Overview
출처: 페이만 샤베이기-루드포스티와 시나 샤바즈모하마디, 생물의학 공학과, 코네티컷 대학교, 스토스, 코네티컷
스캐닝 전자 현미경(SEM)은 전자 빔을 사용하여 진공 상태에서 전도성 물질을 비파괴적으로 이미지화하고 특성화하는 계측기입니다. 비유로서, 전자빔은 광현미경에 빛이 있는 것처럼 SEM에 있다. 차이점은 전자 현미경이 훨씬 더 높은 해상도와 배율의 이미지를 산출한다는 것입니다. 최고의 광학 현미경은 일반적으로 200 nm까지 해상도를 가지고, SEM은 일반적으로 0.5 nm의 해상도를 주장하는 반면. 이는 광현미경이 가시광선의 약 500nm인 파장의 화절에 의해 광학 현미경이 제한되어 있기 때문이다. 반대로, SEM은 1nm의 파장으로 활력을 공급되는 전자 빔을 사용합니다. 이 특성은 나노 및 미세 구조의 연구를위한 매우 신뢰할 수있는 도구를 만든다. 전자 현미경은 또한 광학 현미경검사에 너무 작은 특징 크기를 가진 생물학 견본의 연구 연구를 가능하게 합니다.
본 데모는 스캐닝 전자 현미경을 이용한 생물학적 시료의 샘플 제제 및 초기 이미지 수집에 대한 소개를 제공한다. 이 경우 콜라겐-하이드록시아파티트(HA) 세포 비계를 연구할 것이다. SEM의 진공 환경과 비전도성 샘플(예: 유기물)에 전자 빔에 의한 유도된 충전은 준비 과정에서 해결될 과제를 생성합니다. 해상도, 초점 깊이 및 샘플 유형과 관련이 있는 다양한 이미징 방법의 장점과 단점도 논의될 것입니다. 이 데모의 목적은 참가자에게 SEM에 대한 자세한 정보를 제공하여 이 현미경 모듈이 생물학적 샘플 유형에 가장 적합한지 확인하는 것입니다.
Principles
고에너지 전자 빔(일반적으로 5-30 keV에 이르는)이 시료에 도달하면 시료로부터 다양한 신호가 방출됩니다. 이러한 상호 작용은 지형, 결정학, 전기 전위 및 국소 자기장을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 전자는 탄성 및 비탄력성 두 가지 유형의 산란을 겪습니다. 비탄력성 산란은 이차 전자의 방출을 일으킵니다. 이러한 저에너지 전자(~50eV)는 원자의 표면을 남기기에 충분한 에너지를 획득하는 시료 원자의 외조 전자입니다. 이차 전자의 산란은 샘플 원자를 떠나는 전자의 에너지 수준이 시료를 통과할 만큼 충분히 높지 않기 때문에 지형 정보를 제공합니다. 따라서 검출기에 의해 표면 수준 정보만 수집됩니다.
탄성 산란은, 반면에, 샘플 원자에서 빠진 전자에 의해 발생되지 않습니다. 도 1에서 볼 수 있듯이 핵과의 상호 작용 후 전자의 주빔이다. 이 전자는 그들의 에너지 또는 속도를 바꾸지 않습니다, 그러나 핵과의 상호 작용에 근거를 둔 그들의 방향을 변경합니다. 이러한 전자의 검출은 조성 정보를 제공하고, 다른 원자 중량의 원자와의 상호 작용시 의 다양한 대비를 제공하여 사용자가 시료 조성물의 차이를 구별할 수 있게 한다. 생물학적 샘플에서는 금또는 철과 같은 무거운 원자 중량을 가진 임베디드 또는 부착된 나노 입자 및 나노 구조를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1: 주 전자(PE)와의 원자 상호 작용 및 다른 신호를 생성하는 방법.
특히 생물학적 시료에 대한 샘플 준비는 중요한 절차입니다. 고해상도 SEM 이미지를 얻으려면 전자가 시료에 도달해야합니다. 그런 다음 전자와 시료 간의 상호 작용의 결과인 신호는 검출기에 도달해야합니다. 즉, 빔이 샘플에 도달하고 신호가 검출기에 도달하기 전에 전자산란을 방지하기 위해 계측기가 높은 진공 상태에서 작동해야 합니다. 이 진공은 매우 민감하며 시료에서 미립자 물질을 끌어 낼 수 있으므로 시료가 건조하고 미립자가 없는지 확인하는 것이 중요합니다.
샘플 준비의 또 다른 고려 사항은 전자 빔의 특성입니다. 빔은 고하의 입자로 구성되기 때문에, 비전도성 샘플이 전자 빔으로부터 고하의 입자로 포격될 때, 전자 빔의 편향에 영향을 미치고 빔 산란의 큰 증가를 유발하는 표면에 전하의 축적이 있다. 이미징 전에 전도성 층으로 샘플을 코팅함으로써 이미지내의 이러한 충전 아티팩트를 피할 수 있습니다.
여기에 설명된 방법은 대부분의 비전도성 재료에 적용할 수 있습니다. 충전 아티팩트를 완화하기 위해 코팅이 필요합니다. 콜라겐-HA 세포 비계는 다음 합성 단계에 의해 만들어졌다: HA와 콜라겐의 공동 침전복합 젤로, 슬러리 생성 및 동결 주조, 스캐폴드와 최종 건조를 교차. 이 최종 건조는 진공 건조기에서 5일 이상 완료되며 스캐폴드의 구조적 특성에 영향을 주지 않고 SEM 분석을 위한 샘플을 충분히 건조시 합니다. 그러나, 이미징 세포일때, 시료를 준비할 때 주요 관심사는 세포 구조를 보존하는 것입니다. 화학 및 수지 기반 고정 방법은 일반적으로 글루타랄데히드 고정 및 에폭시 및 아크릴 수지와 같은 세포의 구조를 보존하면서 세포를 관찰하는 데 사용됩니다. 전형적으로, 글루타랄데히드는 세포의 세포질에서 교차 갈래를 생성하지만 또한 pH에 있는 하락을 일으키는 원인이 되는 고정으로 이용됩니다. 따라서 글루타랄데히드로 샘플을 준비할 때 버퍼링이 필요합니다. 이러한 기술의 첨가는 셀의 구조가 살아있을 때 의 구조를 가장 유사하게 [3]할 수 있게 한다.
그림 2: 샘플 챔버(상단의 은용기)와 진공(왼쪽) 및 전류(오른쪽) 게이지를 보여주는 골드 팔라듐 스퍼터 코팅. 이 모델에서는, 2mA의 전류는 0.1 토르의 챔버 진공과 함께 사용되며, 이는 아르곤 누출 밸브를 사용하여 일정하게 유지됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. 샘플 준비
- 장갑을 착용하고 샘플을 처리 할 때 오염을 방지하기 위해 예방 조치를 취하십시오.
- 슬라이드의 샘플이 건조되고 시료에 오염이 없는지 확인하십시오. 이는 SEM이 표면 특성화를 측정하고 이러한 결함으로 인해 신호를 심각하게 방해할 수 있기 때문입니다.
- 샘플이 표준 유리 슬라이드에 로드되는 경우, 다이아몬드 팁 유리 커터로 슬라이드를 직선으로 채점하여 샘플의 크기를 줄이고 유리가 파손될 때까지 점수가 높은 라인을 부드럽게 밀어냅니다.
- 시료에 따라 동일한 원소 조성물을 갖지 않는 코팅을 선택하십시오(EDS가 수신한 신호를 방해합니다). 이 데모를 위해 금 팔라듐 코팅이 사용됩니다.
- 스퍼터 코터를 지시대로 사용하십시오. 장비가 적절한 커버리지를 가진 얇은 코팅을 위해 약 40 s의 샘플을 스퍼터로 보도록하십시오.
- 전도성 양면 탄소 테이프를 사용하여 샘플을 SEM 스텁에 장착합니다. 이 테이프는 또한 비 전도성 슬라이드에 장착된 경우 샘플을 접지하기 위해 스퍼터처리된 슬라이드의 맨 위로 스테이지에서 배치되어야 합니다. 전도성 실버 페인트의 얇은 층은 또한 단계로 샘플의 전도도를 증가시키는 데 사용할 수 있습니다.
- 스텁을 무대에 설치하고 측면의 나사를 조입니다.
2. 이미징 절차
- 스테이지를 챔버에 로드합니다. 문을 닫고 밀봉합니다. 그런 다음 "전송" 버튼을 눌러 로딩 챔버에서 진공으로 의 통로를 엽니다.
- 전송 버튼이 깜박이는 것을 멈추고 내부 문이 열리면 금속 막대에 나사를 넣고 샘플을 챔버로 밀어 진공 챔버로 샘플을 이동할 수 있습니다.
- 막대를 풀고 로드를 하중 챔버에 완전히 고정하고 "저장"을 눌러 진공 챔버에서 하중 챔버를 닫습니다. 이제 샘플이 로드되고 나머지 프로세스가 컴퓨터 워크스테이션에서 수행됩니다.
- 컨트롤러를 사용하여 스테이지 탐색 패널을 열어 시야에 들어올릴 때까지 스테이지를 이동합니다.
- 작업 거리가 5-10mm가 될 때까지 샘플을 수직으로 이동합니다. z 방향으로 스테이지를 이동할 때 챔버 카메라를 켜서 샘플이 전자 총에 가까이 가지 않도록 하십시오.
- 여분의 높은 장력(EHT) 빔을 켭니다. 잠시 동안 해제된 경우 열을 열어야 할 수도 있습니다.
- 검출기 옵션에서 SE2 신호를 선택합니다.
- 초기 이미징에 대해 약 5kV의 kV 설정을 사용한 다음 20-30kV로 증가하여 백 스캐터 모드를 사용하여 더 많은 신호를 볼 수 있습니다. 샘플이 코팅되지 않은 경우 keV를 낮게 유지하여 이미지에 너무 많은 충전 아티팩트를 방지하고 샘플 손상을 방지하십시오.
- 명확한 이미지가 없는 경우 구조가 표시될 때까지 초점, 밝기 및 대비 노브를 돌립니다. 이는 구체화를 위한 참조입니다.
- 이미지가 표시될 때까지 거친 모드에서 포커스 노브를 돌립니다. 그런 다음 최고의 초점을 찾기 위해 미세로 전환합니다.
- 단계 탐색(z 방향이 아님)과 배율을 사용하여 이미지를 저장할 영역을 찾습니다.
- 스캔 속도를 줄이고 평균 줄을 켜면 더 나은 이미지를 확보하여 저장을 위해 더 나은 이미지를 얻습니다.
- 오른쪽 단추를 클릭하고 파일 위치에 저장하여 이미지를 저장합니다.
- BSD를 삽입하고 스테이지를 샘플이 초점을 맞춘 z 위치로 다시 이동합니다.
- 더 높은 원자 수를 나타내는 대비 영역을 찾는 동안 8-11 단계를 반복합니다.
- 완료되면 BSD를 제거합니다.
- 샘플을 제거할 준비가 되면 "교환"버튼을 누를 수 있습니다.
- 샘플을 다시 로드 챔버로 이동한 다음 "통풍구"를 "저장"합니다.
전자 현미경 검사용 또는 SEM은 나노 스케일에서 생물학적 물질을 이미지화하는 데 자주 사용됩니다. 샘플을 이미지화하기 위해 빛을 사용하는 광학 현미경은 비파괴적 이미지 생물학적 샘플에 많이 사용되지만, 그 해상도와 심도는 제한되어 있으므로 SEM은 1 나노미터까지 더 높은 해상도를 달성하기 위해 사용됩니다.
SEM에서는 일련의 응축기 렌즈를 통해 전자 빔이 집중되어 시료에 닿습니다. 빔이 시료에 부딪히면 표면의 전자가 흩어져 검출기에 의해 측정됩니다.
이 비디오에서는 SEM의 작동 방식을 논의하고, 실험실에서 생물학적 샘플을 이미지화하는 방법을 시연하고, 마지막으로 민감한 샘플을 이미지화하는 데 사용되는 몇 가지 기술을 소개합니다.
스캐닝 전자 현미경은 필라멘트 음극이 장착된 전자 건에 의해 생성되는 고에너지 전자 빔을 사용합니다. 생성된 전자는 양극쪽으로 추진된 다음 객관적인 렌즈에 들어가기 전에 응축기 렌즈를 사용하여 집중됩니다. 객관적인 렌즈는 빔을 시료에 집중하도록 보정되어 표면을 가로질러 래스터를 스캔합니다. 샘플내의 원자와 전자의 상호 작용은 샘플의 지형, 원소 조성 및 결정성을 연구하는 데 사용됩니다. 사고 전자 빔이 표면에 닿으면 이차 전자와 백산전자를 방출합니다. 이차 전자는 표면에 가까운 샘플에서 방출되는 낮은 에너지 전자이며 지형 정보를 제공합니다.
반면에 백산전자는 인시던트 빔의 반대 방향으로 반사된다. 상호 작용 강도는 원자 중량을 증가시켜 사용자가 조성 차이를 구별할 수 있게 합니다. SEM은 높은 진공을 활용하기 때문에 SEM을 사용하여 생물학적 샘플을 이미지화하기 위해 특별한 고려가 필요하며, 따라서 일반적으로 수분 함량이 높은 생물학적 샘플은 먼저 건조되어야 합니다. 이것은 민감한 견본, 특히 세포의 구조의 붕괴를 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 따라서, 세포는 고정, 헹구고, 에탄올의 증가양으로 세척하여 천천히 탈수처리됩니다.
이 시연에 사용되는 콜라겐-하이드록시아파티테 조직 스캐폴드와 같은 경질 생물학적 물질의 경우, 샘플은 높은 진공 하에서 며칠 동안 건조된다.
마지막으로, 일반적인 SEM 이미징은 전도성 표면을 필요로 하기 때문에, 생물학적 샘플은 종종 이미징 전에 얇은 금속 층으로 코팅된 스퍼터입니다. 이제 SEM의 작동 방식과 이미징을 위한 생물학적 샘플을 준비하는 방법에 대해 논의되었으므로 콜라겐-하이드록시야파티트 조직 스캐폴드를 준비하고 이미지화하는 방법을 살펴보겠습니다.
첫째, 전도성 탄소 테이프를 사용하여 생체 재료 샘플을 SEM 스텁에 장착하고 시료가 건조하고 표면에 오염이 없는지 확인합니다.
그런 다음, 장착된 샘플을 스퍼터 코팅의 챔버에 놓고 챔버아래로 펌프하고 스퍼터를 코팅하여 40초 동안 샘플을 코팅하여 금속의 얇고 4-6나노미터 두께의 코팅을 달성하며, 이 경우 골드는 적절한 커버리지를 제공합니다. 코팅되면 샘플을 제거하고 전도성 테이프를 사용하여 스텁을 샘플 상단에 연결하여 현재 전도성 금속으로 코팅됩니다.
마지막으로 SEM 스테이지에 스텁을 장착하고 측면의 나사를 조입니다. 이제 샘플이 SEM으로 이미지화할 준비가 되었습니다. 먼저, 무대를 SEM 챔버에 넣고 문을 밀봉한 다음 전달 버튼을 눌러 로딩 챔버에서 진공으로 의 통로를 엽니다. 내부 문이 열리면 금속 막대를 무대로 나사로 넣고 샘플을 진공 챔버로 밀어 넣은 다음 금속 막대를 풀고 적재실로 완전히 후퇴한 다음 저장소를 눌러 진공 챔버를 닫습니다.
이제 SEM을 사용하여 샘플을 이미지화해 보겠습니다.
먼저, 컨트롤러를 사용하여 스테이지를 이동하고 샘플을 시야로 이동한 다음 작업 거리가 5~10mm가 될 때까지 샘플을 수직으로 이동합니다. 전자 빔을 켜고 이차 전자용 검출기를 선택하고 빔을 처음에는 5킬로전자 볼트로 설정한 다음 필요에 따라 최대 20킬로전자 볼트까지 증가합니다. 이미지가 명확하지 않은 경우 명확한 이미지가 나타날 때까지 초점, 밝기 및 대비 노브를 켭니다.
스테이지 탐색 및 X 및 Y 방향을 사용하여 샘플에서 새 스팟을 찾은 다음 원하는 피쳐가 표시될 때까지 배율을 늘립니다. 이미지 품질을 개선하기 위해 필요에 따라 초점, 대비 및 밝기를 조정합니다. 더 나은 이미지를 획득하기 위해 스캔 속도를 줄이고 평균 줄을 켜고 이미지를 저장해야 할 수 있습니다.
SEM 이미지는 25미크론보다 작은 섬유기능을 가진 고차원 및 다공성 구조를 보여줍니다. 광학 현미경 검사법은 훨씬 낮은 시야를 가지고 있기 때문에 이러한 기능은 광학 현미경 검사를 사용하여 시각화하기가 어려울 것입니다.
고에너지 전자 빔의 구조 붕괴 또는 손상을 포함하여 SEM을 가진 생물학 구조물의 화상 진찰과 관련되었던 많은 도전이 있습니다. 이제 일반적인 SEM 기술이 이러한 유형의 민감한 샘플에 어떻게 적용되는지 살펴보겠습니다. 이러한 젊은 식물 조직이나 수분 함량이 높은 조직과 같은 섬세한 생물학적 구조는 이미징 전에 고정 과정을 통해 처리되어야 합니다.
이 꽃 메리스템은 즉시 새로 준비된 포르말린/아세트산 고정 용액으로 처리되었습니다. 고정 된 조직은 에탄올에 해부되어 메쉬 용기에 배치되고 70 %, 80 %, 90 %, 및 100 % 에탄올의 에탄올 시리즈를 통해 탈수되었습니다. 마지막으로, 식물 조직은 얇은 금속 코팅으로 코팅 된 임계 점 건조기, 장착 및 스퍼터를 사용하여 건조되었습니다.
SEM 이미징 후, 처리되지 않은 구조가 건조 공정에 의해 심하게 손상되어 구조가 상당한 붕괴를 보였으며, 고정된 구조물은 기본 구조를 유지한 것이 분명합니다. 대안적으로, 세포 및 기타 높은 수분 함량 표본은 환경 SEM 또는 ESEM을 사용하여 이미지화될 수 있다. ESEM은 종래의 SEM과 마찬가지로 시료를 통해 래스터를 스캔하는 고에너지 전자 빔을 활용하지만, 챔버 내의 기체 환경을 유지함으로써 습식 또는 코팅되지 않은 시료의 이미징을 가능하게 한다.
이는 전자총을 함유하는 높은 진공 챔버를 두 개의 조리개를 사용하여 시편 챔버로부터 분리함으로써 수행됩니다. 전자 빔은 가스 분자에 의한 산란으로 인해 상당한 손실을 초래하지만 일반적으로 이미징을위한 충분한 에너지입니다. 여기서, 세포는 실리콘 칩에서 재배되었고, 양자점으로 기능화하고, 글루타랄데히드 고정 프로토콜을 사용하여 고정하였다. 세포는 물에서 심화되었고 세포 표면에 보이는 개별 양자점으로 세포의 붕괴되지 않은 구조를 보여줍니다.
SEM을 사용하여 생물 재료 시각화에 대한 JoVE의 소개를 방금 시청했습니다. 이제 SEM의 작동 방식, 생물학적 샘플이 어떻게 준비되고 이미지되는지, 그리고 민감한 구조에 대한 기술의 일부 응용 을 이해해야 합니다.
시청해 주셔서 감사합니다!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
그림 3과 4의 SEM 이미지는 이미지 구조가 마이크로 스케일 기능으로 매우 3차원임을 보여줍니다. 이미지 품질은 스퍼터 코팅의 초점과 두께에 의해 영향을 받습니다.
그림 3: 다음 이미지는 샘플 초점이 이미지 품질에 미치는 영향을 보여줍니다. 오른쪽 이미지에서 전체 시야가 초점을 맞추고 있는 반면 왼쪽에 초점을 맞추지 않습니다. 포커스와 같은 매개 변수를 사용하면 훨씬 더 나은 이미지를 제공할 수 있습니다.
그림 4: 콜라겐-하이드록시아타이트 샘플의 이미지.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
여기서 우리는 초점의 깊이, 시야 및 전자 현미경의 최대 해상도 및 배율을 입증하고 이러한 특성이 생물학적 샘플을 보는 데 어떻게 사용될 수 있는지를 보여주었습니다. 이 데모는 시청자가 특정 응용 프로그램에 가장 적합한 현미경 모듈을 결정하는 데 도움이 되도록 설계되었습니다. 입증된 바와 같이, SEM은 매우 높은 초점 깊이, 훨씬 더 높은 해상도 및 더 큰 배율을 가지고 있습니다. 그러나 모든 샘플 유형에는 적합하지 않습니다.
이 데모는 전자 현미경 검사법의 원리를 소개하고 실험실에서 그들의 응용 의 몇몇을 보여주었습니다. 전자 현미경검사, 특성화 및 품질 관리에 사용됩니다. 예를 들어, 그들은 IC, 회로 기판, 균열 전파 및 나노 전기 기계 시스템을 시각화하는 데 사용됩니다. 생물학 분야에서이 악기뿐만 아니라 중요한 역할을한다. 젖은 생물학적 샘플을 수용하기 위해 특별히 설계된 전자 현미경도 있습니다. 이 생물학 견본은 조직에서 뼈, 세포 및 미생물에 구역 수색합니다. 추가 검출기를 사용하면 정확한 표면 분석과 같은 더 많은 분석을 수행할 수 있습니다.
재료 목록
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 설비 | |||
| 바이오 샘플 | |||
| 카본 또는 골드 코터 | |||
| 크로스 빔-SEM | 자이스 | ||
| 콜라겐-하이드록시식욕 세포 비계 | 코네티컷 대학교 웨이 연구소에서 개발 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Oatley, C. W., W. C. Nixon, and R. F. W. Pease. "Scanning electron microscopy." Advances in Electronics and Electron Physics 21 (1966): 181-247.
- Goldstein, Joseph, et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis: a text for biologists, materials scientists, and geologists. Springer Science & Business Media, 2012.
- Carol Heckman, et al. Preparation of cultural cells for scanning electron microscope. Nature Protocols Network, 2007, doi:10.1038/nprot.2007.504
