ELISA 분석: 간접, 샌드위치 및 길항

1. 간접 ELISA

간접ELISA는 1차 항원 특이적 항체가 이차 공주 항체에 의해 인식되는 곳이다. 다음 프로토콜은 인플루엔자 A 바이러스(IAV)-감염된 마우스의 혈청 샘플이 IAV 특이적 IgG 항체의 존재를 위해 시험되는 간접 ELISA 방법의 예입니다. 이 예의 한 가지 강점은 다른 이차 항체가 모든 항체 등색형 또는 특정 등색형(예를 들어, IgG)을 인식하는 데 사용될 수 있다는 것이다.

마이크로 플레이트에 항원을 코팅

1. 정제된 항원의 50 μL(정제된 A/PR/8 인플루엔자 A 바이러스의 2 mg/mL)을 각 플레이트의 각 웰에 코팅하여 정제된 항원을 가진 96웰 ELISA 플레이트의 웰을 코팅한다.
2. 접착제 덮개로 접시를 덮고 4°C에서 하룻밤 동안 배양하여 항원이 접시에 결합할 수 있도록 합니다.
3. 잠복이 완료되면 플레이트를 싱크대 위로 쓸어 넘으로써 코팅 용액을 제거합니다.

블로킹

4. 코팅된 우물에서 남은 단백질 결합 부위를 200 μL 차단 버퍼를 추가하여, 1X PBS에 당나귀 혈청이 5% 잘 사용된다. 대체 차단 시약은 PBS에서 5% 비지방 건조 우유 또는 BSA 또는 이차 항체가 생성된 동물로부터의 정상 혈청을 포함한다.
5. 실온에서 최소 2시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
6. 인큐베이션에 이어, 플레이트를 가볍게 하여 블로킹 버퍼를 제거한 다음 1% Tween-20을 함유한 PBS로 플레이트를 세척합니다.

1차 항체를 가진 배양

7. 1X PBS를 사용하여 1-204,800의 희석 범위를 얻기 위해 1차 항체를 포함하는 혈청 시료의 직렬 희석을 준비한다. 이렇게 하려면 먼저 혈청을 1:12.5로 희석한 다음 4X 희석(희석 범위 - 1:12.5 ~ 1:204,800)을 수행합니다.
8. 연재된 혈청 샘플 100μL을 우물에 넣습니다.
9. 접착제 커버로 플레이트를 덮고 실온에서 1-2 시간 동안 배양하십시오.
10. 인큐베이션에 이어 플레이트를 싱크대 위로 쓸어넘기고 1% Tween-20을 함유한 PBS로 플레이트를 세척합니다.

이차 항체를 가진 배양

11. 이 실험에서 효소-컨쥬게이드 이차 항체, 고추냉이 과옥시다제, HRP-컨쥬게이드 당나귀 항마우스 보조의 100 μL을 각 웰에 추가합니다.
12. 상온에서 1 시간 동안 접시를 배양하십시오.
13. 인큐베이션후, 접시를 싱크대 위로 쓸어 넘은 다음 1% Tween-20을 함유한 PBS로 플레이트를 세척합니다.

탐지

14. 각 우물에 1 mg/mL의 농도로 표시기 기판(3,3',5,5't'-테트라메틸벤지딘(TMB)의 100 μL을 추가합니다.
15. 상온에서 5-10 분 동안 기판으로 접시를 배양하십시오.
16. 10 분 후, 100 μL 2N 황산 (H₂SO_4)를추가하여 효소 반응을 중지하십시오.
    정지 용액을 추가한 지 30분 이내에 405nm의 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 플레이트를 읽고 우물의 흡광도를 결정합니다.

2. 샌드위치 엘리사

본 ELISA 버전에서, 실험용 샘플은 공주포항체와 공주 검출 항체 사이에 "끼여", 둘 다 동일한 단백질에 특이적이지만 상이한 에피토프에 특이적이다. 다음 샌드위치 ELISA 예에서, 인간 TNFα의 농도는 공지된 표준, 재조합 인간 TNFα(75 pg/mL의 농도에서 진술)의 2.5X 직렬 희석으로부터 생성된 표준 곡선을 사용하여 알 수 없는 시료로 결정되었다.

마이크로 플레이트에 항체를 포획하는 코팅

1. 96웰 ELISA 플레이트의 웰을 정제된 포획 항체로 코팅하여 100 μL의 포획 항체(1-10 μg/mL 범위)를 플레이트의 각 웰에 첨가합니다.
2. 접착제 플레이트 커버로 플레이트를 덮고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
3. 인큐베이션 후 플레이트를 싱크대 위로 쓸어가 서 플레이트에서 코팅 용액을 제거합니다.

블로킹

4. 200 μL 차단 용액, PBS를 함유하는 5% 무지방 건조 우유를 우물에 추가하여 항체 코팅 우물에서 남은 단백질 결합 부위를 차단합니다.
5. 실온에서 또는 4°C에서 하룻밤 동안 적어도 2 시간 동안 배양하십시오.
6. 인큐베이션에 이어, 플레이트를 가볍게 하여 블로킹 버퍼를 제거한 다음 1% Tween-20을 함유한 PBS로 플레이트를 세척합니다.

테스트 샘플을 포함하는 항원 추가

7. 테스트 샘플의 100 μL을 우물에 추가합니다. 접착제 덮개로 접시를 밀봉합니다.
8. 실온에서 1-2 시간 동안 또는 4 ° C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
9. 인큐베이션 후, 싱크대 위로 접시를 쓸어 넘은 다음 1% Tween-20을 포함하는 200 μL 1X PBS로 우물을 세척하여 샘플을 제거합니다.

효소-컨쥬게이드 검출 항체 추가

10. 미리 최적화된 농도로 100 μL의 효소 접합 검출 항체를 우물에 첨가합니다.
11. 접착제 덮개로 접시를 밀봉하고 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.
12. 싱크대 위에 플레이트를 쓸어 넘음으로써 언바운드 검출 항체를 제거하고 1% Tween-20을 함유한 200 μL 1X PBS로 우물을 세척한다.

탐지

13. 1 mg/mL의 농도에서 지표 기판의 100 μL을 추가합니다. 모든 바운드 효소-공해 검출 항체는 기판을 검출 가능한 신호로 변환합니다.
14. 상온에서 5-10 분 동안 접시를 배양하십시오.
15. 5-10 분 후, 우물에 100 μL 2N H₂SO_4를 추가하여 효소 반응을 중지합니다. 정지 용액을 추가한 지 30분 이내에 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 읽고 우물의 흡광도를 결정합니다.

3. 경쟁 ELISA

경쟁적인 ELISA의 단계는 간접 및 샌드위치 ELISA에 사용되는 것과 다르며, 주요 차이점은 샘플 항원과 "추가 기능"항원 사이의 경쟁 적 바인딩 단계입니다. 시료 항원들은 표지가 없는 1차 항체로 배양된다. 이러한 항체-항원 복합체는 동일한 항원으로 미리 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가된다. 잠복기 후에, 어떤 불바운드 항체든지 멀리 씻어내게 됩니다. 원래 시료에서 항원의 우물과 항원 양을 결합하는 데 사용할 수 있는 자유 항체의 양과 역상관관계가 있다. 예를 들어, 항원이 풍부한 샘플은 더 많은 항원 항체 복합체를 가지며, ELISA 플레이트에 결합하기 위해 거의 결합되지 않은 항체를 남겨 둡시다. 1차 항체에 특이적인 효소-컨쥬게이트 이차 항체는 이어서 우물에 첨가되고 기판이 뒤따릅니다.

마이크로 플레이트에 항원을 코팅

1. 정제된 항원의 100 μL로 96웰 ELISA 플레이트의 웰을 1-10 μg/mL 농도로 코팅합니다.
2. 접착제 플레이트 커버로 플레이트를 덮고 4°C에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양합니다.
3. 인큐베이션에 따라 싱크대 위로 플레이트를 쓸어넘기면 우물에서 언바운드 항원 용액을 제거합니다.

블로킹

4. 코팅된 우물에서 나머지 단백질 결합 부위를 각 웰에 블로킹 버퍼 200 μL을 추가하여 PBS에서 5% 비지방 건조 우유 또는 BSA가 될 수 있습니다.
5. 플레이트를 실온에서 2시간 이상 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

1차 항체를 가진 배양 샘플(antigen)

6. 우물을 차단하는 동안, 분석에서 각각 의 150 μL 샘플 항원 및 1차 항체의 150 μL을 혼합하여 항원 항체 혼합물을 준비한다.
7. 이 혼합물을 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.

항원-항체 혼합물을 우물에 추가

8. 이제 싱크대 위로 플레이트를 가볍게 하여 우물에서 차단 버퍼를 제거합니다.
9. 그런 다음, Tween-20을 포함하는 1X PBS로 우물을 씻는다.
10. 시료 항원 항체 혼합물의 100 μL을 추가합니다.
11. 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
12. 싱크대 위에 접시를 쓸어서 샘플 혼합물을 제거합니다.
13. 이어서, 1%의 Tween-20을 함유한 1X PBS로 우물을 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거한다.

이차 항체 추가

14. 이 경우 AP-컨쥬게이드 항체인 효소 컨쥬게이징 이차 항체의 100 μL을 각각 양호하게 넣습니다.
15. 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
16. 인큐베이션에 이어 1%의 트위엔-20을 함유한 1X PBS로 플레이트를 세척한다.

탐지

17. 각 우물에 기판 용액의 100 μL을 추가합니다.
18. 5-10 분 기다립니다.
19. 10 분 후, 우물에 100 μL 2N 황산을 추가하여 효소 반응을 중지합니다. 그런 다음 스톱 솔루션을 추가한 후 30분 이내에 마이크로 플레이트 판독기에서 흡광도를 측정합니다.

간접 ELISA의 다음 예에서, IAV 감염 마우스의 혈청에서 인플루엔자 A 바이러스(IAV)-특이적 IgG의 존재가 결정되었다. C57Bl/6 마우스는 인플루엔자 A 바이러스(A/PR/8; 100 μL PBS i.p.에서¹⁰⁵ PFU)에 감염되었고 28일 후에 혈청을 수집하였다. 혈청에서 IAV 특이적 IgG의 양을 양량화하기 위해 96웰 ELISA 플레이트는 4°C에서 하룻밤 사이에 정제된 A/PR/8 인플루엔자 A 바이러스(50 μL/well 2 mg/ml PBS 바이러스)로 코팅하였다. 코팅 된 플레이트는 PBS에서 5 % 일반 당나귀 세럼으로 실온에서 1 시간 동안 차단되었으며, 4 ° C에서 IAV 도전 마우스의 희석 된 혈청 샘플로 인큐베이션이 뒤따랐습니다. 혈청은 처음에 희석1:12.5, 1:4 희석 (희석 범위 - 1:12.5 받는 것 1:204,800). 세척 후, 플레이트는 알칼리성 인산염(AP)-컨쥬게이드 당나귀 안티마우스 IgG로 1h로 배양되었다. 플레이트를 세척한 다음 p-니트로페닐 인산염(PNPP; 1 mg/mL, 100 μL/웰)이 첨가되었다. AP가 있을 때 무색 PNPP 솔루션은 노란색으로 바뀝니다. 5-10 분 후, 효소 반응은 100 μL / 웰 2N H₂SO_4를추가하여 중단되었습니다. 플레이트는 405 nm에서 마이크로 플레이트 판독기에서 읽혔습니다. 얻은 결과는 표 1과 도 1에 표시됩니다.

표 1: 간접 ELISA 분석 데이터. 혈청 희석제(1:12.5 ~1:204,800), 인플루엔자 A 바이러스(IAV)-감염된 마우스는 IAV 특이적 IgG, 광학 밀도(OD) (405nm) 값을 함유하고 평균 OD₄₀₅ 값을 함유하고 있다.

그림 1: IAV 감염 마우스의 혈청에서 인플루엔자 A 바이러스(IAV)-특이적 IgG의 평균 OD₄₀₅ 값(+ S. D.) 및 혈청 희석제(1:12.5에서 1:204,800)의 간접 ELISA 분석산란 플롯. OD₄₀₅ 값은 혈청 희석제와 반비례할 수 있습니다.

샌드위치 ELISA의 다음 예에서, 재조합 인간 TNFα 표준의 1:2.5 희석(75 pg/mL의 농도에서 시작)은 96웰의 평평한 바닥 플레이트의 표시된 우물에 첨가되었다. 이러한 표준은 흡광도 판독값의 2.5배 변화를 주도했습니다.

표 2: TNFα 샌드위치 ELISA 표준 곡선 데이터. 재조합 인간 TNFα 표준(75~0.3pg/mL), OD(450nm) 값의 1:2.5 희석은 OD_450값, 백 농도 계산 및 평균을 의미한다.

그림 2: TNFα 샌드위치 ELISA에 대한 표준 곡선. 재조합 인간 TNFα 표준(75 ~0.3 pg/mL)의 1:2.5 희석을 샌드위치 ELISA를 사용하여 분석하였다. OD₄₅₀ 값은 표준 희석 농도와 직접 상관관계가 있을 수 있습니다. 시험 샘플에서 TNFα 단백질의 양은 38.72 pg/mL의 농도에 해당하는 표준 곡선을 사용하여 결정되었다.

표준 곡선이 생성되면 시험 샘플에서 TNFα 단백질의 양이 결정되었습니다. 이 샌드위치 ELISA 예제에서 테스트 샘플은 평균_0.6585를 제공하는 0.636 및 0.681의 ODI 450 판독값을 제공했습니다. 위의 차트에서 이 OD450 판독값을 플로팅할 때, 이는 38.72 pg/ml의 TNFα 농도에 해당한다.

입증 된 바와 같이, 면역 분석의 범위 (프로토콜의 약간의 변화와 함께) ELISA 기술 제품군 내에 속한다. 어떤 종류의 ELISA를 사용할지 결정하는 것은 검출되는 항원, 특정 항원용으로 제공되는 단일 클론 항체 및 분석의 원하는 감도(5)를 포함한 여러 가지 요인에 달려 있다. 여기에 설명된 다른 ELISA의 몇 가지 강점과 약점은 다음과 같습니다.

표 3: 요약. 다른 ELISA 기술의 강점과 약점에 대한 요약.

간단하고 유용한 기술이지만, 또한 어떤 ELISA에 몇 가지 단점이있다. 하나는 시험 견본에 있는 관심있는 단백질의 양의 불확실성입니다. 양이 너무 높거나 너무 낮은 경우 마이크로 플레이트 판독기에서 얻은 흡광도 값이 각각 표준 곡선의 한계 이상 또는 그 이하로 떨어질 수 있습니다. 이것은 시험 견본에 존재하는 단백질의 양을 정확하게 결정하는 것을 어렵게 할 것입니다. 값이 너무 높으면 플레이트의 우물에 추가하기 전에 테스트 샘플을 희석할 수 있습니다. 그런 다음 희석 계수에 따라 최종 값을 조정해야 합니다. 언급했듯이, 수제 키트는 종종 높은 신호 대 잡음 비율을 산출하는 데 사용되는 항체 농도의 신중한 최적화가 필요합니다.