Overview
מקור: פיימן שהביגי-רודפושטי וסינה שהבזמהאמדי, המחלקה להנדסה ביו-רפואית, אוניברסיטת קונטיקט, סטוררס, קונטיקט
חלקיקים שימשו יותר ויותר מחקר לקראת משלוח תרופות ממוקדות ושחרור תרופות מבוקרות. בעוד שרוב החלקיקים האלה פותחו כחלקיקים פולימריים או ליפוזומאליים בגלל תאימות ביולוגית שלהם, יש מגמה במחקר הנוכחי לקראת השימוש בננו-חלקיקים מתכתיים ומגנטיים. חלקיקים מתכתיים אלה שימשו במקור כסוכן ניגודיות בהדמיה, אך ההתקדמות האחרונה הראתה עד כמה הם יכולים להיות חשובים באספקת תרופות וגנים ובטיפולים. חלקיקי זהב, כסף ופרמגנטיה הם בעלי הנתח הגדול ביותר במחקר שנעשה. הוכח כי הם בעלי תאימות ביולוגית טובה וזנים מסוימים של חלקיקים מגנטיים כבר פותחו והופצו כתרופות ממוקדות טיפוליות.
אלמנטים כבדים אלה מוצגים בדרך כלל למחקר באמצעות פלואורסצנטיות להערכת משלוח והפצה, אך המשקלים האטומיים שלהם הם כישורים טובים לניגודיות מוגברת בניתוח אלקטרונים backscatter באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). ספקטרוסקופיית רנטגן מפוזרת אנרגיה, המשתמשת בצילומי רנטגן אופייניים הנפלטים על אינטראקציה של קרן אלקטרונים עם המדגם כדי לזהות הרכב כימי, יכולה לשמש גם עם SEM. שיטות אלה יש את היתרונות של רזולוציה מוגברת וביטחון מוגבר בזיהוי, כמו EDS יכול להבטיח כי הנושא של תמונה הוא של הרכב הנכון, בעוד שיטות פלואורסצנטי הנוכחי יכול להתנתק מן הננו-חלקיקים יכול לדעוך במהירות בעת הדמיה.
הדגמה זו תבחן את התפלגות חלקיקי המתכת תלויי הגודל באיברי הגוף לאורך זמן. איברים מובאים ייבדקו עם SEM בגדלים שונים של חלקיקים בטווח של נקודות זמן לאחר מסירת חלקיקים לגוף.
Principles
קשה להיפטר יתר על המידה בחשיבותם של חלקיקים (NPs) עבור יישומים רפואיים. הם משמשים כסמים, נשאי סמים, סוכני ניגוד וכו '. עם זאת, על מנת להשתמש בסוג מסוים של חלקיק יש צורך לדעת איך ואיפה זה יופץ בכל איבר לאחר היישום וכמה זמן זה ייקח לפני שעזב את האיבר, ולאחר מכן, את הגוף. זה נקרא ייחוס ביולוגי שלה.
תהליך אספקת התרופה ננו-חלקיק יכול להשתנות במידה רבה במורכבותו, החל מתרופות פסיביות שאינן מכוונות לרקמה אלא משתחררות לכל הגוף, ועד למיקוד פעיל יותר של תרופות לאיבר או למיקום מדויקים מאוד. רוב התרופות והטיפולים ישתמשו פילוח פסיבי, אשר עדיין מראה הצלחה רבה בשל חדור משופרת ושמירה (אפקט EPR) בגידולים עם כמויות גדולות של זרימת דם וכמויות גבוהות של דליפת כלי דם. מלבד פילוח פסיבי, פילוח פעיל יכול להיעשות בעיבוד הננו-חלקיקים באמצעות התקשרות של ליגנדים ספציפיים לאתר הגידול, או שניתן לעשות זאת לאחר ההזרקה באמצעות הוספת כוח מגנטי לננו-חלקיקים המגנטיים. שדה מגנטי זה מושך את הננו-חלקיקים מזרם הדם לכיוון האזור הפגוע, ובכך מנמיך את זמן התרופה במחזור הדם ומגדיל את המינון לאזור הפגוע. שיטות משלוח שונות אלה אמורות להשפיע במידה רבה על התפלגות הננו-חלקיקים לאחר הטיפול, וניסוי זה נועד לחקור הן את ההתפלגות הראשונית שלהם והן את הפצתם לאורך זמן.
השיטות הנוכחיות של מדידת התפלגות ננו-חלקיקים כרוכות בדרך כלל בהצמדה של חלקיקי פלואורסצנטיות אל הננו-חלקיקים. בהתאם לריכוז הננו-חלקיקים, גודל אזור היעד ועוצמת הפלואורסצנטיות, ניתן לנתח עכברים שקופים באמצעות הדמיה אופטית בעודם בחיים כדי לקבוע אם החלקיקים נמצאים באזור הנכון. פלואורסצנטיות לאחר המוות יכולה לשמש גם כדי לקבוע את רמות הננו-חלקיקים באיברים שונים של עכברים. עם זאת, שיטות אלה חסרות את הרזולוציה של חלקיקים והצהרה כי הפלואורסצנטיות לא התנתקה מהננו-חלקיקים.
ההדגמה הנוכחית מנצלת מיקרוסקופיית אלקטרונים אחורית (BEM) וניתוח מבוסס ספקטרוסקופיה מפזר אנרגיה (EDS) כדי להבין את ההבחנה הביולוגית של חלקיקים מגנטיים (MENs) בהתאם לגודלם ולזמן המושקע בגוף. MENs במדגם הם חלקיקים בריום וטיטניום magnetoelectric שהוכנסו לאיברים עכבר באמצעות הזרקה ולאחר מכן באופן פסיבי ממוקד לאיברים. העכברים נמצאו מחוסרי הכרה ואיבריהם הוסרו ונשמרו בשבוע, 4 שבועות ו-8 שבועות לאחר ההזרקה. האיברים: הכבד, הטחול, הריאות, הכליות והמוח, נותחו לאחר מכן באמצעות מכונת מיקרוטום והוכנו בשיטות הכנה לדוגמה המתוארות בסרטון החינוכי "הדמיית SEM של דגימות ביולוגיות". כמצב של סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM), BEM יחד עם ניתוח EDS מספק ניתוח קומפוזיציה ברזולוציה גבוהה המאפשר לזהות חלקיקים בודדים בקוטר של עד 10 ננומטר. בינתיים, הדגמה זו יכולה להמחיש כיצד ניתן להשתמש בגלאים שונים כדי לזהות, לאשר ולמפה אלמנטים וחלקיקים שונים בסביבת מחקר וגם כיצד פרמטרים שונים יכולים להשפיע על התמונה המתקבלת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. הזרקת חלקיקים וקצירת איברים
- הזרק חלקיקים לעכבר מרדים תוך ורידי כדי לאפשר פילוח פסיבי.
- בנקודות הזמן הרצויות, כלומר, 1, 4 ו 8 שבועות, לאחר הזרקה, להמית באופן אנושי את העכברים על פי הנחיות האגודה הרפואית הווטרינרית האמריקאית (AVMA).
- פתח את חלל הגוף והסר בניתוח את איברי העניין. מניחים את האיברים ב-10% פוספט חוצץ פורמלין במיכל פוליפרופילן עד להכנת דגימה.
2. הכנת דגימת רקמות
- השתמש במלקחיים כדי להעביר את רקמת העכבר מהקיבוע לתחכון פוספט חוצץ (PBS). רוק המדגם במשך 30 דקות, החלפת PBS כל 10 דקות.
- הסר את הרקמה ולייבש עם קימבפה. לאחר מכן מניחים אותו בתבנית פלסטיק המכילה תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT). יש לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- למחרת, להעביר את המדגם להקפאה ולהגדיר את הטמפרטורה -23 °C (70 °F).
- סמן שקופיות עם סוג האיבר וגודל הננו-חלקיקים, והצב אותן על מדף בקריוסטט.
- מכסים את צ'אק הקריוסטט עם OCT ומניחים את הדגימה למעלה. מנמיכים את הבוכנה מעל המדגם ומאפשרים לו להתפרק במשך 3-5 דקות.
- הר את הצ'אק על מחזיק הדגימה וכוון אותו כך שהלהב יוכל לחתוך ישר על פני הדגימה הקפואה. קרב את הדגימה ללהב לעמידה מחוספסת. הגדר את העובי ל 30 מיקרומטר לפרוס כמה חלקים עד פרוסה לחתוך באופן שווה מיוצר.
- עבור לפונה בסדר על ידי הפחתת עובי המקטע ל 7-8 מיקרומטר. אסוף מקטע פרוס על-ידי הקשה על שקופית זכוכית מסומנת על הפרוסה. מקם שתי שקופיות על כל שקופית ואחסן בארון תקשורת של שקופיות. אפשר להתייבש בטמפרטורת החדר.
- לאחר יבש, לייבש את הדגימות על ידי טבילת מתלה שקופיות ב 50% אתנול במשך 3 דקות כדי להסיר OCT. לאחר מכן להעביר את המדף ל 80% אתנול במשך 3 דקות לפני הצבת המדף ביחס 1:1 של מתנול קר לאצטון במשך 10 דקות ב -20 °C (70 °F).
- הסר את מתלה השקופיות ולנקז את הממס עודף על מגבת נייר. לאחר 20-30 דקות, מניחים את השקופיות בקופסת שקופיות ומאחסנים במקפיא בטמפרטורה של -20 °C עד להדמיה.
3. הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות SEM ו- EDS
- הכן את המדגם כמתואר ב"הדמיית SEM של דגימות ביולוגיות". לאחר מכן טען את הדגימה לתוך SEM.
- הפעל את ה- SEM והתאם את מרחק העבודה לסביבות 5 מ"מ ואת זרם המתח והקרן המאיצה ל- 25 keV, שבדרך כלל יהיה גבוה מדי עבור מדגם ביולוגי. עם זאת, המדגם מצופה מוליכות והגנה.
- התחל הדמיה וזום סביב 1,000-2,000X הגדלה כדי לראות את המבנים שיכילו את הננו-חלקיקים. שים לב כי ללא זיהוי פיזור אחורי (BSD) לא ניתן להבחין ביניהם מתחת לעומק מסוים.
- הכנס את ה- BSD תחת אותם פרמטרים והזז את השלב בכיוון z לאותו מרחק עבודה כמו קודם.
- התחל הדמיה סביב אותה הגדלה ולבדוק כי אתה יכול לראות ניגודיות גבוהה בנוכחות חלקיקים. שמור את התמונות.
- השתמש בתצורות BSD שונות (שבהן המטענים בגלאי מתיישרים) כדי לבחור את התצורה המציגה את הניגודיות הגבוהה ביותר עבור הננו-חלקיקים.
- התקרבות לאזור ניגודיות גבוהה המציג ננו-חלקיק או גוש של חלקיקים.
- פתח את המצלמההשנייה של התא והצג בעת הכנסת ה- EDS למערכת על-ידי לחיצה על לחצן החוץ בקובץ המצורף של SEM. לאחר EDS הוא קרוב אבל לא נוגע BSD או האקדח, לשחרר את הכפתור.
- פתח את התוכנית האצטקית במחשב EDS (עדיין בתחנת עבודה) ורכוש תמונה מה- SEM. השתמש בשיטת "נקודה וירה" כדי ללחוץ על אזור צפוף מאוד בניגוד וננו-חלקיקים.
- EDS יציג את הספקטרום של צילומי רנטגן אופייניים מאותה נקודה. חפשו פסגות בריום וטיטניום להזדהות בגרף. זה מאשר כי מה שאתה מסתכל הם אכן חלקיקים ולא כל סוג של זיהום.
- חזור לדגימה והשתמש בתוכנת האטלס כדי למפות את גבולות האיבר בשקופית. בחר את פרוטוקול "עוגב" ליצירת תמונת פסיפס של האזור, ותן לו לפעול (פעולה זו יכולה להימשך מספר שעות לכל היותר).
- לאחר התמונה המורכבת נוצר ותפר על ידי התוכנה, לייצא אותו כקובץ Tif.
- פתח את קובץ Tif ב- ImageJ, תוכנת קוד פתוח, והתאם ערכי סף ניגודיות כדי להדגיש את האזורים של ניגודיות גבוהה מאוד (כלומר, הננו-חלקיקים). השתמש בפונקציות מוכללות כדי לכמת את נפח הננו-חלקיקים באמצעות גודל הפיקסלים המוגדר בפרוטוקול Organ (צריך להיות בסביבות 100 ננומטר).
- בעוד הליך זה מתייחס רק מדגם 1 שבוע של ריאה העכבר, הליך זה חוזר על עצמו עם דגימות משבועות אחרים ואיברים אחרים כדי להרכיב גרף המציג התפלגות.
- לאחר חישוב ההפצה הביולוגית עבור כל איבר עבור כל שבוע, גרפים biodistribution יציגו את השינויים ב- biodistribution וריכוז של חלקיקים במהלך 8 השבועות. אלה מראים את ריכוז השיא וגם מספקים מידע על כמה זמן לוקח עבור חלקיקים לנקות מן האיבר.
חלקיקים מתכתיים ומגנטיים נמצאים בשימוש נרחב כמו nanocarriers עבור משלוח סמים. ואת ההבחנה הביולוגית שלהם ברקמות חיוני כדי להעריך את היעילות הטיפולית שלהם ובטיחות. Nanocarriers הם חלקיקי תת מיקרון, מוגבל בדרך כלל פחות מ 200 ננומטר, כי ניתן לטעון עם סוכנים טיפוליים. בגלל גודלם הם מסוגלים לגשת לאתרים ואיברים רבים בגוף. איפה החלקיקים בסופו של דבר בגוף, המכונה biodistribution שלהם, הוא פרמטר חשוב המשמש להערכת בטיחות, לייעל מנונים ולשפר פילוח סמים.
בסרטון זה יתואר העקרונות הבסיסיים של אספקת תרופות ממוקדות ותודגם שיטה להערכת ייחוס ביולוגי באמצעות טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה. יישומים אחרים של נשאים מבוססי חלקיקים יידונו גם הם.
הבה נתחיל בדיון ביסודות הננו-חלקיקים ונבין מדוע הם מפותחים כנשאי סמים.
ראשית, חלקיקים בקנה מידה ננו, אשר יכול להיות גם פולימרי, liposomal, או מתכתי הם בדרך כלל תאימות ביולוגית, כלומר הם אינם מזיקים או מגיבים לרקמה חיה ואינם מעוררים תגובה חיסונית. עם זאת, מחקרי ננוטוקסיולוגיה חייבים להתבצע על מנת להבין כיצד החומרים וגודל החלקיקים משפיעים על ייחוס ביולוגי בגוף.
שנית, גודלם הקטן מאפשר את ההחצנה שלהם דרך האנדהל באתרים דלקתיים, כגון בגידולים, וכתוצאה מכך ספיגה תאית יעילה. ככל שתאים סרטניים מתחלקים, יש צורך באספקת כלי דם כדי לספק חומרים מזינים וחמצן ולתמוך בצמיחת הגידול. כלי דם אלה נוצרים במהירות ולכן הם בדרך כלל חריגים ויעילים, המכילים פערים גדולים בבטנה האנדותל שלהם, וכתוצאה מכך vasculature דולף ועלייה בחמידות. הננו-חלקיקים מסוגלים אז לברוח ממחזור הדם ולהצטבר בתוך המיקרו-סביבה של הגידול. זה נקרא פילוח פסיבי שבו nanocarrier מגיע לאיבר היעד באמצעות תופעה המכונה אפקט EPR או חדור משופרת ושימור להשפיע.
לבסוף, חלקיקים אלה יש שטח פנים גדול שניתן לתפקד עם ליגנדים ספציפיים כגון נוגדנים או חלבונים. בפילוח פעיל, ליגנדים אלה יכולים לזהות ולהיקשר לקולטנים המתבטאים יתר על המידה על ידי תאים באתר הגידול. אינטראקציות ספציפיות בין ligands על פני השטח nanocarrier ואת קולטני התא מפעיל אנדוציטוזיס בתיווך קולטן להקל על ספיגת התא.
עכשיו שאנחנו מבינים את היסודות של אספקת תרופות ננו-חלקיקים, בואו נראה הדגמה שמשתמשת בהדמיה ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע את ההפצה הביולוגית של חלקיקים מתכתיים במודל עכבר.
ראשית, להכין את חלקיקים שיוזרקו לתוך העכבר. כאן נעשה שימוש בבריום 30 ננומטר וחלקיקי טיטניום. לאחר העכבר כבר מרדים להזריק את חלקיקים דרך הווריד דרך הווריד הזנב. אפשר לעכבר להתאושש בזמן שהם מכוונים באופן פסיבי לאיברים במשך שבוע, ארבעה ושמונה שבועות.
בנקודת הזמן המתאימה לאחר ההמתה באופן אנושי להרדים את העכברים על פי הנחיות AVMA. לאחר מכן פתח את חלל הגוף והסר בניתוח את איברי העניין כגון הטחול, הכליות, הכבד והריאות. ולאחסן את האיברים ב-10% פורמרין חוצץ פוספט עד לניתוח.
עכשיו להשתמש במלקחיים כדי להעביר את רקמת העכבר מן הקיבויעה לתוך תמיסת מלח פוספט-חוצץ. רוק המדגם במשך 30 דקות החלפת PBS כל 10 דקות כדי להסיר קיבוע עודף. ואז להסיר את הרקמה מן השייקר. הוסיפו תרכובת אופטימלית לטמפרטורת חיתוך המכילה גליקולים ושיסנים מסיסים במים לתבנית פלסטיק מסומנת.
ייבשו את הרקמה בקימיפי ואז הניחו אותה בתבנית הפלסטיק. ממלאים את התבנית בתרכובת OCT המכסה את הרקמה ומניחים בשקית ניילון. שמים את השקית בדלי המכיל קרח יבש ומעבירים למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
למחרת להסיר את המדגם מהמקפיא ומניחים על קרח יבש תוך כדי הובלה להקפאה. הגדר את טמפרטורת התא למינוס 23 מעלות ולאחר מכן להעביר את המדגם להקפאה. תוויות שקופיות עם סוג האיבר וגודל הננו-חלקיק של המדגם שתחלק. אז תפעיל את הקריוסטט. הבא לכסות את צ'אק cryostat עם OCT. לאחר מכן להסיר את המדגם מן התבנית ומניחים אותו על גבי צ'אק. הר את הצ'אק על מחזיק הדגימה וכוון והתאימו כך שהלהב יחתך ישר על פני הדגימה הקפואה. עכשיו לקרב את המדגם ללהב ולהגדיר את העובי ל 30 מיקרומטר עבור פונה מחוספס. סובבו את גלגל היד לפרוס חלקים בעובי 30 מיקרומטר והמשיכו בחיתוך עד לחיתוך פרוסת רקמה אחידה. לפונה עדינה, יש להגדיר את עובי המקטע לשבעה עד שמונה מיקרומטרים ולחתוך את הדגימה.
אסוף את המקטעים על-ידי הקשה על שקופית זכוכית עם תווית על הפרוסה. לאחר מכן הוסיפו את השקופיות למדף והאוויר יבש בטמפרטורת החדר. לאחר יבש, שוב ושוב לטבול את מתלה שקופיות ב 50% אתנול במשך שלוש דקות כדי להסיר את OCT. להעביר את המדף ל 80% אתנול ולטבול במשך שלוש דקות. לאחר מכן להעביר את המדף ליחס של אחד לאחד של מתנול קר לאצטלון ומניחים במקפיא במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות, להסיר את מתלה שקופיות מהמקפיא ולנקז אותו על מגבת נייר. כאשר יבש, למקם את השקופיות בתיבת שקופית ולאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס עד השימוש.
עכשיו בואו לדמות רקמת ריאה עכבר שנאסף שבוע לאחר ההטלה עם 30 ננומטר בריום וחלקיקי טיטניום כדי לקבוע את ייחוס הביולוגי שלהם. כדי להתחיל, תחילה טען שקופית מוכנה על שלב SEM. כדי ללמוד כיצד לתלוש מעיל ולהכין את המדגם שלך, אנא צפה בסרטון הקודם באוסף זה. לאחר מכן לטעון את הבמה לתוך תא SEM. לאחר המדגם הוא בשדה הראייה, להעביר את המדגם אנכית למרחק עבודה של כחמישה מילימטרים. הפעל את קרן האלקטרונים ובחר את הגלאי עבור אלקטרונים משניים. לאחר מכן הגדר את מתח האצת הקרן ל-25 קילו-קטרון וולט. כדי להתחיל בהדמיה, הגדל את הדגימה להגדלה של כ- 1,000 עד 2,000X. בהגדלה זו המבנה המכיל את הננו-חלקיקים צריך להיות גלוי למרות הננו-חלקיקים אינם. זה נקרא התמונה המשנית.
כעת הפעילו את מצב זיהוי האלקטרונים backscatter במודול SEM כדי לדמיין את הננו-חלקיקים. הזז את השלב בכיוון Z כדי להשיג את אותו מרחק עבודה של חמישה מילימטרים המשמש לעיל. התאם את התצורה של גלאי ה-backscatter והשתמש בהטיות מתח שונות עבור לוחות הזיהוי עד שהתמונה תהיה חדה. אזורים של ניגודיות גבוהה, הננו-חלקיקים, צריכים להיות גלויים כעת. זו התמונה המרופטת לאחור. לכוד ושמור את התמונה.
לאחר מכן, להשיג ספקטרוסקופיית רנטגן פיזור אנרגיה או נתוני EDS של המדגם. התקרב לאזור הניגודיות הגבוהה של גוש של חלקיקים. לאחר מכן פתח את המצלמה השנייה בתא והורד את ה- EDS למערכת. צפה במסך המצלמה כדי להבטיח כי EDS מתקרב, אבל לא לגעת BSD או אקדח האלקטרונים. לאחר מכן פתח את תוכנת המיקרואנליזה ורכוש תמונה. השתמש בעכבר כדי לבחור אזור עניין לניתוח נוסף. לאחר מכן מוצג ספקטרום רנטגן עבור אזור זה. כאן הפסגות מייצגות בריום וטיטניום המאשרים את נוכחותם של חלקיקים מתכתיים במדגם. כעת פתחו תוכנה לניתוח נתונים איכותיים ומיפו את גבולות האיבר בשקופית. לאחר מכן בחר והפעל את הפרוטוקול המתאים מהתפריט כדי ליצור תמונת פסיפס של האיבר. פעולה זו עשויה להימשך מספר שעות.
לאחר השלמתו, יצא אותו כקובץ TIF ופתח את הקובץ ב- ImageJ. התאם את ערכי סף הניגודיות כדי להדגיש אזורים בעלי ניגודיות גבוהה מאוד, הננו-חלקיקים. לאחר מכן בחר לנתח חלקיקים כדי להשיג את המספר הממוצע של חלקיקים באיבר ואת אחוז האזור של האיבר המכיל חלקיקים.
חזור על כל השלבים בהליך זה עבור דגימות רקמה שנותרו מנקודות זמן ואיברים אחרים. לאחר איסוף כל הנתונים, הידור אותם לגרף ייחוס ביולוגי.
עכשיו בואו לנתח את התמונות כדי לקבוע את biodistribution וללמוד איך הגוף מעובד הננו-חלקיקים. התווה תחילה את התפלגות החלקיקים הנמדדת כפונקציה של זמן עבור כל הדגימות שנותחו. זוהי התפלגות של חלקיקים בגודל 30 ננומטר באיברי עכבר שונים לאורך זמן. יש ירידה כוללת בננו-חלקיקים לאחר שמונה שבועות המצביעים על אישור הננו-חלקיק מהגוף.
עם זאת, יש ריכוז ננו-חלקיקים מוגבר בכבד לאחר ארבעה שבועות. זה מצביע על כך שהגוף עשוי לעבד את 30 ננומטר בריום וטיטניום חלקיקים המשמשים במחקר זה כרעלן. ניתוח זה יכול להתבצע גם כדי להעריך כיצד גודל הננו-חלקיק משפיע על הביו-ייחוס שלו בגוף. שינוי גודל הננו-חלקיקים השפיע על קצב הספיגה התאית הכוללת ועל קצב הסיווג.
חלקיקים וננו-קרטירים נמצאים בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי ויש להם יישומים כסוכנים הדמיה, אבחון וטיפולי. חלקיקים מפותחים לשימוש באספקת חיסון נגד מגוון רחב של מחלות זיהומיות מכיוון שהם מגנים על רכיבי החיסון מפני השפלה וממקסמים את הגירוי החיסוני. שלשולים רב-שכבתיים מקושרים בין-דו-שכבתיים, או ICMVs, מפותחים לצורך אינדוקציה של תגובות חיוביות של תאי T מסוג CD8.
ICMVs אלה לוקליזציה במיוחד בבלוטות הלימפה של עכברים לאספקת חיסון יעילה ועוררו תגובות חיסוניות חזקות נגד אנטיגנים מלריה ותאי גידול. חלקיקים מתכתיים משמשים לעתים קרובות כסוכני ניגודיות בהדמיית תהודה מגנטית כדי לדמיין את מבנה הרקמה ותפקוד לגילוי מוקדם של מחלות. חלקיקי תחמוצת ברזל הם בדיקות אבחון שימושיות. כאשר מסונתזים עם moiety ביספוספונט, חלקיקים אלה מצטברים במהירות ובסלקטיביות בלוחותthertherosclerotic ומאפשרים הדמיה שלהם בתוך שעה לאבחון מהיר.
לאחרונה, nanocarriers טעון פותחו כאסטרטגיה לזהות בו זמנית סרטן בשלב מוקדם ולספק סוכנים כימותרפיים. ננו-קריירים אלה נקראים תרנוסטיקה מכיוון שהם משלבים יכולות אבחון וטיפוליות.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על קביעת הייחוס הביולוגי של נושאות הננו-דראג. עכשיו אתה צריך לדעת את העקרונות הבסיסיים של נשאי nanodrug, כיצד לזהות nanocarriers בדגימות רקמה באמצעות SEM ברזולוציה גבוהה, ולקבוע את חלוקת הביולוגית שלהם, וכמה יישומים של חלקיקים בהנדסה ביו-רפואית.
תודה שצפיתם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
התמונות הבאות ממחישות כיצד ניתן לחלץ את נתוני הייחוס הביולוגי מהתמונות. הניגודיות של הננו-חלקיקים מזוהה באמצעות גלאי ה-BSE, כפי שמוצג באיור 1. נתוני EDS, המוצגים באיור 2, מראים היכן אשכולות של טיטניום ובריום תואמים לאזורים בעלי ניגודיות גבוהה בתמונות שנאספו באמצעות גלאי ה-BSE.
איור 1: תמונת אלקטרונים משנית של הריאה (משמאל) ותמונת אלקטרונים backscatter של אותו אזור (מימין).
איור 2: נתוני EDS, המציגים אשכולות של טיטניום ובריום באמצע התחתון ובחלק העליון של התמונה, המתאימים לאזורים בעלי ניגודיות גבוהה שנראו באמצעות גלאי BSE.
בתמונה מורכבת, כפי שמוצג באיור 3, העיגולים האדומים מציינים אזורים בעלי ניגודיות גבוהה ומציעים את המיקומים המכילים חלקיקים. לאחר מכן ניתן לחשב את נפח אזורי הננו-חלקיקים הלבנים ולהיחשב בממוצע על פני גודל האיבר עצמו. זה מספק חישוב של האזור שנכבש על ידי חלקיקים. לאחר מכן, ניתן לצבור נתונים מאיברים מרובים במשך מספר שבועות כדי להראות את התפלגות החלקיקים הממוצעת במיקרון מרובע של התמונה. נתונים אלה מוצגים באיור 4, המציג ירידה כוללת בננו-חלקיקים בגודל 30 ננומטר במהלך 8 השבועות, אינדיקציה לאישור. דבר נוסף שיש לציין הוא הגידול של ריכוז הננו-חלקיקים בכבד לאחר 4 שבועות. זה נותן מידע על איך הגוף מעבד את הננו-חלקיקים, ואת הנדידה הגדולה של חלקיקים לכבד להראות כי הגוף עשוי להיות עיבוד הננו-חלקיקים כרעלנים. זהו מידע חשוב לדעת בעת פיתוח ובדיקת חלקיקים ב vivo.
באופן דומה, נתונים על התפלגות האיברים של חלקיקים בגדלים שונים מוצגים באיור 5. גרף זה מדגים כיצד הגודל המשתנה של הננו-חלקיקים יכול להגדיל את הספיגה הכוללת לתאים של הננו-חלקיקים או להגדיל את קצב הסיווג.
איור 3: מקטעים של התמונה המורכבת שנוצרה באמצעות תוכנת אטלס.
איור 4: Biodistribution של 30 ננו-חלקיקים ננומטריים בריאה, בכבד, בטחול ובכליות לאחר הזרקה בעכבר.
איור 5: ייחוס ביולוגי של חלקיקים בגודל משתנה לאורך זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
חלקיקים נמצאים בשימוש נרחב במחקר הנדסי ביו-רפואי ויש להם יישומים כסוכנים הדמיה, אבחון וטיפול. לדוגמה, חלקיקים מפותחים לשימוש באספקת חיסון. על ידי אנקפסולציה של החיסון בננו-חלקיקים, רכיבי החיסון מוגנים מפני השפלה וממריצים תגובה חיסונית מקסימלית.
ביישומי הדמיית תהודה מגנטית, חלקיקים מתכתיים משמשים לעתים קרובות כסוכני ניגוד כדי לדמיין את מבנה הרקמה ואת התפקוד. הם בדיקות אבחון שימושיות בזיהוי של לוחות artherosclerotic.
חלקיקים המשלבים יכולות אבחון וטיפול נקראים תרנוסטיקה. יש חלקיקים בו זמנית לזהות גידולים בשלב מוקדם ולספק סוכנים כימותרפיים.
ניסוי זה הדגים כיצד ניתן להשתמש ב- SEM על מנת לחשב את ההפצה הביולוגית של חלקיקים המוזרקים לגוף לאורך זמן. ניסוי זה ניתן לשכפל על דגימות חלקיקים אחרים או תרביות תאים שיש להם חלקיקים כדרך לנתח ריכוזים, חדירה לתא, או אישור של חלקיקים.
הדגמה זו התמקדה במחקר ומדידת ההפצה הביולוגית של חלקיקים באמצעות SEM. התוצאות של מדידות כאלה יכולות להיות חשובות בתחומים רבים. חברות תרופות ומתקני מחקר יכולים להשתמש במחקרים אלה לפיתוח תרופות ומחקר סוכן ניגודיות.
רשימת חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
| ציוד | |||
| פרוסה בחתך (מוכנה לפני) | |||
| תוכנת קוד פתוח של ImageJ | |||
| קרן צולבת SEM | זייס | ||
| ATLAS 3-D SEM תוכנה | זייס |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Hadjikhani, Ali. "Nanofabrication and Spectroscopy of Magnetic Nanostructures Using a Focused Ion Beam." (2016).
