utilizando cromatografia gasosa para estabelecer uma curva de calibração. Uma vez concluída, a amostra desconhecida poderia então ser medida e as perdas devido à volatilidade da amostra contabilizada.

Você acabou de assistir a introdução do JoVE aos padrões internos. Agora você deve entender as melhores práticas para minimizar a perda de amostras, padrões internos e fatores de resposta.

Obrigado por assistir!

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Applications and Summary

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As normas internas são usadas em muitos campos, incluindo espectroscopia e cromatografia. Na espectroscopia, os padrões internos podem ajudar a corrigir erros aleatórios devido a alterações na intensidade da fonte de luz. Se uma lâmpada ou outra fonte de luz tiver potência variável, afetará a absorção e, consequentemente, a emissão de uma amostra. No entanto, a razão de um padrão interno para analito permanecerá constante, mesmo que a fonte de luz não o faça. Um exemplo disso é o uso de lítio (Li) como padrão interno para a análise do sódio em uma amostra de sangue por espectroscopia de chama. Li é quimicamente semelhante ao sódio, mas não é encontrado nativamente no sangue.

Para a cromatografia, os padrões internos são frequentemente usados tanto na cromatografia gasosa quanto na cromatografia líquida. Para aplicações com espectrometria de massa como detector, o padrão interno pode ser um analito isotopicamente rotulado, de modo que o peso molecular (MW) será diferente do analito de interesse. As normas internas são comumente utilizadas em análises farmacêuticas ou ambientais.

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