ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

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00:01Concepts
03:09Indirect ELISA
06:49Sandwich ELISA
09:17Competitive ELISA
11:44Results

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Ensaios ELISA: Indireto, Sanduíche e Competitivo

English

Overview

Fonte: Whitney Swanson^1,2, Frances V. Sjaastad^2,3, e Thomas S. Griffith^1,2,3,4
¹ Departamento de Urologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
² Centro de Imunologia, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
³ Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Imunologia e Biologia do Câncer, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
⁴ Centro de Câncer Maçônico, Universidade de Minnesota, Minneapolis, MN 55455

O ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA) é frequentemente usado para medir a presença e/ou concentração de um antígeno, anticorpo, peptídeo, proteína, hormônio ou outra biomolécula em uma amostra biológica. É extremamente sensível, capaz de detectar baixas concentrações de antígeno. A sensibilidade da ELISA é atribuída à sua capacidade de detectar as interações entre um único complexo de anticorpos de antígeno (1). Além disso, a inclusão de um anticorpo específico de antígeno conjugado por enzimas permite a conversão de um substrato incolor em um produto cromogênico ou fluorescente que pode ser detectado e facilmente quantitado por um leitor de placas. Quando comparada aos valores gerados por quantidades tituladas de um antígeno conhecido de interesse, a concentração do mesmo antígeno nas amostras experimentais pode ser determinada. Diferentes protocolos ELISA foram adaptados para medir concentrações de antígenos em uma variedade de amostras experimentais, mas todos eles têm o mesmo conceito básico (2). A escolha do tipo de ELISA para realizar, indireta, sanduíche ou competitiva, depende de uma série de fatores, incluindo a complexidade das amostras a serem testadas e os anticorpos específicos do antígeno disponíveis para uso. A ELISA indireta é frequentemente utilizada para determinar o resultado de uma resposta imunológica, como medir a concentração de um anticorpo em uma amostra. O sanduíche ELISA é mais adequado para analisar amostras complexas, como supernascedores de cultura tecidual ou lises de tecido, onde o analito, ou antígeno de interesse, faz parte de uma amostra mista. Finalmente, o ELISA competitivo é mais frequentemente utilizado quando há apenas um anticorpo disponível para detectar o antígeno de interesse. EliSAs competitivas também são úteis para detectar um pequeno antígeno com apenas um único epítope de anticorpos que não pode acomodar dois anticorpos diferentes devido à dificultação estérica. O protocolo descreverá os procedimentos básicos para os ensaios ELISA indiretos, sanduíches e competitivos.

O ensaio ELISA indireto é comumente usado para medir a quantidade de anticorpos no soro ou no sobrenatante de uma cultura hibrida. O procedimento geral para o ensaio ELISA indireto é:

Reveste poços com antígenos
Adicionar supernanato da cultura sérico ou hibridoma contendo anticorpos (anticorpo primário ou 1°)
Incubar e lavar
Adicionar anticorpo secundário (ou 2°) conjugado por enzimas
Incubar e lavar
Adicionar substrato

O ensaio ELISA sanduíche difere do ensaio elisa indireto na medida em que o método não envolve revestir as placas com um antígeno purificado. Em vez disso, um anticorpo “captura” é usado para revestir os poços da placa. O antígeno é “sanduíche” entre o anticorpo de captura e um segundo anticorpo conjugado por enzimas de “detecção” – onde ambos os anticorpos são específicos para o mesmo antígeno, mas em epítopos diferentes (3). Ao vincular-se ao complexo de anticorpos/antígenos de captura, o anticorpo de detecção permanece na placa. Anticorpos monoclonais ou antisera policlonal podem ser usados como anticorpos de captura e detecção. A principal vantagem do sanduíche ELISA é que a amostra não precisa ser purificada antes da análise. Além disso, o ensaio pode ser bastante sensível (4). Muitos kits ELISA disponíveis comercialmente são da variedade de sanduíches e usam pares de anticorpos testados e combinados. O procedimento geral para o ensaio elisa sanduíche é:

Poços de revestimento com anticorpo de captura
Adicione amostras de teste contendo antígeno
Incubar e lavar
Adicione anticorpo de detecção conjugado por enzimas.
Incubar e lavar
Adicionar substrato

A maioria dos kits ELISA de sanduíche disponíveis comercialmente vêm com anticorpos de detecção conjugados por enzimas. Nos casos em que um anticorpo de detecção conjugado por enzimas não esteja disponível, um anticorpo coordenado por enzimas secundárias específico para o anticorpo de detecção pode ser usado. A enzima no anticorpo secundário desempenha o mesmo papel, que é converter o substrato incolor em um produto cromogênico ou fluorescente. O anticorpo secundário já mencionado conjugado por enzimas gostaria mais de ser usado em um sanduíche “caseiro” ELISA desenvolvido por um investigador que gerou seus próprios anticorpos monoclonais, por exemplo. Uma desvantagem ao uso de um anticorpo coordenado por enzimas secundárias é ter certeza de que ele se liga apenas ao anticorpo de detecção, e não ao anticorpo de captura ligado à placa. Isso resultaria em um produto mensurável em todos os poços, independentemente da presença ou ausência de antígeno ou anticorpo de detecção.

Finalmente, o ensaio ELISA competitivo é usado para detectar antígenos solúveis. É simples de executar, mas só é adequado quando o antígeno purificado está disponível em uma quantidade relativamente grande. O procedimento geral para o ensaio ELISA competitivo é:

Poços de casaco com antígeno
Incubar e lavar
Amostra de teste pré-incobarto com anticorpos primários conjugados por enzimas
Adicione a mistura para bem
Incubar e lavar qualquer anticorpo primário conjugado por enzimas não ligado
Adicionar substrato

A “competição” neste ensaio vem do fato de que mais antígeno na amostra de ensaio usada na etapa 3 resultará em menos anticorpo disponível para se ligar ao revestimento de antígeno do poço. Assim, a intensidade do produto cromogênico/fluorogênico no poço no final do ensaio está inversamente relacionada à quantidade de antígeno presente na amostra de ensaio.

Um componente-chave em qualquer tipo de ELISA são os padrões titulados de concentrações conhecidas que permitirão ao usuário determinar a concentração de antígeno presente nas amostras de teste. Normalmente, uma série de poços são designados para criar uma curva padrão, onde quantidades conhecidas de uma proteína recombinante purificada são adicionadas aos poços em quantidades decrescentes. Quando esses poços são processados ao mesmo tempo que as amostras de teste, o usuário pode então ter um conjunto de referência de valores de absorção obtidos de um leitor de microplato para concentrações de proteínas conhecidas para acompanhar os valores de absorção para as amostras de teste. O usuário pode então calcular uma curva padrão à qual as amostras de teste podem ser comparadas para determinar a quantidade de proteína de interesse presente. A curva padrão também pode determinar o grau de precisão da produção de diluição do usuário.

Finalmente, a última etapa em cada um dos tipos ELISA listados acima exige a adição de um substrato. O grau de conversão do substrato ao produto está diretamente relacionado com a quantidade de enzima presente no poço. Peroxidase de rabanete (HRP) e fosfatismo alcalino (AP) são as enzimas mais comuns encontradas conjugadas a anticorpos. Como esperado, há uma série de substratos disponíveis específicos para enzimas que produzem um produto cromogênico ou fluorescente. Além disso, substratos estão disponíveis em uma gama de sensibilidades que podem aumentar a sensibilidade geral do ensaio. O usuário também deve levar em consideração o tipo de instrumentação disponível para a leitura da placa no final do experimento ao escolher o tipo de substrato a ser usado, juntamente com seu anticorpo correspondente enzimático conjugado.

Substratos cromogênicos comumente usados para HRP incluem 2,2′-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) e 3,3′,5,5′-tetrameethylbenzidina (TMB), enquanto p-Nitrofenil Phosphate (PNPP) é usado para AP. ABTS e TMB produzem produtos de reação verde e azul solúveis em água, respectivamente. O produto ABTS verde tem dois picos principais de absorção, 410 e 650 nm, enquanto o produto Azul TMB é melhor detectado em 370 e 652 nm. As cores de ABTS e TMB mudam para amarelo após a adição de uma solução de parada ácida, que é melhor lida em 450 nm. O desenvolvimento de cores para ABTS é lento, enquanto é rápido para TMB. O TMB é mais sensível que o ABTS, e pode produzir um sinal de fundo mais alto se a reação enzimática continuar por muito tempo. A PNPP produz um produto amarelo solúvel em água após a conversão de AP que absorve a luz a 405 nm.

Procedure

1. Elisa indireta Um ELISA indireto é aquele em que o anticorpo primário específico do antígeno é reconhecido por um anticorpo conjugado secundário. O protocolo a seguir é um exemplo de um método ELISA indireto, onde as amostras de soro de camundongos infectados pelo vírus influenza A (IAV) são testadas para a presença de anticorpo IgG específico do IAV. Uma força deste exemplo é que diferentes anticorpos secundários podem ser usados que reconhecem todos os isótipos de anticorpos ou isótipos específicos (por exemplo, IgG). Revestimento de antígeno para a microplacão Cubra os poços de uma placa ELISA de 96 poços com antígeno purificado por tubos de 50 μL de antígeno purificado (2 mg/mL de vírus purificado A/PR/8 Influenza A em 0,05M Tampão Tris-HCl (pH 9,5)) em cada poço da placa. Cubra a placa com uma tampa adesiva e incuba-a durante a noite a 4°C para permitir que o antígeno se ligue à placa. Após a conclusão da incubação, remova a solução de revestimento, jogando a placa sobre uma pia. Bloqueio Bloqueie os locais de ligação de proteína restantes nos poços revestidos adicionando 200 μL de tampão de bloqueio, 5% de soro de burro em 1X PBS é usado aqui, por poço. Os reagentes de bloqueio alternativos incluem 5% de leite seco não gordo ou BSA em PBS ou soro normal de um animal no qual o anticorpo secundário foi gerado. Incubar por pelo menos 2 horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C. Após a incubação, remova o tampão de bloqueio apertando a placa e, em seguida, lave a placa com PBS contendo 1% de Interpol-20. Incubação com o anticorpo primário Prepare uma diluição serial da amostra de soro, que contém o anticorpo primário, para obter uma faixa de diluição de 1 a 204.800, utilizando 1X PBS. Para isso, primeiro dilua o soro 1:12.5 e depois realize uma diluição de 4X (faixa de diluição – 1:12.5 a 1:204.800). Adicione 100 μL das amostras de soro diluídas em série aos poços. Cubra a placa com tampa adesiva e incubar à temperatura ambiente por 1-2 h. Após a incubação, passe a placa sobre uma pia e lave a placa com PBS contendo 1% de Interpol-20. Incubação com o anticorpo secundário Adicione 100 μL de um anticorpo secundário conjugado por enzimas, peroxidase de rabanete, anti-rato de burro conjugado hrp neste experimento, para cada poço. Incubar a placa por 1 hora em temperatura ambiente. Após a incubação, passe a placa sobre uma pia e depois lave a placa com PBS contendo 1% de Interpol-20. Detecção Adicione 100 μL do substrato indicador (3,3′,5,5′-tetramebenzidina (TMB)) a uma concentração de 1 mg/mL para cada poço. Incubar a placa com o substrato por 5-10 min em temperatura ambiente. Após 10 min, pare a reação enzimática adicionando 100 μL 2N ácido sulfúrico (H2SO4).Dentro de 30 minutos de adicionar a solução stop, leia a placa usando um leitor de microplacas a 405 nm para determinar a absorvância dos poços. 2. Sanduíche ELISA Nesta versão ELISA, a amostra experimental é “sanduíche” entre um anticorpo de captura não conjugado e um anticorpo de detecção conjugado, ambos específicos para a mesma proteína, mas em epítopos diferentes. No exemplo elisa sanduíche a seguir, a concentração de TNFα humano foi determinada em amostra desconhecida usando uma curva padrão gerada a partir da diluição serial de 2,5X de um TNFα humano padrão e recombinante conhecido (indicando na concentração de 75 pg/mL). Revestimento captura anticorpo para a microplacão Cubra os poços de uma placa ELISA de 96 poços com anticorpo de captura purificado adicionando 100 μL de anticorpo de captura (1-10 μg/mL de alcance) a cada poço da placa. Cubra a placa com uma tampa de placa adesiva e incuba-a durante a noite a 4°C. Após a incubação, remova a solução de revestimento da placa, jogando a placa sobre uma pia. Bloqueio Bloqueie os locais de ligação de proteína restantes nos poços revestidos de anticorpos adicionando 200 μL de solução de bloqueio, 5% de leite seco sem gordura contendo PBS, aos poços. Incubar por pelo menos 2 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C. Após a incubação, remova o tampão de bloqueio apertando a placa e, em seguida, lave a placa com PBS contendo 1% de Interpol-20. Adicionar amostras de teste contendo antígenos Adicione 100 μL da amostra de ensaio aos poços. Sele a placa com uma tampa adesiva. Incubar por 1-2 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C. Após a incubação, remova as amostras movendo a placa sobre a pia e, em seguida, lave os poços com 200 μL 1X PBS contendo 1% de Interpol-20. Adicionar anticorpo de detecção conjugado por enzimas Adicione 100 μL de anticorpo de detecção conjugado com enzimas aos poços em uma concentração pré-otimizada. Sele a placa com uma tampa adesiva e incubar em temperatura ambiente por 2h. Remova o anticorpo de detecção sem saída, movendo a placa sobre uma pia e lave os poços com 200 μL 1X PBS contendo 1% de Interpol-20. Detecção Adicione 100 μL do substrato indicador a uma concentração de 1 mg/mL. Qualquer anticorpo de detecção conjugado por enzimas ligadas converterá o substrato em um sinal detectável. Incubar a placa por 5-10 min em temperatura ambiente. Após 5-10 min, pare a reação enzimática adicionando 100 μL 2N H2SO4 aos poços. Dentro de 30 minutos de adicionar a solução stop, leia a placa usando um leitor de microplacão para determinar a absorção dos poços. 3. ELISA competitiva As etapas de um ELISA competitivo são diferentes das utilizadas em ELISA indireta e sanduíche, sendo a principal diferença a etapa de vinculação competitiva entre o antígeno amostral e o antígeno “add-in”. O antígeno amostra é incubado com o anticorpo primário não rotulado. Estes complexos anticorpos-antígenos são então adicionados à placa ELISA, que foi pré-revestida com o mesmo antígeno. Após um período de incubação, qualquer anticorpo desvinculado é lavado. Há uma correlação inversa entre a quantidade de anticorpos livres disponíveis para ligar o antígeno no poço e a quantidade de antígeno na amostra original. Por exemplo, uma amostra com antígeno abundante teria mais complexos de anticorpos primários de antígeno, deixando pouco anticorpo desvinculado para se ligar à placa ELISA. Um anticorpo secundário conjugado por enzimas específico para o anticorpo primário é então adicionado aos poços, seguido pelo substrato. Revestimento de antígeno para a microplacão Cubra os poços de uma placa ELISA de 96 poços com 100 μL de antígeno purificado a uma concentração de 1-10 μg/mL. Cubra a placa com uma tampa de placa adesiva e incubar a placa durante a noite a 4°C. Após a incubação, remova a solução de antígeno desvinculada dos poços, sacudindo a placa sobre uma pia. Bloqueio Bloqueie os locais de ligação de proteína restantes nos poços revestidos adicionando 200 μL de tampão de bloqueio a cada poço, que pode ser 5% de leite seco não gordo ou BSA em PBS. Incubar a placa por pelo menos 2 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C. Amostra de incubação (antígeno) com o anticorpo primário Ao bloquear os poços, prepare a mistura de anticorpos de antígeno misturando antígeno de amostra de 150 μL e 150 μL de anticorpo primário para cada poço no ensaio. Incubar esta mistura por 1h a 37°C. Adicione mistura de anticorpos de antígeno ao poço Agora, remova o tampão de bloqueio dos poços, jogando a placa sobre uma pia. Em seguida, lave os poços com 1X PBS contendo Interpol-20. Adicione 100 μL da mistura de anticorpos antígenos-primários. Incubar a placa a 37°C por 1h. Remova a mistura de amostra, movendo a placa sobre uma pia. Em seguida, lave os poços com 1X PBS contendo 1% de Interpol-20 para remover qualquer anticorpo desvinculado. Adicione o anticorpo secundário Adicione 100 μL de um anticorpo secundário conjugado enzimático, que neste caso é anticorpo conjugado ap, a cada poço. Incubar a placa por 1h a 37°C. Após a incubação, lave a placa com 1X PBS contendo 1% de Interpol-20. Detecção Adicione 100 μL da solução do substrato a cada poço. Espere 5-10 min. Após 10 minutos, pare a reação enzimática adicionando 100 μL 2N de ácido sulfúrico aos poços. Em seguida, meça a absorvância em um leitor de microplacão dentro de 30 minutos de adicionar a solução stop

Results

In the following example of an indirect ELISA, the presence of influenza A virus (IAV)-specific IgG in the serum of IAV-infected mice was determined. C57Bl/6 mice were infected with influenza A virus (A/PR/8; 10⁵ PFU in 100 µL PBS i.p.) and serum was collected 28 days later. To quantitate the amount of IAV-specific IgG in the serum, 96-well ELISA plates were coated with purified A/PR/8 Influenza A virus (50 µL/well of 2 mg/ml PBS virus) overnight at 4°C. Coated plates were blocked for 1 hour at room temperature with 5% normal donkey serum in PBS, followed by incubation with diluted serum samples from IAV-challenged mice overnight at 4°C. The serum was initially diluted 1:12.5, followed by 1:4 dilutions (dilution range – 1:12.5 to 1:204,800). After washing, plates were incubated with an alkaline phosphatase (AP)-conjugated donkey anti-mouse IgG for 1 h. The plates were washed, and then p-Nitrophenyl Phosphate (PNPP; 1 mg/mL, 100 µL/well) was added. The colorless PNPP solution turns to a yellow color when AP is present. After 5-10 min, the enzymatic reaction was stopped by adding 100 µL/well 2N H₂SO₄. The plate was read on a microplate reader at 405 nm. The results obtained are shown in Table 1 and Figure 1.

Sample	Wells	OD₄₀₅	Mean
Serum 1:12.5	A1	2.163	2.194
	B1	2.214
	C1	2.204
Serum 1:50	A1	1.712	1.894
	B1	2.345
	C1	1.624
Serum 1:200	A1	1.437	1.541
	B1	1.73
	C1	1.456
Serum 1:800	A1	1.036	0.957
	B1	0.912
	C1	0.923
Serum 1:3200	A1	0.579	0.48
	B1	0.431
	C1	0.429
Serum 1:12800	A1	0.296	0.281
	B1	0.312
	C1	0.236
Serum 1:51200	A1	0.308	0.283
	B1	0.299
	C1	0.243
Serum 1:204800	A1	0.315	0.303
	B1	0.298
	C1	0.297

Table 1: Indirect ELISA assay data. Serum dilutions (from 1:12.5 to 1:204,800), of influenza A virus (IAV)-infected mice containing IAV-specific IgG, optical density (OD) (405 nm) values and mean OD₄₀₅ values.

Figure 1: Indirect ELISA assay scatter plot of mean OD₄₀₅ values(+ S. D.) and serum dilutions (from 1:12.5 to 1:204,800), of influenza A virus (IAV)-specific IgG in the serum of IAV-infected mice. The OD₄₀₅ values can be inversely correlated to the serum dilutions.

In the following example of a sandwich ELISA, a 1:2.5 dilution of recombinant human TNFα standards (starting at a concentration of 75 pg/mL) was added to the indicated wells of a 96-well flat-bottom plate. These standards led to a corresponding 2.5-fold change in the absorbance readings.

Sample	Concentration (pg/mL)	Wells	Values	Mean Value	Back Concentration Calculation	Average
Standard 1	75	A1	1.187	1.169	76.376	75.01
		A2	1.152		73.644
Standard 2	30	B1	0.534	0.52	30.827	29.962
		B2	0.506		29.098
Standard 3	12	C1	0.23	0.217	12.838	12.105
		C2	0.204		11.372
Standard 4	4.8	D1	0.09	0.084	5.055	4.726
		D2	0.078		4.398
Standard 5	1.92	E1	0.033	0.031	1.941	1.86
		E2	0.03		1.778
Standard 6	0.768	F1	0.009	0.011	0.626	0.764
		F2	0.014		0.901
Standard 7	0.307	G1	0.002	0.004	0.238	0.377
		G2	0.007		0.516

Table 2: TNFα Sandwich ELISA standard curve data. A 1:2.5 dilution of recombinant human TNFα standards (75 to 0.3 pg/mL), OD (450 nm) values, mean OD₄₅₀ values, back concentration calculations and their averages.

Figure 2: Standard Curve for TNFα sandwich ELISA. A 1:2.5 dilution of recombinant human TNFα standards (75 to 0.3 pg/mL) was analyzed using sandwich ELISA.The OD₄₅₀ values can be directly correlated to the standard dilution concentrations. The amount of TNFα protein in the test sample was determined using the standard curve, which corresponds to a concentration of 38.72 pg/mL.

Once the standard curve was generated, the amount of TNFα protein in the test sample was determined. In this sandwich ELISA example, the test samples gave OD₄₅₀ readings of 0.636 and 0.681, which give an average of 0.6585. When plotting this OD450 reading on the above chart, this corresponds to a TNFα concentration of 38.72 pg/ml.

Applications and Summary

As demonstrated, a range of immunoassays (with slight variation in protocols) fall within the ELISA technique family. Determining which version of ELISA to use depends on a number of factors, including what antigen is being detected, the monoclonal antibody available for a particular antigen, and the desired sensitivity of the assay (5). Some strengths and weaknesses of the different ELISAs described herein are:

ELISA	Strengths	Weaknesses
Indirect	1) High sensitivity due to the fact that multiple enzyme-conjugated secondary antibodies can bind to the primary antibody	1) High background signal may occur because the coating of the antigen of interest to the plate is not specific (i.e., all proteins in the sample will coat the plate)
	2) Many different primary antibodies can be recognized by a single enzyme-conjugated secondary antibody giving the user the flexibility of using the same enzyme-conjugated secondary antibody in many different ELISA (regardless of the antigen being detected)
	3) Best choice when only a single antibody for the antigen of interest is available
Sandwich	1) The use of antigen-specific capture and detection monoclonal antibody increases the sensitivity and specificity of the assay (compared to the indirect ELISA)	1) Optimizing the concentrations of the capture and detection monoclonal antibodies can be difficult (especially for non-commercial kits)
	2) Best choice for detecting a large protein with multiple epitopes (such as a cytokine)
Competitive	1) Impure samples can be used	1) Requires a large amount of highly pure antigen to be used to coat plate
	2) Less sensitivity to reagent dilution effects
	3) Ideal for detecting small molecules (such as a hapten)

Table 3: Summary. A summary of the strengths and weaknesses of the different ELISA techniques.

While a simple and useful technique, there are also some drawbacks to any ELISA. One is the uncertainty of the amount of the protein of interest in the test samples. If the amount is too high or too low, the absorbance values obtained by the microplate reader may fall above or below the limits of the standard curve, respectively. This will make it difficult to accurately determine the amount of protein present in the test samples. If the values are too high, the test sample can be diluted prior to adding to the wells of the plate. The final values would then need to be adjusted according to the dilution factor. As mentioned, homemade kits often require careful optimization of the antibody concentrations used to yield a high signal-to-noise ratio.

References

Porstmann, T. and Kiessig S.T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
Suleyman Aydin. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides, 72, 4-15 (2015).
Gan. S. D. and Patel K. R. Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Investigative Dermatology, 133 (9), 1-3 (2013).
Kohl, T. O. and Ascoli C.A. Immunometric Antibody Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Cold Spring Harbor Protocols, 1 (6), (2017).
Sakamoto, S., Putalun, W., Vimolmangkang, S., Phoolcharoen, W., Shoyama, Y., Tanaka, H., and Morimoto S. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of natural medicines, 72 (1), 32-42 (2018).

Transcript

Enzyme-linked Immunosorbent Assay, or ELISA is a highly sensitive quantitative assay commonly used to measure the concentration of an analyte like cytokines and antibodies in a biological sample. The general principle of this assay involves three steps: starting with capture, or immobilization, of the target analyte on a micro plate, followed by the detection of the analyte by target-specific detection proteins, and lastly, enzyme reaction, where a conjugated enzyme converts its substrate to a colored product. Based on different methods of capture and detection, ELISA can be of four types: direct, indirect, sandwich, and competitive.

For direct ELISA, the target antigen is first bound to the plate, and is then detected by a specific detection antibody. This method is commonly used for screening antibodies for a specific antigen. Indirect ELISA is used for detecting antibodies in a sample in order to quantify immune responses. The plate is first coated with a specific capture antigen, which immobilizes the target antibody, and this antigen-antibody complex is then detected using a second antibody.

In the case of sandwich ELISA, the target analyte is an antigen, which is captured on the plate using a capture antibody and then detected by the detection antibody, hence forming an antibody-antigen-antibody sandwich. This method is useful for measuring the concentration of an antigen in a mixed sample.

Competitive ELISA is used when only one antibody is available for a target antigen of interest. The plate is first coated with the purified antigen. Meanwhile, the sample containing the antigen is pre-incubated with the antibody and then added to the plate, to allow any free antibody molecules to bind to the immobilized antigen. The higher the signal from the plate, the lower the antigen concentration in the sample. In all of the four types of ELISA, direct, indirect, sandwich, and competitive, the detection antibody is either directly conjugated to the enzyme or can be indirectly linked to it through another antibody or protein.

The enzymes commonly used for the reaction are horseradish peroxidase or alkaline phosphatase with their respective substrates, both producing a soluble, colored product that can be measured and quantified using a plate reader. In this video, you will observe how to perform indirect ELISA, sandwich ELISA, and competitive ELISA, followed by examples of quantification of the target analyte from the indirect and sandwich ELISA methods.

The first experiment will demonstrate how to use indirect ELISA to determine the presence of anti-influenza virus antibodies in serum obtained from influenza-infected mice.

To begin, add 50 microliters of purified antigen – in this case, 2 milligrams per milliliter of purified A/PR/8 Influenza A virus- to each well of a 96-well ELISA plate. Next, cover the plate with an adhesive cover and incubate it overnight at 4 degrees celsius to allow the antigen to bind to the plate. The following day, remove the coating solution by flicking the plate over a sink. Next, block the remaining protein-binding sites in the coated wells by adding 200 microliters of a blocking buffer- here, 5% donkey serum in 1X PBS- to each well. Leave the plate to incubate for at least 2 hours at room temperature. Following the incubation, remove the blocking buffer and then wash the plate by adding 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Flick the plate over the sink once more to remove the wash.

Then, prepare the test samples by adding 460 microliters of PBS to a fresh tube, and then adding 40 microliters of serum to make a 1 to 12.5 dilution. Then, add 300 microliters of PBS to a second tube, and then add 100 microliters of the first dilution. Continue this serial dilution range until obtaining a final sample with a dilution of 1 to 204,800. Add the serially diluted serum samples in triplicate to the wells. Cover the plate with an adhesive cover and incubate at room temperature for an hour. Next, remove the samples by flicking the plate into the sink and then wash the plate by adding 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Once again, flick the plate to remove the wash.

Now, add 100 microliters of an enzyme-conjugated secondary antibody, which in this experiment is a horseradish peroxidase, or HRP, conjugated donkey anti-mouse secondary, to each well. Incubate the plate for one hour at room temperature, and flick the plate to remove any excess liquid. Wash the plate with 1X PBS containing 1% Tween-20 and then apply 100 microliters of the indicator substrate at a concentration of one milligram per milliliter to each well. Incubate the plate with the substrate for 5 to 10 minutes at room temperature. In this example, the colorless 3,3′, 5,5′ – tetramethylbenzidine, or TMB, substrate turns a blue color when HRP is present. After 10 minutes, stop the enzymatic reaction by adding 100 microliters of 2N sulfuric acid. The samples will turn a yellow color.

Within 30 minutes of adding the stop solution, insert the plate into a microplate reader and read the plate at the appropriate wavelength for the substrate to determine the absorbance of the wells.

To begin the sandwich ELISA, the plate must be coated with purified capture antibody. To do this, add 100 microliters of the capture antibody at a concentration within the 1-10 microgram per milliliter range, to each well of a 96-well ELISA plate. Next, cover the plate with an adhesive plate cover and then incubate the plate overnight at 4 degrees celsius. After the incubation, remove the coating solution by flicking the plate over a sink.

Now, block the remaining protein- binding sites in the coated wells by adding 200 microliters of 5% nonfat dry milk to the wells. Incubate the plate at room temperature for at least 2 hours. Next, remove the blocking buffer, and then wash the wells with 1X PBS containing 1% Tween-20. Remove the wash by flicking the plate over the sink. Now, add 100 microliters of the test sample to the wells, seal the plate with an adhesive cover, and then incubate it at room temperature for 2 hours. After incubation, remove the samples by flicking the plate over the sink and then wash the wells with 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Flick the plate over the sink to remove the wash and then add 100 microliters of enzyme-conjugated detection antibody to the wells.

Seal the plate with an adhesive cover. Leave the plate to incubate at room temperature for 2 hours. After the incubation, remove the unbound detection antibody by flicking the plate over a sink and wash the wells with 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Next, add 100 microliters of the indicator substrate at a concentration of 1 milligram per milliliter, and incubate the plate for 5 to 10 minutes at room temperature. After 10 minutes, stop the enzymatic reaction by adding 100 microliters of 2N sulfuric acid to the wells and then read the plate within 30 minutes of adding the stop solution in a microplate reader.

To perform a competitive ELISA, first coat the wells of a 96-well ELISA plate with 100 microliters of purified antigen at a concentration of 1-10 micrograms per milliliter. Cover the plate with an adhesive plate cover and then incubate overnight at 4 degrees celsius. Following this, remove the unbound antigen solution from the wells by flicking the plate over a sink.

Next, block the remaining protein-binding sites in the coated wells by adding 200 microliters of blocking buffer to each well- here, 5% nonfat dry milk in PBS. Incubate the plate for at least 2 hours at room temperature. While blocking the wells, prepare the antigen-antibody mixture in a 1. 5 milliliter tube by adding 150 microliters of sample antigen to 150 microliters of primary antibody for each well in the assay. Incubate this mixture for 1 hour at 37 degrees celsius. Now, remove the blocking buffer from the wells by flicking the plate over a sink. Then, wash the wells with 1X PBS containing Tween 20 and then add 100 microliters of the sample antigen- primary antibody mixture.

Leave the plate to incubate at 37 degrees celsius for one hour. Next, remove the sample mixture by flicking the plate over a sink and then wash the wells with 1X PBS containing 1% Tween-20 to remove any unbound antibody. Add 100 microliters of an enzyme-conjugated secondary antibody to each well and incubate the plate for one hour at 37 degrees celsius. Following this, wash the plate with 1X PBS containing 1% Tween-20 and then add 100 microliters of the substrate solution to each well. Wait for 5-10 minutes. After 10 minutes, stop the enzymatic reaction by adding 100 microliters of 2N sulfuric acid and then measure the absorbance in a microplate reader within 30 minutes of adding the stop solution.

For the semi-quantitative indirect ELISA assay, the presence of influenza A virus antibodies in serially diluted samples of serum from influenza A- infected mice was determined by reading the absorbance of each well at 405 nanometers in a plate reader. This raw data is exported to a spread sheet for calculation purposes. In this experiment, the serially diluted serum samples, which range from 1 – 12.5, to 1 – 204,800, were repeated in triplicate.

To analyze the data, the mean absorbance value is therefore calculated for each set of triplicates by adding all the values for each dilution and dividing the sum by 3. Once the mean for each set of triplicates is determined, the mean OD450 readings are plotted against the serial dilutions. The OD readings decrease as the serum is diluted, indicating that less antibodies are found in the more diluted samples. In the quantitative sandwich ELISA, dilutions of known standard, in this case recombinate Human TNFalpha, were added to a 96-well plate and read along with the unknown samples.

To create the standard curve, the mean absorbance value for each set of readings of the known concentrations was calculated. Then, the mean absorbance value was plotted on the y-axis, against the known protein concentrations on the x-axis. A best fit curve is added through the points in the graph.

Once the standard curve is generated, the amount of TNFalpha protein in the test sample can be determined by first calculating the mean absorbance value for the test sample. In this example, the test samples gave OD450 readings of 0.636 and 0. 681. Adding these values and dividing the sum by 2 gives an average of 0.659. From the y-axis on the standard curve graph, extend a horizontal line from this absorbance value to the standard curve. At the point of intersection, extend a vertical line to the x-axis and read the corresponding concentration which, in this test sample, corresponds to a TNFalpha concentration of 38.72 picograms per milliliter.

Cite This

JoVE Science Education Database. JoVE Science Education. ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive. JoVE, Cambridge, MA, (2023).