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SEM-Bildgebung biologischer Proben

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Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wird häufig verwendet, um biologische Materialien im Nanomaßstab abzubilden. Optische Mikroskope, die Licht verwenden, um eine Probe abzubilden, werden stark verwendet, um biologische Proben zerstörungsfrei abzubilden, aber ihre Auflösung und Schärfentiefe sind begrenzt, so dass SEM verwendet wird, um eine höhere Auflösung bis auf einen Nanometer zu erreichen.

In SEM wird ein Elektronenstrahl durch eine Reihe von Kondensatorlinsen fokussiert, die dann auf die Probe trifft. Wenn der Strahl auf die Probe trifft, werden Elektronen auf der Oberfläche gestreut und vom Detektor gemessen.

In diesem Video werden wir die Funktionsweise von SEM besprechen, zeigen, wie man eine biologische Probe im Labor abbilden kann, und schließlich einige Techniken vorstellen, die verwendet werden, um empfindliche Proben abzubilden.

Ein Rasterelektronenmikroskop verwendet einen hochenergetischen Elektronenstrahl, der durch eine Elektronenkanone erzeugt wird, die mit einer Filamentkathode ausgestattet ist. Die erzeugten Elektronen werden zur Anode getrieben und dann mit Kondensatorlinsen fokussiert, bevor sie in die Objektivlinse gelangen. Die Objektivlinse wird kalibriert, um den Strahl auf die Probe zu fokussieren, wo sie über die Oberfläche gescannt wird. Die Wechselwirkungen der Elektronen mit den Atomen in der Probe werden verwendet, um die Topographie, die Elementarzusammensetzung und die Kristallinität der Probe zu untersuchen. Wenn der einfallende Elektronenstrahl auf die Oberfläche trifft, emittiert er sekundäre und rückgestreute Elektronen. Sekundärelektronen sind energiearme Elektronen, die von der oberflächenahen Probe emittiert werden und topografische Informationen liefern.

Zurückgestreute Elektronen hingegen spiegeln sich in der entgegengesetzten Richtung des einfallenden Strahls wider. Die Interaktionsintensität steigt mit zunehmendem Atomgewicht, so dass der Benutzer kompositorische Unterschiede unterscheiden kann. Besondere Berücksichtigung ist das Abbilden biologischer Proben mit SEM, da SEM ein Hochvakuum verwendet, so dass biologische Proben, die typischerweise einen hohen Wassergehalt haben, zuerst getrocknet werden müssen. Dies kann zu einem Zusammenbruch der Struktur empfindlicher Proben, insbesondere von Zellen, führen. So werden Die Zellen mit einem fixativen, gespülten und dann langsam dehydriert, indem sie mit zunehmenden Mengen Ethanol gewaschen werden.

Bei starren biologischen Materialien, wie dem kollagen-hydroxyapatitigen Gewebegerüst, das bei dieser Demonstration verwendet wird, wird die Probe über einen Zeitraum von mehreren Tagen unter Hochvakuum getrocknet.

Da die typische SEM-Bildgebung eine leitfähige Oberfläche erfordert, werden biologische Proben oft vor der Bildgebung mit einer dünnen Metallschicht beschichtet. Nun, da wir diskutiert haben, wie SEM funktioniert und wie man eine biologische Probe für die Bildgebung vorbereitet, werfen wir einen Blick darauf, wie man ein Kollagen-Hydroxyapatit-Gewebegerüst vorbereitet und abbilden kann.

Montieren Sie zunächst die Biomaterialprobe mit leitfähigem Carbonband auf einen SEM-Stummel und stellen Sie sicher, dass die Probe trocken ist und keine Verunreinigungen an der Oberfläche hat.

Legen Sie dann die montierte Probe in die Kammer eines Sputterlackturms, pumpen Sie die Kammer herunter und beschichten Sie die Probe für etwa 40 Sekunden, um eine dünne, vier bis sechs Nanometer dicke Beschichtung aus Metall, in diesem Fall Gold, mit ausreichender Abdeckung zu erreichen. Nach der Beschichtung entfernen Sie die Probe und verwenden Sie leitfähiges Klebeband, um den Stub an die Oberseite der Probe anzuschließen, die nun mit leitfähigem Metall beschichtet ist.

Schließlich montieren Sie den Stummel auf der SEM-Bühne und ziehen Sie die Schraube an der Seite fest. Jetzt ist das Beispiel bereit, mit SEM abzubilden. Laden Sie zuerst die Bühne in die SEM-Kammer und versiegeln Sie die Tür, dann drücken Sie den Transferknopf, um den Durchgang von der Ladekammer zum Vakuum zu öffnen. Sobald die Innentür geöffnet ist, schrauben Sie die Metallstange in die Bühne und drücken Sie die Probe in die Vakuumkammer, dann schrauben Sie die Metallstange ab und ziehen Sie sie vollständig in die Ladekammer ein, und drücken Sie dann den Lageraufschlag, um die Vakuumkammer zu schließen.

Lassen Sie uns nun das Beispiel mit SEM abbilden.

Bewegen Sie zunächst die Bühne mit dem Controller, navigieren Sie in das Sichtfeld, und verschieben Sie die Probe dann vertikal, bis der Arbeitsabstand fünf bis zehn Millimeter beträgt. Schalten Sie den Elektronenstrahl ein und wählen Sie den Detektor für Sekundärelektronen aus, stellen Sie den Strahl zunächst auf fünf Kiloelektronenvolt ein und erhöhen Sie dann bei Bedarf bis zu 20 bis 30 Kiloelektronenvolt. Wenn das Bild nicht klar ist, drehen Sie den Fokus, die Helligkeit und die Kontrastknöpfe, bis ein klares Bild angezeigt wird.

Verwenden Sie die Bühnennavigation und die X- und Y-Richtungen, um einen neuen Punkt in der Probe zu finden, und erhöhen Sie dann die Vergrößerung, bis die gewünschten Features sichtbar sind. Passen Sie den Fokus, den Kontrast und die Helligkeit nach Bedarf an, um die Bildqualität zu verbessern. Möglicherweise müssen Sie die Scangeschwindigkeit verringern und die Online-Mittelung aktivieren, um ein besseres Bild zu erhalten, und dann das Bild speichern.

Die SEM-Bilder zeigen eine sehr dreidimensionale und poröse Struktur mit faserigen Merkmalen kleiner als 25 Mikrometer. Diese Merkmale wären mit der optischen Mikroskopie schwer zu visualisieren, da die optische Mikroskopie eine viel geringere Schärfentiefe aufweist.

Es gibt viele Herausforderungen, die mit der Abbildung biologischer Strukturen mit SEM verbunden sind, einschließlich Strukturkollaps oder Schäden durch den hochenergetischen Elektronenstrahl. Werfen wir nun einen Blick darauf, wie die allgemeine SEM-Technik auf diese Arten von empfindlichen Proben angewendet wird. Empfindliche biologische Strukturen, wie diese jungen Pflanzengewebe oder solche mit einem hohen Wassergehalt, müssen vor der Bildgebung durch einen Fixierungsprozess behandelt werden.

Diese blumigen Meristme wurden sofort mit einer frisch zubereiteten Formalin/Essigsäure-Fixierungslösung behandelt. Das feste Gewebe wurde in Ethanol seziert, in einen Netzbehälter gelegt und durch eine Ethanolreihe von 70%, 80%, 90% und 100% Ethanol dehydriert. Schließlich wurden die Pflanzengewebe mit einem kritischen Punkttrockner getrocknet, montiert und mit einer dünnen Metallbeschichtung beschichtet.

Nach sem-Bildgebung ist klar, dass die unbehandelten Strukturen durch den Trocknungsprozess stark beschädigt wurden und einen erheblichen Zusammenbruch der Struktur zeigten, während diejenigen, die fixiert waren, ihre native Struktur beibehielten. Alternativ können Zellen und andere Proben mit hohem Wassergehalt mit Umgebungs-SEM oder ESEM abgebildet werden. ESEM verwendet einen hochenergetischen Elektronenstrahl, der über der Probe rastergescannt wird, wie bei herkömmlichen SEM ermöglicht es jedoch die Abbildung nasser oder unbeschichteter Proben, indem eine gasförmige Umgebung innerhalb der Kammer erhalten bleibt.

Dies geschieht durch Trennen der Hochvakuumkammer, die die Elektronenkanone enthält, mit zwei Öffnungen von der Probenkammer. Der Elektronenstrahl verursacht erhebliche Verluste durch Streuung durch Gasmoleküle, ist aber in der Regel eine ausreichend hohe Energie für die Bildgebung. Hier wurden Zellen auf einem Siliziumchip angebaut, mit Quantenpunkten funktionalisiert und mit einem Glutaraldehyd-Fixierungsprotokoll fixiert. Die Zellen wurden in Wasser abgebildet und zeigen die unreduzierte Struktur der Zelle mit einzelnen Quantenpunkten, die auf der Zelloberfläche sichtbar sind.

Sie haben gerade JoVeTs Einführung in die Visualisierung von Biomaterialien mit SEM gesehen. Sie sollten nun verstehen, wie SEM funktioniert, wie biologische Proben vorbereitet und abgebildet werden, sowie einige Anwendungen der Technik für empfindliche Strukturen.

Danke fürs Zuschauen!

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