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Imágenes SEM de muestras biológicas

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La microscopía electrónica de barrido, o SEM, se utiliza a menudo para crear imágenes de materiales biológicos a escala nanométrica. Los microscopios ópticos, que utilizan la luz para tomar una imagen de una muestra, se utilizan en gran medida para imágenes biológicas no destructivas, sin embargo, su resolución y profundidad de campo es limitada, por lo que se utiliza SEM para lograr una resolución más alta hasta un nanómetro.

En SEM, un haz de electrones se enfoca a través de una serie de lentes de condensador, que luego golpea la muestra. Cuando el haz golpea la muestra, los electrones en la superficie son dispersados y medidos por el detector.

En este vídeo, discutiremos cómo funciona SEM, demostraremos cómo crear una imagen de una muestra biológica en el laboratorio y, por último, introduciremos algunas técnicas utilizadas para tomar imágenes sensibles.

Un microscopio electrónico de barrido utiliza un haz de electrones de alta energía, que es generado por una pistola de electrones equipada con un cátodo de filamento. Los electrones generados se propulsan hacia el ánodo y luego se enfocan usando lentes de condensador antes de entrar en la lente objetivo. La lente objetivo está calibrada para enfocar el haz en la muestra, donde se escanea ráster a través de la superficie. Las interacciones de los electrones con los átomos en la muestra se utilizan para estudiar la topografía, la composición elemental y la cristalinidad de la muestra. Cuando el haz de electrones incidente golpea la superficie, emite electrones secundarios y retrodispersos. Los electrones secundarios son electrones de baja energía que se emiten de la muestra cerca de la superficie y proporcionan información topográfica.

Los electrones retrodispersos, por otro lado, se reflejan en la dirección opuesta del haz incidente. La intensidad de interacción aumenta con el aumento del peso atómico, lo que permite al usuario distinguir las diferencias de composición. Se necesita una consideración especial para tomar imágenes biológicas con SEM, ya que se utiliza un alto vacío, por lo que las muestras biológicas, que normalmente tienen un alto contenido de agua, deben secarse primero. Esto puede causar el colapso de la estructura de muestras sensibles, especialmente las células. Por lo tanto, las células se tratan con un fijador, se enjuagan y luego se deshidratan lentamente mediante el lavado con cantidades crecientes de etanol.

Para materiales biológicos rígidos, como el andamio de tejido colágeno-hidroxiapatita utilizado en esta demostración, la muestra se seca durante un período de varios días bajo alto vacío.

Por último, dado que las imágenes SEM típicas requieren una superficie conductora, las muestras biológicas a menudo están recubiertas con una fina capa de metal antes de la toma de imágenes. Ahora que hemos discutido cómo funciona SEM y cómo preparar una muestra biológica para la toma de imágenes, echemos un vistazo a cómo preparar e imágenes de un andamio de tejido de colágeno-hidroxiapatita.

En primer lugar, monte la muestra de biomaterial en un talón SEM utilizando cinta de carbono conductora y asegúrese de que la muestra esté seca y no tenga contaminación en la superficie.

A continuación, coloque la muestra montada en la cámara de un revestimiento de esputo, bombee la cámara y cubra la muestra durante unos 40 segundos para lograr una capa delgada de metal de cuatro a seis nómetros de espesor, en este caso de oro, con una cobertura adecuada. Una vez recubierta, retire la muestra y utilice cinta conductora para conectar el talón a la parte superior de la muestra, que ahora está recubierta con metal conductor.

Finalmente, monte el talón en el escenario SEM y apriete el tornillo en el lado. Ahora la muestra está lista para crear imágenes con SEM. Primero, cargue el escenario en la cámara SEM y selle la puerta, luego presione el botón de transferencia para abrir el paso de la cámara de carga al vacío. Una vez que la puerta interna está abierta, atornille la varilla de metal en el escenario y empuje la muestra en la cámara de vacío, luego desenrosque la varilla metálica y retírela completamente en la cámara de carga, luego presione almacenar para cerrar la cámara de vacío.

Ahora vamos a crear una imagen de la muestra usando SEM.

En primer lugar, mueva la etapa con el controlador y navegue por la muestra en el campo de visión, luego mueva la muestra verticalmente hasta que la distancia de trabajo sea de cinco a 10 milímetros. Encienda el haz de electrones y seleccione el detector para electrones secundarios, ajuste el haz a cinco kiloelectrones voltios inicialmente, luego aumente hasta 20 a 30 kiloelectrones voltios según sea necesario. Si la imagen no está clara, gire las perillas de enfoque, brillo y contraste hasta que aparezca una imagen clara.

Utilice la navegación por etapas y las direcciones X e Y para localizar un nuevo punto en la muestra y, a continuación, aumente la ampliación hasta que las entidades deseadas estén visibles. Ajuste el enfoque, el contraste y el brillo según sea necesario para mejorar la calidad de la imagen. Es posible que deba reducir la velocidad de escaneo y activar el promedio de línea para adquirir una mejor imagen y, a continuación, guardar la imagen.

Las imágenes SEM revelan una estructura altamente tridimensional y porosa con características fibrosas de menos de 25 micras. Estas características serían difíciles de visualizar mediante microscopía óptica, ya que la microscopía óptica tiene una profundidad de campo mucho menor.

Hay muchos desafíos asociados con la toma de imágenes de estructuras biológicas con SEM, incluyendo el colapso de la estructura o el daño del haz de electrones de alta energía. Ahora echemos un vistazo a cómo se aplica la técnica GENERAL SEM a estos tipos de muestras sensibles. Las estructuras biológicas delicadas, como estos tejidos vegetales jóvenes, o aquellos con un alto contenido de agua, deben tratarse mediante un proceso de fijación antes de la toma de imágenes.

Estos meristems florales fueron tratados inmediatamente con una solución fijativa de formalina/ácido acético recién preparada. El tejido fijo fue diseccionado en etanol, colocado en un recipiente de malla, y deshidratado a través de una serie de etanol de 70%, 80%, 90% y 100% etanol. Finalmente, los tejidos de la planta se secaron usando un secador de punto crítico, montados y sputter recubiertos con una capa de metal delgado.

Después de la toma de imágenes SEM, está claro que las estructuras no tratadas fueron muy dañadas por el proceso de secado y mostraron un colapso considerable en la estructura, mientras que las que fueron fijadas mantuvieron su estructura nativa. Alternativamente, las células y otras muestras de alto contenido de agua se pueden crear imágenes utilizando SEM ambiental, o ESEM. ESEM utiliza un haz de electrones de alta energía que es escaneado ráster sobre la muestra, como con SEM convencional, sin embargo, permite la toma de imágenes de muestras húmedas o no recubiertas mediante el mantenimiento de un entorno gaseoso dentro de la cámara.

Esto se hace separando la cámara de vacío alto que contiene la pistola de electrones de la cámara de muestra utilizando dos aberturas. El haz de electrones incurre en pérdidas significativas debido a la dispersión por moléculas de gas, pero por lo general es una energía lo suficientemente alta para la toma de imágenes. Aquí, las células se cultivaban en un chip de silicio, se funcionalizaban con puntos cuánticos y se arreglaban usando un protocolo de fijación de glutaraldehído. Las células fueron imágenes en agua y muestran la estructura sin colapsar de la célula con puntos cuánticos individuales visibles en la superficie de la célula.

Acabas de ver la introducción de JoVE a la visualización de biomateriales usando SEM. Ahora debe comprender cómo funciona SEM, cómo se preparan e imágenan las muestras biológicas, así como algunas aplicaciones de la técnica para estructuras sensibles.

¡Gracias por mirar!

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