나노 약물 운반체의 생체 분포: SEM 응용

의료 용 응용 프로그램에 대한 나노 입자 (NPs)의 중요성을 과대 평가하기는 어렵습니다. 그들은 약물, 마약 운반대, 조영제 등으로 사용됩니다. 그러나, 특정 유형의 나노입자를 사용하려면 적용 후 각 기관에 어떻게 그리고 어디에 분배되는지, 그리고 장기를 떠나기 전에 얼마나 오래 걸리는지, 그 이후에 는 신체에 대해 알아야 한다. 이를 바이오 유통이라고 합니다.

나노 입자 약물 전달의 과정은 조직을 대상으로하지 않고 대신 몸 전체에 방출되는 수동 약물에서 매우 정확한 기관 이나 위치에 약물의 더 적극적으로 조작 된 타겟팅에 이르기까지 복잡성에서 크게 다를 수 있습니다. 대부분의 의약품과 치료법은 많은 양의 혈류량과 많은 양의 혈관 누출을 가진 종양의 향상된 투과성 및 보존 (EPR 효과)으로 인해 여전히 큰 성공을 보여주는 수동 타겟팅을 사용합니다. 수동 타겟팅 외에도, 활성 표적은 종양 부위 특이적 리간드의 부착을 통해 나노입자의 처리에서 수행될 수 있거나, 자기 나노입자에 자기력을 추가하는 방법으로 주입 후 수행될 수 있다. 이 자기장은 혈류에서 고통받는 영역으로 나노 입자를 끌어 내어 혈류에서 보내는 약의 시간을 낮추고 영향을받는 부위로 용량을 증가시킵니다. 이러한 다른 전달 방법은 처리 후에 나노 입자의 분포에 크게 영향을 미달해야 하며, 이 실험은 초기 분포와 시간이 지남에 따라 분포를 조사하는 것을 목표로 합니다.

나노 입자 분포 측정의 현재 방법은 일반적으로 나노 입자에 형광 입자의 부착을 포함한다. 나노입자의 농도, 표적 영역의 크기, 형광의 강도에 따라 반투명 마우스는 광학 이미징을 사용하여 분석할 수 있으며, 여전히 살아 있는 동안 입자가 올바른 영역에 있는지 확인할 수 있다. 사후 형광은 또한 마우스의 다른 기관에서 나노 입자 수준을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 나노 입자의 해상도와 형광이 나노 입자에서 분리되지 않았음을 긍정부족.

현재 의 데모는 백산전자 현미경 검사법(BEM) 및 에너지 분산 분광법(EDS) 기반 분석을 활용하여 자기 전열 나노 입자(MEN)의 생체 분포를 이해하기 위해 몸체에서 소요되는 시간과 시간에 따라 이를 이해합니다. 샘플의 MEN은 바륨 및 티타늄 자기 전성 나노 입자로 주입을 통해 마우스 장기에 도입한 다음 수동적으로 장기를 대상으로 합니다. 마우스는 의식을 잃고 그들의 장기를 제거하고 1 주에 보존, 4 주, 그리고 8 주 주입 후 주. 장기: 간, 비장, 폐, 신장 및 뇌는 마이크로토메 기계를 사용하여 단면화하고 교육 비디오 "생물학적 샘플의 SEM 이미징"에 설명된 샘플 준비 방법을 사용하여 준비했습니다.  전자 현미경 검사(SEM)를 스캔하는 모드로서, BEM은 EDS 분석과 함께 직경 이 10nm의 작은 개별 나노 입자를 검출할 수 있는 고해상도 조성 분석을 제공한다. 한편, 이 데모는 연구 환경에서 다양한 검출기를 사용하여 다양한 요소와 입자를 감지, 확인 및 매핑하는 방법과 다른 매개 변수가 결과 이미지에 미치는 영향을 설명할 수 있습니다.

1. 나노 입자 주입 및 장기 수확

1. 나노 입자를 정맥 내 마취 마우스에 주입하여 수동 타겟팅을 허용합니다.
2. 원하는 시점에서, 즉, 1, 4 및 8주, 후 주사, 미국 수의학 협회(AVMA) 지침에 따라 마우스를 인도적으로 안락사시킵니다.
3. 신체 구멍을 열고 외과적으로 관심있는 장기를 제거하십시오. 시료 준비 전까지 10% 인산염 완충 포르말린을 폴리프로필렌 용기에 넣었다.

2. 조직 샘플 준비

1. 포셉을 사용하여 마우스 조직을 고정된 식염수(PBS)로 이송합니다. 샘플을 30분 간 흔들어 10분마다 PBS를 교체합니다.
2. 조직을 제거하고 김스 와이프로 건조. 그런 다음 최적의 절삭 온도 화합물 (OCT)을 포함하는 플라스틱 금형에 놓습니다. 하룻밤 -80 °C에 보관하십시오.
3. 다음 날, 샘플을 극저온으로 옮기고 온도를 -23°C로 설정합니다.
4. 오르간 유형과 나노 입자 크기의 슬라이드를 라벨로 표시하고 냉동고의 선반에 놓습니다.
5. 10월로 저온척을 덮고 샘플을 위에 놓습니다. 추출기 플런저를 샘플 위로 낮추고 3-5분 동안 평형화할 수 있도록 합니다.
6. 척을 시편 홀더에 장착하고 블레이드가 얼어 붙은 시료를 직선으로 절단할 수 있도록 방향을 지정합니다. 샘플을 블레이드 가까이에 가져와 거친 향을 합니다. 두께를 30 μm로 설정하고 균등하게 절단 된 슬라이스가 생성 될 때까지 여러 섹션을 슬라이스합니다.
7. 단면 두께를 7-8 μm로 줄임으로써 미세한 면으로 전환합니다. 슬라이스에 레이블이 붙은 유리 슬라이드를 눌러 슬라이스 섹션을 수집합니다. 슬라이드 2개를 각 슬라이드에 놓고 슬라이드 랙에 보관합니다. 실온에서 건조시키십시오.
8. 일단 건조되면 10월을 제거하기 위해 슬라이드 랙을 50% 에탄올에 담그어 샘플을 탈수합니다. 그런 다음 랙을 80% 에탄올로 전송한 후 -20°C에서 10분 동안 10분 동안 차가운 메탄올의 1:1 비율로 아세톤으로 랙을 배치한다.
9. 슬라이드 랙을 제거하고 종이 타월에 과도한 용매를 배출합니다. 20-30분 후 슬라이드를 슬라이드 상자에 놓고 이미징이 될 때까지 -20°C의 냉동실에 보관하십시오.

3. SEM 및 EDS를 이용한 고해상도 이미징

1. "생물학적 샘플의 SEM 이미징"에 설명된 바와 같이 샘플을 준비합니다. 그런 다음 샘플을 SEM에 로드합니다.
2. SEM을 켜고 작동 거리를 약 5mm로 조정하고 가속 전압 및 빔 전류를 25 keV로 조정하여 일반적으로 생물학적 시료에 대해 너무 높습니다. 그러나 샘플은 전도도 및 보호를 위해 코팅됩니다.
3. 이미징을 시작하고 약 1,000-2,000X 배율로 확대하여 나노 입자를 포함하는 구조를 확인하십시오. BSD(백 스캐스트 감지)가 없으면 특정 깊이 이하로 구분할 수 없습니다.
4. 동일한 매개 변수 아래에 BSD를 삽입하고 z 방향으로 스테이지를 이전과 동일한 작업 거리로 이동합니다.
5. 동일한 배율 의 주위에 화상 진찰을 시작하고 나노 입자의 존재에 있는 높은 대비를 볼 수 있는지 확인하십시오. 이미지를 저장합니다.
6. 다른 BSD 구성(검출기의 전하가 정렬되는 경우)을 사용하여 나노 입자에 대해 가장 높은 대비를 보이는 구성을 선택합니다.
7. 나노 입자 또는 나노 입자의 덩어리를 보여주는 높은 조영 영역에 확대.
8. 챔버의^2ND 카메라를 열고 SEM 부착물의 다운 버튼을 눌러 시스템에 EDS를 삽입하는 것을 지켜보십시오. EDS가 가깝지만 BSD 또는 총을 건드리지 않는 경우 버튼을 놓습니다.
9. EDS 컴퓨터에서 Aztec 프로그램을 열고(여전히 워크스테이션상태)에서 이미지를 획득합니다.
10. EDS는 그 시점부터 특징적인 엑스레이의 스펙트럼을 보여줍니다. 그래프에서 식별할 바륨과 티타늄 피크를 모두 찾습니다. 이것은 당신이보고있는 것은 실제로 나노 입자이며 오염의 어떤 종류가 아니라는 것을 확인합니다.
11. 샘플로 돌아가 아틀라스 소프트웨어를 사용하여 슬라이드에 있는 기관의 테두리를 매핑합니다. 영역의 모자이크 이미지를 만들기 위한 "Organ" 프로토콜을 선택하고 실행하도록 합니다(대부분의 시간이 몇 시간 걸릴 수 있음).
12. 합성 이미지가 소프트웨어에 의해 생성되고 스티치되면 Tif 파일로 내보냅니다.
13. 오픈 소스 소프트웨어인 ImageJ에서 Tif 파일을 열고 대비 임계값 값을 조정하여 매우 높은 콘트라스트 영역(예: 나노입자)을 강조표시합니다. 내장 함수를 사용하여 Organ 프로토콜에 정의된 픽셀 크기를 사용하여 나노 입자의 부피를 정량화합니다(약 100nm여야 함).
14. 이 절차는 마우스 폐의 1 주 샘플을 참조하는 동안,이 절차는 분포를 보여주는 그래프를 컴파일하기 위해 다른 주 및 기타 장기의 샘플과 함께 반복된다.
15. 매주 각 기관에 대한 바이오 분포를 계산한 후, 바이오 유통 그래프는 8주 동안 나노입자의 생체 분포 및 농도의 변화를 보여줄 것이다. 이들은 피크 농도를 보여주고 또한 나노 입자가 기관에서 지우는 데 걸리는 거리에 대한 정보를 제공합니다.

다음 이미지는 이미지에서 생체 분포 데이터를 추출하는 방법을 보여 줍니다. 도 1에 도시된 바와 같이, 나노입자의 대비는 BSE 검출기를 사용하여 검출된다. 도 2에 제시되는 EDS 데이터는 티타늄과 바륨 클러스터가 BSE 검출기를 사용하여 수집된 이미지에서 고대비 영역에 해당하는 위치를 보여줍니다.

그림 1: 폐의 이차 전자 이미지(왼쪽)와 백스캐터 전자 이미지(오른쪽).

그림 2: EDS 데이터는 BSE 검출기를 사용하여 본 고대비 영역에 대응하는 이미지의 하단 중간 및 상단에 티타늄및 바륨 클러스터를 표시합니다.

도 3에 도시된 복합 이미지에서 적색 원은 고대비 영역을 나타내고 나노입자를 포함하는 위치를 제안합니다. 백색 나노 입자 영역의 부피는 기관 자체의 크기에 따라 계산되고 평균될 수 있습니다. 이것은 나노 입자에 의해 점유된 면적의 계산을 제공합니다. 그런 다음, 몇 주 동안 여러 기관의 데이터를 집계하여 이미지의 제곱 미크로평균 입자 분포를 표시할 수 있다. 이러한 데이터는 도 4에 제시되며, 이는 8주 동안 30nm 크기의 나노입자의 전반적인 감소를 보여 주며, 이는 클리어런스의 표시이다. 주의해야 할 또 다른 점은 4주 후에 간에서 나노입자 농도가 증가한다는 것입니다. 이것은 바디가 나노 입자를 처리하는 방법에 대한 정보를 제공하고, 간으로 입자의 큰 이동은 바디가 독소로 나노 입자를 처리 할 수 있음을 보여줍니다. 이것은 생체 내에서 나노 입자를 개발하고 테스트 할 때 알아야 할 중요한 정보입니다.

마찬가지로, 다양한 크기의 입자의 장기 분포에 대한 데이터는 도 5에 제시된다. 이 그래프는 나노 입자의 변화하는 크기가 나노 입자의 세포로 전체 적인 섭취량을 증가하거나 클리어런스 속도를 증가시킬 수있는 방법을 보여줍니다.

그림 3: 아틀라스 소프트웨어를 사용하여 만든 합성 이미지의 섹션입니다.

그림 4: 마우스에 주입 후 폐, 간, 비장 및 신장에 30 nm 나노 입자의 생체 분포.

그림 5: 시간이 지남에 따라 다양한 크기의 나노 입자의 생체 분포.

나노 입자는 생물 의학 공학 연구에 널리 사용되며 이미징, 진단 및 치료 약제로 응용 프로그램이 있습니다. 예를 들어, 나노 입자는 백신 전달에 사용하기 위해 개발되고 있다. 나노 입자에 있는 백신을 캡슐화함으로써, 백신 성분은 분해로부터 보호되고 최대 면역 반응을 자극합니다.

자기 공명 화상 진찰 응용 프로그램에서, 금속 나노 입자는 조직 구조 및 기능을 시각화하기 위하여 조영제로 수시로 이용됩니다. 그들은 귀족 경화성 플라크의 검출에 유용한 진단 프로브입니다.

진단 및 치료 능력을 통합하는 나노 입자는 테라노스틱이라고합니다. 나노 입자는 동시에 초기 단계 종양을 검출하고 화학 요법 에이전트를 전달합니다.

이 실험은 시간이 지남에 따라 체내에 주입된 나노 입자의 생체 분포를 계산하기 위해 SEM을 어떻게 사용할 수 있는지 를 입증하였다. 이 실험은 나노입자의 농도, 세포 침투 또는 클리어런스를 분석하는 방법으로 나노입자가 있는 다른 나노입자 샘플 또는 세포 배양에서 복제될 수 있다.

이 데모는 SEM을 사용하여 나노 입자의 생체 분포를 연구하고 측정하는 데 중점을 두습니다. 이러한 측정의 결과는 많은 분야에서 중요할 수 있습니다. 제약 회사 및 연구 시설은 약물 개발 및 조영제 연구에 이러한 연구를 사용할 수 있습니다.

재료 목록