Overview
Fonte: Peiman Shahbeigi-Roodposhti e Sina Shahbazmohamadi, Dipartimento di Ingegneria Biomedica, Università del Connecticut, Storrs, Connecticut
Un microscopio elettronico a scansione (SEM) è uno strumento che utilizza un fascio di elettroni per immagini e caratterizzare in modo non distruttivo i materiali conduttivi nel vuoto. Per analogia, un fascio di elettroni sta al SEM come la luce sta al microscopio ottico. La differenza è che il microscopio elettronico produce immagini di risoluzione e ingrandimento molto più elevati. I migliori microscopi ottici hanno in genere una risoluzione fino a 200 nm, mentre i SEM di solito rivendicano una risoluzione di 0,5 nm. Ciò è dovuto al fatto che i microscopi ottici sono limitati dalla diffrazione delle onde, una funzione della lunghezza d'onda, che è di circa 500 nm per la luce visibile. Al contrario, il SEM utilizza un fascio di elettroni energizzato, che come lunghezza d'onda di 1 nm. Questa caratteristica li rende strumenti molto affidabili per lo studio di nano e microstrutture. I microscopi elettronici consentono anche lo studio di campioni biologici con dimensioni delle caratteristiche troppo piccole per la microscopia ottica.
Questa dimostrazione fornisce un'introduzione alla preparazione del campione e all'acquisizione iniziale dell'immagine di campioni biologici utilizzando un microscopio elettronico a scansione. In questo caso, verrà studiato uno scaffold cellulare di collagene-idrossiapatite (HA). L'ambiente di vuoto del SEM e la carica indotta dal fascio di elettroni su campioni non conduttivi (come la materia organica) creano sfide che saranno affrontate nella preparazione. Verranno inoltre discussi i vantaggi e gli svantaggi dei diversi metodi di imaging in relazione alla risoluzione, alla profondità di messa a fuoco e al tipo di campione. Lo scopo di questa dimostrazione è quello di fornire al partecipante maggiori informazioni sulla SEM per determinare se questo modulo di microscopia è la soluzione migliore per un tipo di campione biologico.
Principles
Quando un fascio di elettroni ad alta energia (in genere compreso tra 5 e 30 keV) colpisce un campione, dal campione viene emessa una serie di segnali. Queste interazioni possono essere utilizzate per studiare topografia, cristallografia, potenziale elettrico e campi magnetici locali. Gli elettroni subiscono due tipi di scattering: elastico e anelastico. Lo scattering anelastico provoca l'emissione di elettroni secondari. Questi elettroni a bassa energia (~50 eV) sono gli elettroni del guscio esterno degli atomi campione che acquisiscono energia appena sufficiente per lasciare la superficie dell'atomo. La dispersione degli elettroni secondari fornisce informazioni topografiche, poiché il livello di energia degli elettroni che lasciano l'atomo campione non è abbastanza alto da viaggiare attraverso il campione. Pertanto, solo le informazioni sul livello superficiale vengono raccolte dal rilevatore.
Lo scattering elastico, d'altra parte, non è causato da elettroni spostati dagli atomi del campione. È il principale fascio di elettroni dopo l'interazione con il nucleo, come si vede nella Figura 1. Questi elettroni non cambiano la loro energia o velocità, ma cambiano la loro direzione in base alla loro interazione con il nucleo. Il rilevamento di questi elettroni fornisce informazioni compositime e il loro contrasto variabile all'interazione con atomi di diversi pesi atomici consente all'utente di distinguere le differenze nella composizione del campione. Nei campioni biologici, questo può essere utilizzato per studiare nanoparticelle e nanostrutture incorporate o attaccate con pesi atomici più pesanti, come oro o ferro.
Figura 1: Interazioni atomiche con gli elettroni principali (PE) e come creano i diversi segnali.
La preparazione del campione è una procedura importante, soprattutto per i campioni biologici. Per ottenere immagini SEM ad alta risoluzione, gli elettroni devono raggiungere il campione. Quindi, i segnali che sono il risultato dell'interazione tra gli elettroni e il campione devono raggiungere i rivelatori. Ciò significa che lo strumento deve lavorare sotto un alto vuoto per prevenire la dispersione di elettroni prima che il fascio raggiunga il campione e i segnali raggiungano i rivelatori. Questo vuoto è altamente sensibile e può estrarre il particolato dal campione, il che significa che è importante assicurarsi che il campione sia asciutto e privo di particolato.
Un'altra considerazione nella preparazione del campione è la natura del fascio di elettroni. Poiché il fascio è composto da particelle altamente cariche, quando un campione non conduttivo viene bombardato con particelle altamente cariche dal fascio di elettroni, c'è un accumulo di cariche sulla superficie che influenzano la deflessione del fascio di elettroni e causano un grande aumento della dispersione del fascio. Rivestendo il campione con uno strato conduttivo prima dell'imaging, questi artefatti di carica nell'immagine possono essere evitati.
I metodi qui descritti sono applicabili alla maggior parte dei materiali non conduttivi. Un rivestimento è necessario per mitigare gli artefatti di ricarica. L'impalcatura cellulare collagen-HA è stata realizzata con le seguenti fasi di sintesi: co-precipitazione del collagene con HA nel gel composito, creazione di liquami e fusione di liofilizzazione, reticolazione dell'impalcatura e asciugatura finale. Questa essiccazione finale viene completata nell'arco di 5 giorni in un essiccatore sottovuoto e asciuga sufficientemente il campione per l'analisi SEM senza influire sulle proprietà strutturali degli scaffold. Tuttavia, durante l'imaging delle cellule,la preoccupazione principale durante la preparazione del campione è preservare la struttura cellulare. I metodi di fissazione chimici e basati sulla resina sono comunemente usati per osservare le cellule preservando la struttura delle cellule, come la fissazione della glutaraldeide e le resine epossidiche e acriliche. Tipicamente, la glutaraldeide viene utilizzata come fissativo che crea reticolazioni nel citoplasma delle cellule, ma provoca anche un calo del pH. Pertanto, il buffering è necessario quando si preparano campioni con glutaraldeide. L'aggiunta di queste tecniche permette alla struttura della cellula di assomigliare maggiormente alla sua struttura quando era viva [3].
Figura 2: Sputter coater oro-palladio che mostra la camera del campione (recipiente d'argento in alto) e i misuratori di vuoto (a sinistra) e corrente (a destra). In questo modello, viene utilizzata una corrente di 2 mA con un vuoto a camera di 0,1 torr, che viene mantenuto costante utilizzando una valvola di perdita di argon.
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Procedure
1. Preparazione del campione
- Indossare guanti e prendere precauzioni per evitare la contaminazione durante la manipolazione del campione.
- Assicurarsi che il campione sul vetrino sia asciutto e che non vi sia contaminazione sul campione. Questo perché SEM misura la caratterizzazione della superficie e questi difetti possono ostacolare gravemente il segnale.
- Se il campione viene caricato su una slitta di vetro standard, ridurre le dimensioni del campione segnando la diapositiva con una fresa per vetro con punta di diamantata in linea retta e spingere delicatamente sulla linea segnata lontano dal corpo fino a quando il vetro non si frattura.
- A seconda del campione, scegliere un rivestimento che non abbia la stessa composizione elementare (ostacolerebbe il segnale ricevuto da EDS). Per questa dimostrazione viene utilizzato un rivestimento oro-palladio.
- Utilizzare il coater sputter come indicato. Lasciare che la macchina sputter il campione per circa 40 s per un rivestimento sottile con una copertura adeguata.
- Montare il campione su uno stub SEM utilizzando nastro conduttivo a doppia faccia in carbonio. Questo nastro deve anche essere posizionato dal palco alla parte superiore della diapositiva che è stata sputata per mettere a terra il campione se è montato su una diapositiva non conduttiva. Un sottile strato di vernice d'argento conduttiva potrebbe anche essere utilizzato per aumentare la conduttività del campione allo stadio.
- Montare il mozzicone sul palco e stringere la vite sul lato.
2. Procedura di imaging
- Caricare il palco nella camera. Chiudi e sigilla la porta. Quindi premere il pulsante "Trasferisci" per aprire il passaggio dalla camera di carico al vuoto.
- Una volta che il pulsante di trasferimento smette di lampeggiare e la porta interna è aperta, il campione può essere spostato nella camera a vuoto avvitando le aste metalliche e spingendo il campione nella camera.
- Svitare l'asta, ritrarre e fissare completamente l'asta nella camera di carico e premere "store" per chiudere la camera di carico dalla camera a vuoto. L'esempio viene ora caricato e il resto del processo viene eseguito dalla workstation del computer.
- Spostare lo stage utilizzando il controller e aprendo il pannello di navigazione dello stage fino a quando non si trova nel campo visivo.
- Spostare il campione verticalmente fino a quando la distanza di lavoro è di 5-10 mm. Quando si sposta il palco nella direzione z, accendere la telecamera della camera per assicurarsi che il campione non si avvicini alla pistola elettronica.
- Accendere il fascio ad altissima tensione (EHT). Tieni presente che potrebbe anche essere necessario aprire la colonna se è stata spenta per un po '.
- Selezionare il segnale SE2 dalle opzioni del rilevatore.
- Utilizzare un'impostazione kV di circa 5 kV per l'imaging iniziale, quindi aumentare a 20-30 kV per un maggiore segnale utilizzando la modalità back-scatter. Se il campione non è stato rivestito, mantenere il keV basso per evitare troppi artefatti di carica nell'immagine e per evitare danni al campione.
- Se non è presente un'immagine chiara, ruotare le manopole di messa a fuoco, luminosità e contrasto fino a quando una struttura non è visibile. Questo sarà un riferimento per il perfezionamento.
- Ruotare la manopola di messa a fuoco in modalità grossolana fino a quando un'immagine non è visibile. Quindi passa a fine per trovare la messa a fuoco migliore.
- Usa la navigazione sul palco (non nella direzione z) e l'ingrandimento per trovare un'area da cui salvare un'immagine.
- Riduci la velocità di scansione e attiva la media in linea per acquisire un'immagine migliore per il salvataggio.
- Salva l'immagine facendo clic con il pulsante destro del mouse e salvando in una posizione di file.
- Inserire il BSD e riportare lo stage in una posizione z in cui il campione è focalizzato.
- Ripetere i passaggi 8-11 mentre si cercano aree di contrasto che indicano un numero atomico più elevato.
- Rimuovere il BSD al termine.
- Quando sei pronto per rimuovere il campione, premi il pulsante "scambia".
- Spostare il campione nella camera di carico e premere "store", quindi "vent".
La microscopia elettronica a scansione, o SEM, viene spesso utilizzata per l'immagine di materiali biologici su scala nanometrica. I microscopi ottici, che utilizzano la luce per l'immagine di un campione, sono fortemente utilizzati per l'immagine non distruttiva di campioni biologici, tuttavia, la loro risoluzione e profondità di campo sono limitate, quindi il SEM viene utilizzato per ottenere una risoluzione più elevata fino a un nanometro.
In SEM, un fascio di elettroni viene focalizzato attraverso una serie di lenti a condensatore, che poi colpiscono il campione. Quando il fascio colpisce il campione, gli elettroni sulla superficie vengono dispersi e misurati dal rivelatore.
In questo video, discuteremo di come funziona il SEM, dimostreremo come immaginare un campione biologico in laboratorio e, infine, introdurremo alcune tecniche utilizzate per l'immagine di campioni sensibili.
Un microscopio elettronico a scansione utilizza un fascio di elettroni ad alta energia, generato da una pistola elettronica dotata di un catodo a filamento. Gli elettroni generati vengono spinti verso l'anodo e quindi focalizzati utilizzando lenti a condensatore prima di entrare nella lente dell'obiettivo. L'obiettivo è calibrato per mettere a fuoco il fascio sul campione, dove viene scansionato raster sulla superficie. Le interazioni degli elettroni con gli atomi nel campione vengono utilizzate per studiare la topografia, la composizione elementare e la cristallinità del campione. Quando il fascio di elettroni incidente colpisce la superficie, emette elettroni secondari e retrodati. Gli elettroni secondari sono elettroni a bassa energia che vengono emessi dal campione vicino alla superficie e forniscono informazioni topografiche.
Gli elettroni retrodifati, d'altra parte, si riflettono nella direzione opposta del fascio incidente. L'intensità dell'interazione aumenta con l'aumentare del peso atomico, consentendo all'utente di distinguere le differenze compositime. È necessaria una considerazione speciale per l'immagine di campioni biologici con SEM, poiché SEM utilizza un alto vuoto, quindi i campioni biologici, che in genere hanno un alto contenuto di acqua, devono essere prima essiccati. Ciò può causare il collasso della struttura dei campioni sensibili, in particolare le cellule. Pertanto, le cellule vengono trattate con un fissativo, risciacquate e quindi disidratate lentamente lavando con quantità crescenti di etanolo.
Per i materiali biologici rigidi, come l'impalcatura del tessuto di collagene-idrossiapatite utilizzata in questa dimostrazione, il campione viene essiccato per un periodo di diversi giorni sotto vuoto.
Infine, poiché l'imaging SEM tipico richiede una superficie conduttiva, i campioni biologici sono spesso rivestiti con un sottile strato di metallo prima dell'imaging. Ora che abbiamo discusso di come funziona il SEM e di come preparare un campione biologico per l'imaging, diamo un'occhiata a come preparare e immaginare uno scaffold di tessuto di collagene-idrossiapatite.
In primo luogo, montare il campione di biomateriale su uno stub SEM utilizzando nastro di carbonio conduttivo e assicurarsi che il campione sia asciutto e non abbia contaminazioni sulla superficie.
Quindi, posizionare il campione montato nella camera di un rivestimento sputter, pompare verso il basso la camera e sputter rivestire il campione per circa 40 secondi per ottenere un rivestimento sottile di metallo spesso da quattro a sei nanometri, in questo caso oro, con una copertura adeguata. Una volta rivestito, rimuovere il campione e utilizzare nastro conduttivo per collegare lo stub alla parte superiore del campione, che ora è rivestito con metallo conduttivo.
Infine, montare il mozzicone sul palco SEM e stringere la vite sul lato. Ora il campione è pronto per l'immagine con SEM. Per prima cosa, caricare il palco nella camera SEM e sigillare la porta, quindi premere il pulsante di trasferimento per aprire il passaggio dalla camera di carico al vuoto. Una volta aperta la porta interna, avvitare l'asta metallica nel palco e spingere il campione nella camera a vuoto, quindi svitare l'asta metallica e ritrarla completamente nella camera di carico, quindi premere il magazzino per chiudere la camera a vuoto.
Ora immaginiamo l'esempio usando SEM.
Innanzitutto, sposta il palco usando il controller e naviga il campione nel campo visivo, quindi sposta il campione verticalmente fino a quando la distanza di lavoro è da cinque a 10 millimetri. Accendere il fascio di elettroni e selezionare il rilevatore per gli elettroni secondari, impostare inizialmente il fascio su cinque kiloelettronvolt, quindi aumentare fino a 20-30 kiloelettronvolt secondo necessità. Se l'immagine non è chiara, ruotare le manopole di messa a fuoco, luminosità e contrasto fino a visualizzare un'immagine chiara.
Utilizzare la navigazione sul palco e le direzioni X e Y per individuare un nuovo punto sul campione, quindi aumentare l'ingrandimento fino a quando le feature desiderate non sono visibili. Regola la messa a fuoco, il contrasto e la luminosità in base alle esigenze per migliorare la qualità dell'immagine. Potrebbe essere necessario ridurre la velocità di scansione e attivare la media delle linee per acquisire un'immagine migliore, quindi salvare l'immagine.
Le immagini SEM rivelano una struttura altamente tridimensionale e porosa con caratteristiche fibrose inferiori a 25 micron. Queste caratteristiche sarebbero difficili da visualizzare usando la microscopia ottica, poiché la microscopia ottica ha una profondità di campo molto più bassa.
Ci sono molte sfide associate all'imaging di strutture biologiche con SEM, tra cui il collasso della struttura o il danno dal fascio di elettroni ad alta energia. Diamo ora un'occhiata a come la tecnica SEM generale viene applicata a questi tipi di campioni sensibili. Strutture biologiche delicate, come questi giovani tessuti vegetali, o quelli con un alto contenuto di acqua, devono essere trattati attraverso un processo di fissazione prima dell'imaging.
Questi meristemi floreali sono stati immediatamente trattati con una soluzione fissativa di formalina/acido acetico appena preparata. Il tessuto fisso è stato sezionato in etanolo, posto in un contenitore a rete e disidratato attraverso una serie di etanolo del 70%, 80%, 90% e 100% di etanolo. Infine, i tessuti vegetali sono stati essiccati utilizzando un essiccatore a punto critico, montati e sputter rivestiti con un sottile rivestimento metallico.
Dopo l'imaging SEM, è chiaro che le strutture non trattate sono state pesantemente danneggiate dal processo di essiccazione e hanno mostrato un notevole collasso della struttura, mentre quelle che sono state fissate hanno mantenuto la loro struttura nativa. In alternativa, le cellule e altri campioni ad alto contenuto di acqua possono essere ripresi utilizzando SEM ambientale o ESEM. ESEM utilizza un fascio di elettroni ad alta energia che viene scansionato raster sul campione, come con il SEM convenzionale, tuttavia, consente l'imaging di campioni bagnati o non rivestiti mantenendo un ambiente gassoso all'interno della camera.
Questo viene fatto separando la camera ad alto vuoto contenente la pistola elettronica dalla camera del campione usando due aperture. Il fascio di elettroni subisce perdite significative a causa della dispersione da parte delle molecole di gas, ma è in genere un'energia abbastanza alta per l'imaging. Qui, le cellule sono state coltivate su un chip di silicio, funzionalizzate con punti quantici e fissate utilizzando un protocollo di fissazione della glutaraldeide. Le cellule sono state riprese in acqua e mostrano la struttura non compressa della cellula con singoli punti quantici visibili sulla superficie cellulare.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla visualizzazione di biomateriali utilizzando SEM. Ora dovresti capire come funziona sem, come vengono preparati e ripresi i campioni biologici, nonché alcune applicazioni della tecnica per strutture sensibili.
Grazie per l'attenzione!
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Results
Le immagini SEM nelle figure 3 e 4 mostrano che la struttura dell'immagine è altamente tridimensionale con caratteristiche su microscala. La qualità dell'immagine è influenzata dalla messa a fuoco e dallo spessore del rivestimento sputter.
Figura 3: Le immagini seguenti illustrano in che modo la messa a fuoco di esempio può influire sulla qualità dell'immagine. Nell'immagine a destra, l'intero campo visivo è a fuoco, mentre è sfocato a sinistra. Giocare con parametri come la messa a fuoco può fornire un'immagine molto migliore.
Figura 4: Immagini del campione di collagene-idrossiapatite.
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Applications and Summary
Qui abbiamo dimostrato la profondità di messa a fuoco, il campo visivo e la massima risoluzione e ingrandimento di un microscopio elettronico e come queste proprietà possono essere utilizzate per visualizzare campioni biologici. Questa dimostrazione è stata progettata per aiutare gli spettatori a decidere quale modulo di microscopia è il migliore per una determinata applicazione. Come dimostrato, SEM ha una profondità di messa a fuoco molto elevata, una risoluzione molto più elevata e ingrandimenti maggiori. Tuttavia, non è appropriato per tutti i tipi di campione.
Questa dimostrazione ha introdotto i principi della microscopia elettronica e ha mostrato molte delle loro applicazioni nei laboratori di ricerca. I microscopi elettronici sono utilizzati per l'ispezione, la caratterizzazione e il controllo qualità. Ad esempio, vengono utilizzati per visualizzare circuiti integrati, circuiti stampati, propagazione delle cricche e sistemi nano-elettromeccanici. Anche nel campo della biologia questi strumenti svolgono un ruolo chiave. Esistono anche microscopi elettronici appositamente progettati per ospitare campioni biologici umidi. Questi campioni biologici vanno dai tessuti alle ossa, alle cellule e ai microrganismi. L'utilizzo di rilevatori aggiuntivi può consentire ancora più analisi, come un'analisi precisa della superficie.
Elenco dei materiali
| Nome | Società | Numero di catalogo | Commenti |
| Attrezzatura | |||
| Biocampione | |||
| Rivestimento in carbonio o oro | |||
| Traversa-SEM | ZEISS | ||
| Scaffold cellulari collagene-idrossiappetite | Sviluppato da Wei Laboratory presso l'Università del Connecticut |
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References
- Oatley, C. W., W. C. Nixon, and R. F. W. Pease. "Scanning electron microscopy." Advances in Electronics and Electron Physics 21 (1966): 181-247.
- Goldstein, Joseph, et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis: a text for biologists, materials scientists, and geologists. Springer Science & Business Media, 2012.
- Carol Heckman, et al. Preparation of cultural cells for scanning electron microscope. Nature Protocols Network, 2007, doi:10.1038/nprot.2007.504
