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Ensaios ELISA: Indireto, Sanduíche e Competitivo

Overview

Fonte: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, e Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Departamento de Urologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
2 Centro de Imunologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
3 Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Imunologia e Biologia do Câncer, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
4 Centro de Câncer Maçônico, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455

O ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA) é frequentemente usado para medir a presença e/ou concentração de um antígeno, anticorpo, peptídeo, proteína, hormônio ou outra biomolécula em uma amostra biológica. É extremamente sensível, capaz de detectar baixas concentrações de antígeno. A sensibilidade da ELISA é atribuída à sua capacidade de detectar as interações entre um único complexo de anticorpos de antígeno (1). Além disso, a inclusão de um anticorpo específico de antígeno conjugado por enzimas permite a conversão de um substrato incolor em um produto cromogênico ou fluorescente que pode ser detectado e facilmente quantitado por um leitor de placas. Quando comparada aos valores gerados por quantidades tituladas de um antígeno conhecido de interesse, a concentração do mesmo antígeno nas amostras experimentais pode ser determinada. Diferentes protocolos ELISA foram adaptados para medir concentrações de antígenos em uma variedade de amostras experimentais, mas todos eles têm o mesmo conceito básico (2). A escolha do tipo de ELISA para realizar, indireta, sanduíche ou competitiva, depende de uma série de fatores, incluindo a complexidade das amostras a serem testadas e os anticorpos específicos do antígeno disponíveis para uso. A ELISA indireta é frequentemente utilizada para determinar o resultado de uma resposta imunológica, como medir a concentração de um anticorpo em uma amostra. O sanduíche ELISA é mais adequado para analisar amostras complexas, como supernascedores de cultura tecidual ou lises de tecido, onde o analito, ou antígeno de interesse, faz parte de uma amostra mista. Finalmente, o ELISA competitivo é mais frequentemente utilizado quando há apenas um anticorpo disponível para detectar o antígeno de interesse. EliSAs competitivas também são úteis para detectar um pequeno antígeno com apenas um único epítope de anticorpos que não pode acomodar dois anticorpos diferentes devido à dificultação estérica. O protocolo descreverá os procedimentos básicos para os ensaios ELISA indiretos, sanduíches e competitivos.

O ensaio ELISA indireto é comumente usado para medir a quantidade de anticorpos no soro ou no sobrenatante de uma cultura hibrida. O procedimento geral para o ensaio ELISA indireto é:

  1. Reveste poços com antígenos
  2. Adicionar supernanato da cultura sérico ou hibridoma contendo anticorpos (anticorpo primário ou 1°)
  3. Incubar e lavar
  4. Adicionar anticorpo secundário (ou 2°) conjugado por enzimas
  5. Incubar e lavar
  6. Adicionar substrato

O ensaio ELISA sanduíche difere do ensaio elisa indireto na medida em que o método não envolve revestir as placas com um antígeno purificado. Em vez disso, um anticorpo "captura" é usado para revestir os poços da placa. O antígeno é "sanduíche" entre o anticorpo de captura e um segundo anticorpo conjugado por enzimas de "detecção" - onde ambos os anticorpos são específicos para o mesmo antígeno, mas em epítopos diferentes (3). Ao vincular-se ao complexo de anticorpos/antígenos de captura, o anticorpo de detecção permanece na placa. Anticorpos monoclonais ou antisera policlonal podem ser usados como anticorpos de captura e detecção. A principal vantagem do sanduíche ELISA é que a amostra não precisa ser purificada antes da análise. Além disso, o ensaio pode ser bastante sensível (4). Muitos kits ELISA disponíveis comercialmente são da variedade de sanduíches e usam pares de anticorpos testados e combinados. O procedimento geral para o ensaio elisa sanduíche é:

  1. Poços de revestimento com anticorpo de captura
  2. Adicione amostras de teste contendo antígeno
  3. Incubar e lavar
  4. Adicione anticorpo de detecção conjugado por enzimas.
  5. Incubar e lavar
  6. Adicionar substrato

A maioria dos kits ELISA de sanduíche disponíveis comercialmente vêm com anticorpos de detecção conjugados por enzimas. Nos casos em que um anticorpo de detecção conjugado por enzimas não esteja disponível, um anticorpo coordenado por enzimas secundárias específico para o anticorpo de detecção pode ser usado. A enzima no anticorpo secundário desempenha o mesmo papel, que é converter o substrato incolor em um produto cromogênico ou fluorescente. O anticorpo secundário já mencionado conjugado por enzimas gostaria mais de ser usado em um sanduíche "caseiro" ELISA desenvolvido por um investigador que gerou seus próprios anticorpos monoclonais, por exemplo. Uma desvantagem ao uso de um anticorpo coordenado por enzimas secundárias é ter certeza de que ele se liga apenas ao anticorpo de detecção, e não ao anticorpo de captura ligado à placa. Isso resultaria em um produto mensurável em todos os poços, independentemente da presença ou ausência de antígeno ou anticorpo de detecção.

Finalmente, o ensaio ELISA competitivo é usado para detectar antígenos solúveis. É simples de executar, mas só é adequado quando o antígeno purificado está disponível em uma quantidade relativamente grande. O procedimento geral para o ensaio ELISA competitivo é:

  1. Poços de casaco com antígeno
  2. Incubar e lavar
  3. Amostra de teste pré-incobarto com anticorpos primários conjugados por enzimas
  4. Adicione a mistura para bem
  5. Incubar e lavar qualquer anticorpo primário conjugado por enzimas não ligado
  6. Adicionar substrato

A "competição" neste ensaio vem do fato de que mais antígeno na amostra de ensaio usada na etapa 3 resultará em menos anticorpo disponível para se ligar ao revestimento de antígeno do poço. Assim, a intensidade do produto cromogênico/fluorogênico no poço no final do ensaio está inversamente relacionada à quantidade de antígeno presente na amostra de ensaio.

Um componente-chave em qualquer tipo de ELISA são os padrões titulados de concentrações conhecidas que permitirão ao usuário determinar a concentração de antígeno presente nas amostras de teste. Normalmente, uma série de poços são designados para criar uma curva padrão, onde quantidades conhecidas de uma proteína recombinante purificada são adicionadas aos poços em quantidades decrescentes. Quando esses poços são processados ao mesmo tempo que as amostras de teste, o usuário pode então ter um conjunto de referência de valores de absorção obtidos de um leitor de microplato para concentrações de proteínas conhecidas para acompanhar os valores de absorção para as amostras de teste. O usuário pode então calcular uma curva padrão à qual as amostras de teste podem ser comparadas para determinar a quantidade de proteína de interesse presente. A curva padrão também pode determinar o grau de precisão da produção de diluição do usuário.

Finalmente, a última etapa em cada um dos tipos ELISA listados acima exige a adição de um substrato. O grau de conversão do substrato ao produto está diretamente relacionado com a quantidade de enzima presente no poço. Peroxidase de rabanete (HRP) e fosfatismo alcalino (AP) são as enzimas mais comuns encontradas conjugadas a anticorpos. Como esperado, há uma série de substratos disponíveis específicos para enzimas que produzem um produto cromogênico ou fluorescente. Além disso, substratos estão disponíveis em uma gama de sensibilidades que podem aumentar a sensibilidade geral do ensaio. O usuário também deve levar em consideração o tipo de instrumentação disponível para a leitura da placa no final do experimento ao escolher o tipo de substrato a ser usado, juntamente com seu anticorpo correspondente enzimático conjugado.

Substratos cromogênicos comumente usados para HRP incluem 2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) e 3,3',5,5'-tetrameethylbenzidina (TMB), enquanto p-Nitrofenil Phosphate (PNPP) é usado para AP. ABTS e TMB produzem produtos de reação verde e azul solúveis em água, respectivamente. O produto ABTS verde tem dois picos principais de absorção, 410 e 650 nm, enquanto o produto Azul TMB é melhor detectado em 370 e 652 nm. As cores de ABTS e TMB mudam para amarelo após a adição de uma solução de parada ácida, que é melhor lida em 450 nm. O desenvolvimento de cores para ABTS é lento, enquanto é rápido para TMB. O TMB é mais sensível que o ABTS, e pode produzir um sinal de fundo mais alto se a reação enzimática continuar por muito tempo. A PNPP produz um produto amarelo solúvel em água após a conversão de AP que absorve a luz a 405 nm.

Procedure

1. Elisa indireta

Um ELISA indireto é aquele em que o anticorpo primário específico do antígeno é reconhecido por um anticorpo conjugado secundário. O protocolo a seguir é um exemplo de um método ELISA indireto, onde as amostras de soro de camundongos infectados pelo vírus influenza A (IAV) são testadas para a presença de anticorpo IgG específico do IAV. Uma força deste exemplo é que diferentes anticorpos secundários podem ser usados que reconhecem todos os isótipos de anticorpos ou isótipos específicos (por exemplo, IgG).

Revestimento de antígeno para a microplacão

  1. Cubra os poços de uma placa ELISA de 96 poços com antígeno purificado por tubos de 50 μL de antígeno purificado (2 mg/mL de vírus purificado A/PR/8 Influenza A em 0,05M Tampão Tris-HCl (pH 9,5)) em cada poço da placa.
  2. Cubra a placa com uma tampa adesiva e incuba-a durante a noite a 4°C para permitir que o antígeno se ligue à placa.
  3. Após a conclusão da incubação, remova a solução de revestimento, jogando a placa sobre uma pia.

Bloqueio

  1. Bloqueie os locais de ligação de proteína restantes nos poços revestidos adicionando 200 μL de tampão de bloqueio, 5% de soro de burro em 1X PBS é usado aqui, por poço. Os reagentes de bloqueio alternativos incluem 5% de leite seco não gordo ou BSA em PBS ou soro normal de um animal no qual o anticorpo secundário foi gerado.
  2. Incubar por pelo menos 2 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C.
  3. Após a incubação, remova o tampão de bloqueio apertando a placa e, em seguida, lave a placa com PBS contendo 1% de Interpol-20.

Incubação com o anticorpo primário

  1. Prepare uma diluição serial da amostra de soro, que contém o anticorpo primário, para obter uma faixa de diluição de 1 a 204.800, utilizando 1X PBS. Para isso, primeiro dilua o soro 1:12.5 e depois realize uma diluição de 4X (faixa de diluição - 1:12.5 a 1:204.800).
  2. Adicione 100 μL das amostras de soro diluídas em série aos poços.
  3. Cubra a placa com tampa adesiva e incubar à temperatura ambiente por 1-2 h.
  4. Após a incubação, passe a placa sobre uma pia e lave a placa com PBS contendo 1% de Interpol-20.

Incubação com o anticorpo secundário

  1. Adicione 100 μL de um anticorpo secundário conjugado por enzimas, peroxidase de rabanete, anti-rato de burro conjugado hrp neste experimento, para cada poço.
  2. Incubar a placa por 1 hora em temperatura ambiente.
  3. Após a incubação, passe a placa sobre uma pia e depois lave a placa com PBS contendo 1% de Interpol-20.

Detecção

  1. Adicione 100 μL do substrato indicador (3,3',5,5'-tetramebenzidina (TMB)) a uma concentração de 1 mg/mL para cada poço.
  2. Incubar a placa com o substrato por 5-10 min em temperatura ambiente.
  3. Após 10 min, pare a reação enzimática adicionando 100 μL 2N ácido sulfúrico (H2SO4).
    Dentro de 30 minutos de adicionar a solução stop, leia a placa usando um leitor de microplacas a 405 nm para determinar a absorvância dos poços.

2. Sanduíche ELISA

Nesta versão ELISA, a amostra experimental é "sanduíche" entre um anticorpo de captura não conjugado e um anticorpo de detecção conjugado, ambos específicos para a mesma proteína, mas em epítopos diferentes. No exemplo elisa sanduíche a seguir, a concentração de TNFα humano foi determinada em amostra desconhecida usando uma curva padrão gerada a partir da diluição serial de 2,5X de um TNFα humano padrão e recombinante conhecido (indicando na concentração de 75 pg/mL).

Revestimento captura anticorpo para a microplacão

  1. Cubra os poços de uma placa ELISA de 96 poços com anticorpo de captura purificado adicionando 100 μL de anticorpo de captura (1-10 μg/mL de alcance) a cada poço da placa.
  2. Cubra a placa com uma tampa de placa adesiva e incuba-a durante a noite a 4°C.
  3. Após a incubação, remova a solução de revestimento da placa, jogando a placa sobre uma pia.

Bloqueio

  1. Bloqueie os locais de ligação de proteína restantes nos poços revestidos de anticorpos adicionando 200 μL de solução de bloqueio, 5% de leite seco sem gordura contendo PBS, aos poços.
  2. Incubar por pelo menos 2 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C.
  3. Após a incubação, remova o tampão de bloqueio apertando a placa e, em seguida, lave a placa com PBS contendo 1% de Interpol-20.

Adicionar amostras de teste contendo antígenos

  1. Adicione 100 μL da amostra de ensaio aos poços. Sele a placa com uma tampa adesiva.
  2. Incubar por 1-2 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C.
  3. Após a incubação, remova as amostras movendo a placa sobre a pia e, em seguida, lave os poços com 200 μL 1X PBS contendo 1% de Interpol-20.

Adicionar anticorpo de detecção conjugado por enzimas

  1. Adicione 100 μL de anticorpo de detecção conjugado com enzimas aos poços em uma concentração pré-otimizada.
  2. Sele a placa com uma tampa adesiva e incubar em temperatura ambiente por 2h.
  3. Remova o anticorpo de detecção sem saída, movendo a placa sobre uma pia e lave os poços com 200 μL 1X PBS contendo 1% de Interpol-20.

Detecção

  1. Adicione 100 μL do substrato indicador a uma concentração de 1 mg/mL. Qualquer anticorpo de detecção conjugado por enzimas ligadas converterá o substrato em um sinal detectável.
  2. Incubar a placa por 5-10 min em temperatura ambiente.
  3. Após 5-10 min, pare a reação enzimática adicionando 100 μL 2N H2SO4 aos poços. Dentro de 30 minutos de adicionar a solução stop, leia a placa usando um leitor de microplacão para determinar a absorção dos poços.

3. ELISA competitiva

As etapas de um ELISA competitivo são diferentes das utilizadas em ELISA indireta e sanduíche, sendo a principal diferença a etapa de vinculação competitiva entre o antígeno amostral e o antígeno "add-in". O antígeno amostra é incubado com o anticorpo primário não rotulado. Estes complexos anticorpos-antígenos são então adicionados à placa ELISA, que foi pré-revestida com o mesmo antígeno. Após um período de incubação, qualquer anticorpo desvinculado é lavado. Há uma correlação inversa entre a quantidade de anticorpos livres disponíveis para ligar o antígeno no poço e a quantidade de antígeno na amostra original. Por exemplo, uma amostra com antígeno abundante teria mais complexos de anticorpos primários de antígeno, deixando pouco anticorpo desvinculado para se ligar à placa ELISA. Um anticorpo secundário conjugado por enzimas específico para o anticorpo primário é então adicionado aos poços, seguido pelo substrato.

Revestimento de antígeno para a microplacão

  1. Cubra os poços de uma placa ELISA de 96 poços com 100 μL de antígeno purificado a uma concentração de 1-10 μg/mL.
  2. Cubra a placa com uma tampa de placa adesiva e incubar a placa durante a noite a 4°C.
  3. Após a incubação, remova a solução de antígeno desvinculada dos poços, sacudindo a placa sobre uma pia.

Bloqueio

  1. Bloqueie os locais de ligação de proteína restantes nos poços revestidos adicionando 200 μL de tampão de bloqueio a cada poço, que pode ser 5% de leite seco não gordo ou BSA em PBS.
  2. Incubar a placa por pelo menos 2 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C.

Amostra de incubação (antígeno) com o anticorpo primário

  1. Ao bloquear os poços, prepare a mistura de anticorpos de antígeno misturando antígeno de amostra de 150 μL e 150 μL de anticorpo primário para cada poço no ensaio.
  2. Incubar esta mistura por 1h a 37°C.

Adicione mistura de anticorpos de antígeno ao poço

  1. Agora, remova o tampão de bloqueio dos poços, jogando a placa sobre uma pia.
  2. Em seguida, lave os poços com 1X PBS contendo Interpol-20.
  3. Adicione 100 μL da mistura de anticorpos antígenos-primários.
  4. Incubar a placa a 37°C por 1h.
  5. Remova a mistura de amostra, movendo a placa sobre uma pia.
  6. Em seguida, lave os poços com 1X PBS contendo 1% de Interpol-20 para remover qualquer anticorpo desvinculado.

Adicione o anticorpo secundário

  1. Adicione 100 μL de um anticorpo secundário conjugado enzimático, que neste caso é anticorpo conjugado ap, a cada poço.
  2. Incubar a placa por 1h a 37°C.
  3. Após a incubação, lave a placa com 1X PBS contendo 1% de Interpol-20.

Detecção

  1. Adicione 100 μL da solução do substrato a cada poço.
  2. Espere 5-10 min.
  3. Após 10 minutos, pare a reação enzimática adicionando 100 μL 2N de ácido sulfúrico aos poços. Em seguida, meça a absorvância em um leitor de microplacão dentro de 30 minutos de adicionar a solução stop

Ensaio imunossorbente ligado à enzima, ou ELISA é um ensaio quantitativo altamente sensível comumente usado para medir a concentração de um analito como citocinas e anticorpos em uma amostra biológica. O princípio geral deste ensaio envolve três etapas: começar pela captura, ou imobilização, do analito alvo em uma microplacão, seguido pela detecção do analito por proteínas de detecção específicas de alvo, e, por último, reação enzimática, onde uma enzima conjugada converte seu substrato em um produto colorido. Com base em diferentes métodos de captura e detecção, a ELISA pode ser de quatro tipos: direta, indireta, sanduíche e competitiva.

Para ELISA direta, o antígeno alvo é primeiro ligado à placa, e é detectado por um anticorpo de detecção específico. Este método é comumente usado para triagem de anticorpos para um antígeno específico. A ELISA indireta é usada para detectar anticorpos em uma amostra, a fim de quantificar as respostas imunológicas. A placa é primeiro revestida com um antígeno de captura específico, que imobiliza o anticorpo alvo, e este complexo de anticorpos de antígeno é então detectado usando um segundo anticorpo.

No caso do sanduíche ELISA, o analito alvo é um antígeno, que é capturado na placa usando um anticorpo de captura e, em seguida, detectado pelo anticorpo de detecção, formando assim um sanduíche de anticorpo-anticorpos. Este método é útil para medir a concentração de um antígeno em uma amostra mista.

A ELISA competitiva é usada quando apenas um anticorpo está disponível para um antígeno de destino de interesse. A placa é revestida pela primeira vez com o antígeno purificado. Enquanto isso, a amostra contendo o antígeno é pré-incubada com o anticorpo e, em seguida, adicionada à placa, para permitir que quaisquer moléculas de anticorpos livres se liguem ao antígeno imobilizado. Quanto maior o sinal da placa, menor a concentração de antígeno na amostra. Em todos os quatro tipos de ELISA, direto, indireto, sanduíche e competitivo, o anticorpo de detecção é diretamente conjugado à enzima ou pode ser indiretamente ligado a ele através de outro anticorpo ou proteína.

As enzimas comumente utilizadas para a reação são peroxidase de rabanete ou fosfattase alcalina com seus respectivos substratos, ambos produzindo um produto solúvel e colorido que pode ser medido e quantificado usando um leitor de placas. Neste vídeo, você observará como realizar elisa indireta, sanduíche ELISA, e ELISA competitiva, seguido de exemplos de quantificação do analito alvo a partir dos métodos elisa indiretos e sanduíches.

O primeiro experimento demonstrará como usar ELISA indireta para determinar a presença de anticorpos anti-vírus da gripe no soro obtidos de camundongos infectados pela gripe.

Para começar, adicione 50 microliters de antígeno purificado - neste caso, 2 miligramas por mililitro de vírus purificado A/PR/8 Influenza A - a cada poço de uma placa ELISA de 96 poços. Em seguida, cubra a placa com uma tampa adesiva e incuba-a durante a noite a 4 graus celsius para permitir que o antígeno se ligue à placa. No dia seguinte, remova a solução de revestimento, sacudindo a placa sobre uma pia. Em seguida, bloqueie os locais de ligação de proteínas restantes nos poços revestidos adicionando 200 microliters de um buffer de bloqueio- aqui, 5% de soro de burro em 1X PBS - para cada poço. Deixe a placa incubar por pelo menos 2 horas em temperatura ambiente. Após a incubação, remova o tampão de bloqueio e depois lave a placa adicionando 200 microliters de 1X PBS contendo 1% de Interpol-20. Passe a placa sobre a pia mais uma vez para remover a lavagem.

Em seguida, prepare as amostras de teste adicionando 460 microliters de PBS a um tubo fresco, e depois adicionando 40 microliters de soro para fazer uma diluição de 1 a 12,5. Em seguida, adicione 300 microliters de PBS a um segundo tubo, e depois adicione 100 microliters da primeira diluição. Continue esta faixa de diluição serial até obter uma amostra final com uma diluição de 1 a 204.800. Adicione as amostras de soro diluídos em série em triplicado aos poços. Cubra a placa com uma tampa adesiva e incubar em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, remova as amostras movendo a placa na pia e, em seguida, lave a placa adicionando 200 microliters de 1X PBS contendo 1% de Interpol-20. Mais uma vez, aperte a placa para remover a lavagem.

Agora, adicione 100 microliters de um anticorpo secundário conjugado por enzimas, que neste experimento é uma peroxidase de rabanete, ou HRP, anti-rato de burro conjugado, para cada poço. Incubar a placa por uma hora em temperatura ambiente e apertar a placa para remover qualquer excesso de líquido. Lave a placa com 1X PBS contendo 1% de Tween-20 e, em seguida, aplique 100 microlitres do substrato indicador a uma concentração de um miligrama por mililitro para cada poço. Incubar a placa com o substrato por 5 a 10 minutos em temperatura ambiente. Neste exemplo, o incolor 3,3', 5,5' - tetrametilbenzidina, ou TMB, substrato vira uma cor azul quando o HRP está presente. Após 10 minutos, pare a reação enzimática adicionando 100 microliters de ácido sulfúrico 2N. As amostras vão virar uma cor amarela.

Dentro de 30 minutos após a adição da solução stop, insira a placa em um leitor de microplaca e leia a placa no comprimento de onda apropriado para que o substrato determine a absorção dos poços.

Para começar o sanduíche ELISA, o prato deve ser revestido com anticorpo de captura purificada. Para isso, adicione 100 microliters do anticorpo de captura em uma concentração dentro da faixa de 1-10 microgramas por mililitro, a cada poço de uma placa ELISA de 96 poços. Em seguida, cubra a placa com uma tampa de placa adesiva e, em seguida, incubar a placa durante a noite a 4 graus celsius. Após a incubação, remova a solução de revestimento, sacudindo a placa sobre uma pia.

Agora, bloqueie os locais de ligação de proteínas remanescentes nos poços revestidos adicionando 200 microlitres de 5% de leite seco não gordo aos poços. Incubar a placa em temperatura ambiente por pelo menos 2 horas. Em seguida, remova o tampão de bloqueio e, em seguida, lave os poços com 1X PBS contendo 1% de Interpol-20. Remova a lavagem jogando a placa sobre a pia. Agora, adicione 100 microliters da amostra de ensaio aos poços, sele a placa com uma tampa adesiva e, em seguida, incuba-a em temperatura ambiente por 2 horas. Após a incubação, remova as amostras movendo a placa sobre a pia e, em seguida, lave os poços com 200 microliters de 1X PBS contendo 1% de Interpol-20. Passe a placa sobre a pia para remover a lavagem e, em seguida, adicione 100 microliters de anticorpo de detecção conjugado por enzimas aos poços.

Sele a placa com uma tampa adesiva. Deixe a placa incubar em temperatura ambiente por 2 horas. Após a incubação, remova o anticorpo de detecção sem amarras, movendo a placa sobre uma pia e lave os poços com 200 microliters de 1X PBS contendo 1% de Tween-20. Em seguida, adicione 100 microlitres do substrato indicador a uma concentração de 1 miligrama por mililitro, e incubar a placa por 5 a 10 minutos à temperatura ambiente. Após 10 minutos, pare a reação enzimática adicionando 100 microliters de ácido sulfúrico de 2N aos poços e, em seguida, leia a placa dentro de 30 minutos após adicionar a solução stop em um leitor de microplato.

Para realizar um ELISA competitivo, primeiro cubra os poços de uma placa ELISA de 96 poços com 100 microlitres de antígeno purificado a uma concentração de 1-10 microgramas por mililitro. Cubra a placa com uma tampa de placa adesiva e, em seguida, incubar durante a noite a 4 graus celsius. Na sequência, remova a solução de antígeno desvinculada dos poços, jogando a placa sobre uma pia.

Em seguida, bloqueie os locais de ligação de proteínas remanescentes nos poços revestidos adicionando 200 microliters de tampão de bloqueio a cada poço- aqui, 5% de leite seco sem gordura em PBS. Incubar a placa por pelo menos 2 horas em temperatura ambiente. Enquanto bloqueia os poços, prepare a mistura de antígeno-anticorpo em um 1. 5 tubos mililitros adicionando 150 microliters de antígeno amostral a 150 microliters de anticorpos primários para cada poço no ensaio. Incubar esta mistura por 1 hora a 37 graus celsius. Agora, remova o tampão de bloqueio dos poços, jogando a placa sobre uma pia. Em seguida, lave os poços com 1X PBS contendo Tween 20 e, em seguida, adicione 100 microliters da mistura de anticorpos primários de antígeno de amostra.

Deixe a placa para incubar a 37 graus celsius por uma hora. Em seguida, remova a mistura de amostra, movendo a placa sobre uma pia e, em seguida, lave os poços com 1X PBS contendo 1% de Interpol-20 para remover qualquer anticorpo desvinculado. Adicione 100 microliters de um anticorpo secundário conjugado por enzimas a cada poço e incubar a placa por uma hora a 37 graus celsius. Na sequência, lave a placa com 1X PBS contendo 1% de Interpol-20 e, em seguida, adicione 100 microliters da solução do substrato a cada poço. Espere de 5 a 10 minutos. Após 10 minutos, pare a reação enzimática adicionando 100 microlitadores de ácido sulfúrico de 2N e, em seguida, meça a absorvância em um leitor de microplaca dentro de 30 minutos após adicionar a solução stop.

Para o ensaio elisa indireto semi-quantitativo, a presença de anticorpos vírus influenza A em amostras diluídas em série de soro de camundongos infectados pela influenza A foi determinada pela leitura da absorção de cada poço em 405 nanômetros em um leitor de placas. Esses dados brutos são exportados para uma planilha para fins de cálculo. Neste experimento, as amostras de soro diluídas em série, que variam de 1 a 12,5, a 1 - 204.800, foram repetidas em triplicado.

Para analisar os dados, o valor médio de absorção é, portanto, calculado para cada conjunto de triplicados adicionando todos os valores para cada diluição e dividindo a soma por 3. Uma vez determinada a média para cada conjunto de triplicados, as leituras médias de OD450 são traçadas contra as diluições seriais. As leituras de DD diminuem à medida que o soro é diluído, indicando que menos anticorpos são encontrados nas amostras mais diluídas. No sanduíche quantitativo ELISA, diluições de padrão conhecido, neste caso recombinar TNFalpha Humano, foram adicionadas a uma placa de 96 poços e lidas juntamente com as amostras desconhecidas.

Para criar a curva padrão, calculou-se o valor médio de absorção para cada conjunto de leituras das concentrações conhecidas. Em seguida, o valor médio de absorção foi plotado no eixo y, contra as conhecidas concentrações proteicas no eixo x. Uma curva de melhor ajuste é adicionada através dos pontos no gráfico.

Uma vez gerada a curva padrão, a quantidade de proteína TNFalpha na amostra de ensaio pode ser determinada primeiro calculando o valor médio de absorção para a amostra de ensaio. Neste exemplo, as amostras de teste deram leituras de OD450 de 0,636 e 0. 681. Adicionar esses valores e dividir a soma por 2 dá uma média de 0,659. Do eixo y no gráfico de curva padrão, estenda uma linha horizontal deste valor de absorção até a curva padrão. No ponto de intersecção, amplie uma linha vertical ao eixo x e leia a concentração correspondente que, nesta amostra de teste, corresponde a uma concentração TNFalpha de 38,72 picogramas por mililitro.

Results

No exemplo a seguir de um ELISA indireto, foi determinada a presença de IgG específico do vírus influenza A (IAV) no soro de camundongos infectados pelo IAV. Os camundongos C57Bl/6 foram infectados pelo vírus influenza A (A/PR/8; 105 PFU em 100 μL PBS i.p.) e o soro foi coletado 28 dias depois. Para quantificar a quantidade de IGG específico do IAV no soro, placas ELISA de 96 poços foram revestidas com vírus purificado de Influenza A (50 μL/well de 2 mg/ml pbs vírus) durante a noite a 4°C. As placas revestidas foram bloqueadas por 1 hora à temperatura ambiente com soro de burro 5% normal na PBS, seguido pela incubação com amostras de soro diluído de camundongos desafiados pelo IAV durante a noite a 4°C. O soro foi inicialmente diluído 1:12.5, seguido por diluições de 1:4 (faixa de diluição - 1:12.5 a 1:204.800). Após a lavagem, as placas foram incubadas com um fosfattase alcalina (AP)-conjugado anti-rato IgG por 1 h. As placas foram lavadas e, em seguida, p-Fósforo nitrofenil (PNPP; 1 mg/mL, 100 μL/bem) foi adicionado. A solução PNPP incolor se transforma em uma cor amarela quando o AP está presente. Após 5-10 min, a reação enzimática foi interrompida adicionando 100 μL/well 2N H2SO4. A placa foi lida em um leitor de microplacas a 405 nm. Os resultados obtidos são mostrados na Tabela 1 e Figura 1.

Amostra Wells OD405 Significar
Soro 1:12.5 A1 2.163 2.194
B1 2.214
C1 2.204
Soro 1:50 A1 1.712 1.894
B1 2.345
C1 1.624
Soro 1:200 A1 1.437 1.541
B1 1.73
C1 1.456
Soro 1:800 A1 1.036 0.957
B1 0.912
C1 0.923
Soro 1:3200 A1 0.579 0.48
B1 0.431
C1 0.429
Soro 1:12800 A1 0.296 0.281
B1 0.312
C1 0.236
Soro 1:51200 A1 0.308 0.283
B1 0.299
C1 0.243
Soro 1:204800 A1 0.315 0.303
B1 0.298
C1 0.297

Tabela 1: Dados indiretos de ensaio ELISA. Diluições de soro (de 1:12.5 a 1:204.800), de camundongos infectados pelo vírus influenza A (IAV)contendo IGG específico do IAV, valores de densidade óptica (OD) (405 nm) e valores médios de OD405.

Figure 1
Figura 1: Gráfico de dispersão de ensaios indiretos ELISA de valores médios deOD 405 (+ S. D.) e diluições de soro (de 1:12.5 a 1:204.800), do vírus influenza A (IAV)-specific IgG no soro de camundongos infectados pelo IAV. Os valores OD405 podem ser inversamente correlacionados com as diluições do soro.

No exemplo a seguir de um sanduíche ELISA, uma diluição de 1:2.5 de padrões TNFα humanos recombinantes (a partir de uma concentração de 75 pg/mL) foi adicionada aos poços indicados de uma placa de fundo plana de 96 poços. Esses padrões levaram a uma variação correspondente de 2,5 vezes nas leituras de absorvência.

Amostra Concentração (pg/mL) Wells Valores Valor Médio Cálculo de concentração traseira Média
Padrão 1 75 A1 1.187 1.169 76.376 75.01
A2 1.152 73.644
Padrão 2 30 B1 0.534 0.52 30.827 29.962
B2 0.506 29.098
Padrão 3 12 C1 0.23 0.217 12.838 12.105
C2 0.204 11.372
Padrão 4 4.8 D1 0.09 0.084 5.055 4.726
D2 0.078 4.398
Padrão 5 1.92 E1 0.033 0.031 1.941 1.86
E2 0.03 1.778
Padrão 6 0.768 F1 0.009 0.011 0.626 0.764
F2 0.014 0.901
Padrão 7 0.307 G1 0.002 0.004 0.238 0.377
G2 0.007 0.516

Tabela 2: TNFα Sandwich ELISA dados de curva padrão. Uma diluição de 1:2.5 dos padrões humanos recombinantes TNFα (75 a 0,3 pg/mL), valores OD (450 nm), valores médios de OD450, cálculos de concentração de costas e suas médias.

Figure 2
Figura 2: Curva Padrão para sanduíche TNFα ELISA. Foi analisada uma diluição de 1:2.5 das normas TNFα humanas recombinantes (75 a 0,3 pg/mL) utilizando-se sanduíche ELISA. Os valores OD450 podem estar diretamente correlacionados com as concentrações de diluição padrão. A quantidade de proteína TNFα na amostra de ensaio foi determinada utilizando-se a curva padrão, que corresponde a uma concentração de 38,72 pg/mL.

Uma vez gerada a curva padrão, a quantidade de proteína TNFα na amostra de ensaio foi determinada. Neste exemplo elisa sanduíche, as amostras de teste deram OD450 leituras de 0,636 e 0,681, que dão uma média de 0,6585. Ao traçar esta leitura OD450 no gráfico acima, isso corresponde a uma concentração TNFα de 38,72 pg/ml.

Applications and Summary

Como demonstrado, uma gama de imunoensaios (com ligeira variação nos protocolos) se enquadra na família técnica ELISA. Determinar qual versão de ELISA usar depende de uma série de fatores, incluindo o antígeno que está sendo detectado, o anticorpo monoclonal disponível para um determinado antígeno e a sensibilidade desejada do ensaio (5). Alguns pontos fortes e fracos das diferentes ELISAs aqui descritas são:

ELISA Pontos fortes Fraquezas
Indireto 1) Alta sensibilidade devido ao fato de que múltiplos anticorpos secundários conjugados por enzimas podem se ligar ao anticorpo primário 1) O sinal de fundo alto pode ocorrer porque o revestimento do antígeno de interesse da placa não é específico (ou seja, todas as proteínas da amostra revestirão a placa)
2) Muitos anticorpos primários diferentes podem ser reconhecidos por um único anticorpo secundário conjugado por enzimas, dando ao usuário a flexibilidade de usar o mesmo anticorpo secundário conjugado por enzimas em muitos DIFERENTES ELISA (independentemente do antígeno ser detectado)
3) Melhor escolha quando apenas um único anticorpo para o antígeno de interesse está disponível
Sanduíche 1) O uso de anticorpo monoclonal de captura e detecção específico de antígeno aumenta a sensibilidade e a especificidade do ensaio (em comparação com a ELISA indireta) 1) Otimizar as concentrações dos anticorpos monoclonais de captura e detecção pode ser difícil (especialmente para kits não comerciais)
2) Melhor escolha para detectar uma proteína grande com vários epítopos (como uma citocina)
Competitivo 1) Podem ser utilizadas amostras impuras 1) Requer uma grande quantidade de antígeno altamente puro para ser usado para cobrir a placa
2) Menor sensibilidade aos efeitos de diluição do reagente
3) Ideal para detectar pequenas moléculas (como um hapten)

Tabela 3: Resumo. Um resumo dos pontos fortes e fracos das diferentes técnicas ELISA.

Embora seja uma técnica simples e útil, há também algumas desvantagens para qualquer ELISA. Uma delas é a incerteza da quantidade de proteína de interesse nas amostras de teste. Se a quantidade for muito alta ou muito baixa, os valores de absorção obtidos pelo leitor de microplaca podem cair acima ou abaixo dos limites da curva padrão, respectivamente. Isso dificultará a determinação precisa da quantidade de proteína presente nas amostras de teste. Se os valores forem muito altos, a amostra de ensaio pode ser diluída antes de adicionar aos poços da placa. Os valores finais precisariam então ser ajustados de acordo com o fator de diluição. Como mencionado, os kits caseiros muitas vezes requerem uma otimização cuidadosa das concentrações de anticorpos usadas para produzir uma alta relação sinal-ruído.

References

  1. Porstmann, T. and Kiessig S.T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  2. Suleyman Aydin. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides, 72, 4-15 (2015).
  3. Gan. S. D. and Patel K. R. Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Investigative Dermatology, 133 (9), 1-3 (2013).
  4. Kohl, T. O. and Ascoli C.A. Immunometric Antibody Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Cold Spring Harbor Protocols, 1 (6), (2017).
  5. Sakamoto, S., Putalun, W., Vimolmangkang, S., Phoolcharoen, W., Shoyama, Y., Tanaka, H., and Morimoto S. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of natural medicines, 72 (1), 32-42 (2018).

Transcript

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