אליסה אסייס: עקיפה, כריך ותחרותי
English
Share
Overview
מקור: ויטני סוונסון1,2, פרנסס נגד Sjaastad2,3, ותומאס ס גריפית1,2,3,4
המחלקה לאורולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
2 המרכז לאימונולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
3 מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, ותוכנית לתואר שני בביולוגיה של סרטן, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
4 מרכז הסרטן הבונים החופשיים, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
בדיקות חיסוניות הקשורות לאנזימים (ELISA) משמשות לעתים קרובות למדידת נוכחות ו/או ריכוז של אנטיגן, נוגדן, פפטיד, חלבון, הורמון או ביומולקול אחר במדגם ביולוגי. הוא רגיש ביותר, מסוגל לזהות ריכוזי אנטיגן נמוכים. הרגישות של ELISA מיוחסת ליכולתה לזהות את האינטראקציות בין קומפלקס אנטיגן-נוגדנים יחיד (1). יתר על כן, הכללה של נוגדן אנטיגן מצומד באנזים מאפשרת המרה של מצע חסר צבע למוצר כרומוגני או פלואורסצנטי שניתן לזהות ולהו כמות בקלות על ידי קורא לוחות. בהשוואה לערכים שנוצרו על ידי כמויות titrated של אנטיגן ידוע של עניין, הריכוז של אותו אנטיגן בדגימות ניסיוניות ניתן לקבוע. פרוטוקולי ELISA שונים הותאמו למדידת ריכוזי אנטיגן במגוון דגימות ניסיוניות, אך לכולם יש את אותו מושג בסיסי (2). בחירת סוג ELISA לביצוע, עקיף, כריך, או תחרותי, תלוי במספר גורמים, כולל המורכבות של הדגימות להיבדק ואת נוגדנים ספציפיים אנטיגן זמין לשימוש. ELISA העקיף משמש לעתים קרובות כדי לקבוע את התוצאה של תגובה חיסונית, כגון מדידת הריכוז של נוגדן במדגם. הכריך ELISA מתאים ביותר לניתוח דגימות מורכבות, כגון תרבית רקמות supernatants או lysates רקמה, שבו ניתוח, או אנטיגן של עניין, הוא חלק מדגם מעורב. לבסוף, ELISA התחרותי משמש לרוב כאשר יש רק נוגדן אחד זמין כדי לזהות את האנטיגן של עניין. ELISAs תחרותיים שימושיים גם לאיתור אנטיגן קטן עם אפיטופ נוגדן אחד בלבד שאינו יכול להכיל שני נוגדנים שונים עקב הפרעה סטרית. הפרוטוקול יתאר את ההליכים הבסיסיים לבדיקות עקיפות, כריך ותחרותיות של ELISA.
בדיקת ELISA העקיפה משמשת בדרך כלל למדידת כמות הנוגדנים בסרום או בסופרנטור של תרבות היברידית. ההליך הכללי לבדיקת אליסה העקיפה הוא:
- מעיל בארות עם אנטיגנים
- הוסף סרום או תרבית היברידית המכילה נוגדן (נוגדן ראשוני או 1° )
- דגירה ושטיפה
- הוסף נוגדן משני (או 2°) מצומד באנזים
- דגירה ושטיפה
- הוספת מצע
סנדוויץ ‘ ELISA מנסח שונה מבדיקת ELISA העקיפה בכך שהשיטה אינה כרוכה בציפוי הצלחות באנטיגן מטוהר. במקום זאת, נוגדן “ללכוד” משמש לציפוי בארות של הצלחת. האנטיגן “תקוע” בין נוגדן הלכידה לנוגדן “זיהוי” שני – שבו שני הנוגדנים ספציפיים לאותו אנטיגן, אך באפיטופים שונים (3). על ידי קשירה לתסביך הנוגדן/אנטיגן, נוגדן האיתור נשאר בצלחת. נוגדנים חד שבטיים או אנטיזרים פוליקלונליים יכולים לשמש כנוגדנים ללכידה וזיהוי. היתרון העיקרי של כריך ELISA הוא כי המדגם לא צריך להיות מטוהר לפני הניתוח. יתר על כן, ההסתה יכולה להיות רגישה למדי (4). ערכות ELISA רבות הזמינות מסחרית הן ממגוון הכריכים ומשתמשות בזוגות נוגדנים תואמים שנבדקו. ההליך הכללי עבור כריך אליסה אסאי הוא:
- מעיל בארות עם נוגדן לכידה
- הוספת דגימות בדיקה המכילות אנטיגן
- דגירה ושטיפה
- הוסיפו נוגדן לזיהוי מצומד באנזים.
- דגירה ושטיפה
- הוספת מצע
רוב ערכות הסנדוויץ’ ELISA הזמינות מסחרית מגיעות עם נוגדני זיהוי מצומדים באנזים. במקרים בהם נוגדן זיהוי מצומד באנזים אינו זמין, ניתן להשתמש בנוגדן משני מצומד באנזים הספציפי לנוגדן האיתור. האנזים בנוגדן המשני מבצע את אותו תפקיד, שהוא להמיר את המצע חסר הצבע למוצר כרומוגני או פלואורסצנטי. הנוגדן המשני הנ”ל מצומד באנזים ירצה יותר לשמש בכריך “תוצרת בית” ELISA שפותח על ידי חוקר שיצר נוגדנים חד שבטיים משלהם, למשל. חיסרון אחד בשימוש בנוגדן מצומד משני הוא לוודא שהוא נקשר רק לנוגדן האיתור, ולא לנוגדן הלכידה הקשור לצלחת. התוצאה תהיה מוצר מדיד בכל בארות, ללא קשר לנוכחות או היעדר נוגדן אנטיגן או זיהוי.
לבסוף, ההסתייגות התחרותית של ELISA משמשת לזיהוי אנטיגנים מסיסים. זה פשוט לבצע, אבל זה מתאים רק כאשר האנטיגן המטוהר זמין בכמות גדולה יחסית. ההליך הכללי לבדיקת אליסה התחרותית הוא:
- בארות מעיל עם אנטיגן
- דגירה ושטיפה
- דגימת בדיקה לפני הדגמה עם נוגדנים ראשוניים מצומדים באנזים
- מוסיפים את התערובת היטב
- לדגור ולשטוף כל נוגדן ראשוני מצומד עם אנזים
- הוספת מצע
“התחרות” בבדיקה זו נובעת מהעובדה שיותר אנטיגן בדגימת הבדיקה המשמשת בשלב 3 תגרום לפחות נוגדנים זמינים להיקשר לציפוי האנטיגן של הבאר. לכן, עוצמת המוצר כרומוגגני/פלואורוגניים בבאר בסוף הבדיקה קשורה הפוך לכמות האנטיגן הקיימת במדגם הבדיקה.
מרכיב מרכזי בכל סוג של ELISA הוא הסטנדרטים titrated של ריכוזים ידועים שיאפשרו למשתמש לקבוע את ריכוז אנטיגן נוכח בדגימות הבדיקה. בדרך כלל, סדרה של בארות מיועדות ליצירת עקומה סטנדרטית, שבה כמויות ידועות של חלבון רקומביננטי מטוהר מתווספות לבארות בכמויות יורדות. כאשר בארות אלה מעובדות באותו זמן כמו דגימות הבדיקה, המשתמש יכול לקבל ערכת התייחסות של ערכי ספיגה המתקבלים מקורא מיקרו-לוח עבור ריכוזי חלבון ידועים ללכת יחד עם ערכי הספיגה עבור דגימות הבדיקה. לאחר מכן המשתמש יכול לחשב עקומה סטנדרטית שאליה ניתן להשוות את דגימות הבדיקה לקביעת כמות החלבון של עניין נוכח. העקומה הסטנדרטית יכולה גם לקבוע את מידת הדיוק של יצירת הדילול של המשתמש.
לבסוף, השלב האחרון בכל אחד מסוגי ELISA המפורטים לעיל דורש הוספת מצע. מידת ההמרה של המצע למוצר קשורה ישירות לכמות האנזים הקיימת בבאר. פרוקסידאז חזרת (HRP) ואלקליין פוספטאז (AP) הם האנזימים הנפוצים ביותר שנמצאו מצומדים לנוגדנים. כצפוי, ישנם מספר מצעים זמינים ספציפית עבור אנזים המייצרים מוצר כרומוגני או פלואורסצנטי. יתר על כן, מצעים זמינים במגוון רגישויות שיכולות להגביר את הרגישות הכוללת של ההסתה. המשתמש חייב גם לקחת בחשבון את סוג המכשור הזמין לקריאת הצלחת בסוף הניסוי בעת בחירת סוג המצע לשימוש, יחד עם הנוגדן המתאים לו מצומד באנזים.
מצעים כרומוגניים נפוצים עבור HRP כוללים 2,2′-אזינוביס [3-אתילבזותיאזולין-6-חומצה גופרתית]-מלח דיאמוניום (ABTS) ו-3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB), ואילו p-Nitrophenyl פוספט (PNPP) משמש עבור AP. ABTS ו- TMB מייצרים מוצרי תגובה בצבע ירוק וכחול מסיסים במים, בהתאמה. מוצר ABTS הירוק יש שתי פסגות ספיגה עיקריות, 410 ו 650 ננומטר, בעוד המוצר הכחול TMB מזוהה בצורה הטובה ביותר ב 370 ו 652 ננומטר. הצבעים של ABTS ו- TMB משתנים לצהוב בתוספת פתרון עצירה חומצי, אשר מומלץ לקרוא ב 450 ננומטר. פיתוח צבע עבור ABTS הוא איטי, בעוד הוא מהיר עבור TMB. TMB רגיש יותר מ- ABTS, ועשוי לייצר אות רקע גבוה יותר אם התגובה אנזימטית ממשיכה זמן רב מדי. PNPP מייצרת מוצר צהוב מסיס במים לאחר המרת AP שסופג אור ב-405 ננומטר.
Procedure
Results
In the following example of an indirect ELISA, the presence of influenza A virus (IAV)-specific IgG in the serum of IAV-infected mice was determined. C57Bl/6 mice were infected with influenza A virus (A/PR/8; 105 PFU in 100 µL PBS i.p.) and serum was collected 28 days later. To quantitate the amount of IAV-specific IgG in the serum, 96-well ELISA plates were coated with purified A/PR/8 Influenza A virus (50 µL/well of 2 mg/ml PBS virus) overnight at 4°C. Coated plates were blocked for 1 hour at room temperature with 5% normal donkey serum in PBS, followed by incubation with diluted serum samples from IAV-challenged mice overnight at 4°C. The serum was initially diluted 1:12.5, followed by 1:4 dilutions (dilution range – 1:12.5 to 1:204,800). After washing, plates were incubated with an alkaline phosphatase (AP)-conjugated donkey anti-mouse IgG for 1 h. The plates were washed, and then p-Nitrophenyl Phosphate (PNPP; 1 mg/mL, 100 µL/well) was added. The colorless PNPP solution turns to a yellow color when AP is present. After 5-10 min, the enzymatic reaction was stopped by adding 100 µL/well 2N H2SO4. The plate was read on a microplate reader at 405 nm. The results obtained are shown in Table 1 and Figure 1.
| Sample | Wells | OD405 | Mean |
| Serum 1:12.5 | A1 | 2.163 | 2.194 |
| B1 | 2.214 | ||
| C1 | 2.204 | ||
| Serum 1:50 | A1 | 1.712 | 1.894 |
| B1 | 2.345 | ||
| C1 | 1.624 | ||
| Serum 1:200 | A1 | 1.437 | 1.541 |
| B1 | 1.73 | ||
| C1 | 1.456 | ||
| Serum 1:800 | A1 | 1.036 | 0.957 |
| B1 | 0.912 | ||
| C1 | 0.923 | ||
| Serum 1:3200 | A1 | 0.579 | 0.48 |
| B1 | 0.431 | ||
| C1 | 0.429 | ||
| Serum 1:12800 | A1 | 0.296 | 0.281 |
| B1 | 0.312 | ||
| C1 | 0.236 | ||
| Serum 1:51200 | A1 | 0.308 | 0.283 |
| B1 | 0.299 | ||
| C1 | 0.243 | ||
| Serum 1:204800 | A1 | 0.315 | 0.303 |
| B1 | 0.298 | ||
| C1 | 0.297 |
Table 1: Indirect ELISA assay data. Serum dilutions (from 1:12.5 to 1:204,800), of influenza A virus (IAV)-infected mice containing IAV-specific IgG, optical density (OD) (405 nm) values and mean OD405 values.
Figure 1: Indirect ELISA assay scatter plot of mean OD405 values(+ S. D.) and serum dilutions (from 1:12.5 to 1:204,800), of influenza A virus (IAV)-specific IgG in the serum of IAV-infected mice. The OD405 values can be inversely correlated to the serum dilutions.
In the following example of a sandwich ELISA, a 1:2.5 dilution of recombinant human TNFα standards (starting at a concentration of 75 pg/mL) was added to the indicated wells of a 96-well flat-bottom plate. These standards led to a corresponding 2.5-fold change in the absorbance readings.
| Sample | Concentration (pg/mL) | Wells | Values | Mean Value | Back Concentration Calculation | Average |
| Standard 1 | 75 | A1 | 1.187 | 1.169 | 76.376 | 75.01 |
| A2 | 1.152 | 73.644 | ||||
| Standard 2 | 30 | B1 | 0.534 | 0.52 | 30.827 | 29.962 |
| B2 | 0.506 | 29.098 | ||||
| Standard 3 | 12 | C1 | 0.23 | 0.217 | 12.838 | 12.105 |
| C2 | 0.204 | 11.372 | ||||
| Standard 4 | 4.8 | D1 | 0.09 | 0.084 | 5.055 | 4.726 |
| D2 | 0.078 | 4.398 | ||||
| Standard 5 | 1.92 | E1 | 0.033 | 0.031 | 1.941 | 1.86 |
| E2 | 0.03 | 1.778 | ||||
| Standard 6 | 0.768 | F1 | 0.009 | 0.011 | 0.626 | 0.764 |
| F2 | 0.014 | 0.901 | ||||
| Standard 7 | 0.307 | G1 | 0.002 | 0.004 | 0.238 | 0.377 |
| G2 | 0.007 | 0.516 |
Table 2: TNFα Sandwich ELISA standard curve data. A 1:2.5 dilution of recombinant human TNFα standards (75 to 0.3 pg/mL), OD (450 nm) values, mean OD450 values, back concentration calculations and their averages.
Figure 2: Standard Curve for TNFα sandwich ELISA. A 1:2.5 dilution of recombinant human TNFα standards (75 to 0.3 pg/mL) was analyzed using sandwich ELISA.The OD450 values can be directly correlated to the standard dilution concentrations. The amount of TNFα protein in the test sample was determined using the standard curve, which corresponds to a concentration of 38.72 pg/mL.
Once the standard curve was generated, the amount of TNFα protein in the test sample was determined. In this sandwich ELISA example, the test samples gave OD450 readings of 0.636 and 0.681, which give an average of 0.6585. When plotting this OD450 reading on the above chart, this corresponds to a TNFα concentration of 38.72 pg/ml.
Applications and Summary
As demonstrated, a range of immunoassays (with slight variation in protocols) fall within the ELISA technique family. Determining which version of ELISA to use depends on a number of factors, including what antigen is being detected, the monoclonal antibody available for a particular antigen, and the desired sensitivity of the assay (5). Some strengths and weaknesses of the different ELISAs described herein are:
| ELISA | Strengths | Weaknesses |
| Indirect | 1) High sensitivity due to the fact that multiple enzyme-conjugated secondary antibodies can bind to the primary antibody | 1) High background signal may occur because the coating of the antigen of interest to the plate is not specific (i.e., all proteins in the sample will coat the plate) |
| 2) Many different primary antibodies can be recognized by a single enzyme-conjugated secondary antibody giving the user the flexibility of using the same enzyme-conjugated secondary antibody in many different ELISA (regardless of the antigen being detected) | ||
| 3) Best choice when only a single antibody for the antigen of interest is available | ||
| Sandwich | 1) The use of antigen-specific capture and detection monoclonal antibody increases the sensitivity and specificity of the assay (compared to the indirect ELISA) | 1) Optimizing the concentrations of the capture and detection monoclonal antibodies can be difficult (especially for non-commercial kits) |
| 2) Best choice for detecting a large protein with multiple epitopes (such as a cytokine) | ||
| Competitive | 1) Impure samples can be used | 1) Requires a large amount of highly pure antigen to be used to coat plate |
| 2) Less sensitivity to reagent dilution effects | ||
| 3) Ideal for detecting small molecules (such as a hapten) |
Table 3: Summary. A summary of the strengths and weaknesses of the different ELISA techniques.
While a simple and useful technique, there are also some drawbacks to any ELISA. One is the uncertainty of the amount of the protein of interest in the test samples. If the amount is too high or too low, the absorbance values obtained by the microplate reader may fall above or below the limits of the standard curve, respectively. This will make it difficult to accurately determine the amount of protein present in the test samples. If the values are too high, the test sample can be diluted prior to adding to the wells of the plate. The final values would then need to be adjusted according to the dilution factor. As mentioned, homemade kits often require careful optimization of the antibody concentrations used to yield a high signal-to-noise ratio.
References
- Porstmann, T. and Kiessig S.T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
- Suleyman Aydin. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides, 72, 4-15 (2015).
- Gan. S. D. and Patel K. R. Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Investigative Dermatology, 133 (9), 1-3 (2013).
- Kohl, T. O. and Ascoli C.A. Immunometric Antibody Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Cold Spring Harbor Protocols, 1 (6), (2017).
- Sakamoto, S., Putalun, W., Vimolmangkang, S., Phoolcharoen, W., Shoyama, Y., Tanaka, H., and Morimoto S. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of natural medicines, 72 (1), 32-42 (2018).
Transcript
Enzyme-linked Immunosorbent Assay, or ELISA is a highly sensitive quantitative assay commonly used to measure the concentration of an analyte like cytokines and antibodies in a biological sample. The general principle of this assay involves three steps: starting with capture, or immobilization, of the target analyte on a micro plate, followed by the detection of the analyte by target-specific detection proteins, and lastly, enzyme reaction, where a conjugated enzyme converts its substrate to a colored product. Based on different methods of capture and detection, ELISA can be of four types: direct, indirect, sandwich, and competitive.
For direct ELISA, the target antigen is first bound to the plate, and is then detected by a specific detection antibody. This method is commonly used for screening antibodies for a specific antigen. Indirect ELISA is used for detecting antibodies in a sample in order to quantify immune responses. The plate is first coated with a specific capture antigen, which immobilizes the target antibody, and this antigen-antibody complex is then detected using a second antibody.
In the case of sandwich ELISA, the target analyte is an antigen, which is captured on the plate using a capture antibody and then detected by the detection antibody, hence forming an antibody-antigen-antibody sandwich. This method is useful for measuring the concentration of an antigen in a mixed sample.
Competitive ELISA is used when only one antibody is available for a target antigen of interest. The plate is first coated with the purified antigen. Meanwhile, the sample containing the antigen is pre-incubated with the antibody and then added to the plate, to allow any free antibody molecules to bind to the immobilized antigen. The higher the signal from the plate, the lower the antigen concentration in the sample. In all of the four types of ELISA, direct, indirect, sandwich, and competitive, the detection antibody is either directly conjugated to the enzyme or can be indirectly linked to it through another antibody or protein.
The enzymes commonly used for the reaction are horseradish peroxidase or alkaline phosphatase with their respective substrates, both producing a soluble, colored product that can be measured and quantified using a plate reader. In this video, you will observe how to perform indirect ELISA, sandwich ELISA, and competitive ELISA, followed by examples of quantification of the target analyte from the indirect and sandwich ELISA methods.
The first experiment will demonstrate how to use indirect ELISA to determine the presence of anti-influenza virus antibodies in serum obtained from influenza-infected mice.
To begin, add 50 microliters of purified antigen – in this case, 2 milligrams per milliliter of purified A/PR/8 Influenza A virus- to each well of a 96-well ELISA plate. Next, cover the plate with an adhesive cover and incubate it overnight at 4 degrees celsius to allow the antigen to bind to the plate. The following day, remove the coating solution by flicking the plate over a sink. Next, block the remaining protein-binding sites in the coated wells by adding 200 microliters of a blocking buffer- here, 5% donkey serum in 1X PBS- to each well. Leave the plate to incubate for at least 2 hours at room temperature. Following the incubation, remove the blocking buffer and then wash the plate by adding 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Flick the plate over the sink once more to remove the wash.
Then, prepare the test samples by adding 460 microliters of PBS to a fresh tube, and then adding 40 microliters of serum to make a 1 to 12.5 dilution. Then, add 300 microliters of PBS to a second tube, and then add 100 microliters of the first dilution. Continue this serial dilution range until obtaining a final sample with a dilution of 1 to 204,800. Add the serially diluted serum samples in triplicate to the wells. Cover the plate with an adhesive cover and incubate at room temperature for an hour. Next, remove the samples by flicking the plate into the sink and then wash the plate by adding 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Once again, flick the plate to remove the wash.
Now, add 100 microliters of an enzyme-conjugated secondary antibody, which in this experiment is a horseradish peroxidase, or HRP, conjugated donkey anti-mouse secondary, to each well. Incubate the plate for one hour at room temperature, and flick the plate to remove any excess liquid. Wash the plate with 1X PBS containing 1% Tween-20 and then apply 100 microliters of the indicator substrate at a concentration of one milligram per milliliter to each well. Incubate the plate with the substrate for 5 to 10 minutes at room temperature. In this example, the colorless 3,3′, 5,5′ – tetramethylbenzidine, or TMB, substrate turns a blue color when HRP is present. After 10 minutes, stop the enzymatic reaction by adding 100 microliters of 2N sulfuric acid. The samples will turn a yellow color.
Within 30 minutes of adding the stop solution, insert the plate into a microplate reader and read the plate at the appropriate wavelength for the substrate to determine the absorbance of the wells.
To begin the sandwich ELISA, the plate must be coated with purified capture antibody. To do this, add 100 microliters of the capture antibody at a concentration within the 1-10 microgram per milliliter range, to each well of a 96-well ELISA plate. Next, cover the plate with an adhesive plate cover and then incubate the plate overnight at 4 degrees celsius. After the incubation, remove the coating solution by flicking the plate over a sink.
Now, block the remaining protein- binding sites in the coated wells by adding 200 microliters of 5% nonfat dry milk to the wells. Incubate the plate at room temperature for at least 2 hours. Next, remove the blocking buffer, and then wash the wells with 1X PBS containing 1% Tween-20. Remove the wash by flicking the plate over the sink. Now, add 100 microliters of the test sample to the wells, seal the plate with an adhesive cover, and then incubate it at room temperature for 2 hours. After incubation, remove the samples by flicking the plate over the sink and then wash the wells with 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Flick the plate over the sink to remove the wash and then add 100 microliters of enzyme-conjugated detection antibody to the wells.
Seal the plate with an adhesive cover. Leave the plate to incubate at room temperature for 2 hours. After the incubation, remove the unbound detection antibody by flicking the plate over a sink and wash the wells with 200 microliters of 1X PBS containing 1% Tween-20. Next, add 100 microliters of the indicator substrate at a concentration of 1 milligram per milliliter, and incubate the plate for 5 to 10 minutes at room temperature. After 10 minutes, stop the enzymatic reaction by adding 100 microliters of 2N sulfuric acid to the wells and then read the plate within 30 minutes of adding the stop solution in a microplate reader.
To perform a competitive ELISA, first coat the wells of a 96-well ELISA plate with 100 microliters of purified antigen at a concentration of 1-10 micrograms per milliliter. Cover the plate with an adhesive plate cover and then incubate overnight at 4 degrees celsius. Following this, remove the unbound antigen solution from the wells by flicking the plate over a sink.
Next, block the remaining protein-binding sites in the coated wells by adding 200 microliters of blocking buffer to each well- here, 5% nonfat dry milk in PBS. Incubate the plate for at least 2 hours at room temperature. While blocking the wells, prepare the antigen-antibody mixture in a 1. 5 milliliter tube by adding 150 microliters of sample antigen to 150 microliters of primary antibody for each well in the assay. Incubate this mixture for 1 hour at 37 degrees celsius. Now, remove the blocking buffer from the wells by flicking the plate over a sink. Then, wash the wells with 1X PBS containing Tween 20 and then add 100 microliters of the sample antigen- primary antibody mixture.
Leave the plate to incubate at 37 degrees celsius for one hour. Next, remove the sample mixture by flicking the plate over a sink and then wash the wells with 1X PBS containing 1% Tween-20 to remove any unbound antibody. Add 100 microliters of an enzyme-conjugated secondary antibody to each well and incubate the plate for one hour at 37 degrees celsius. Following this, wash the plate with 1X PBS containing 1% Tween-20 and then add 100 microliters of the substrate solution to each well. Wait for 5-10 minutes. After 10 minutes, stop the enzymatic reaction by adding 100 microliters of 2N sulfuric acid and then measure the absorbance in a microplate reader within 30 minutes of adding the stop solution.
For the semi-quantitative indirect ELISA assay, the presence of influenza A virus antibodies in serially diluted samples of serum from influenza A- infected mice was determined by reading the absorbance of each well at 405 nanometers in a plate reader. This raw data is exported to a spread sheet for calculation purposes. In this experiment, the serially diluted serum samples, which range from 1 – 12.5, to 1 – 204,800, were repeated in triplicate.
To analyze the data, the mean absorbance value is therefore calculated for each set of triplicates by adding all the values for each dilution and dividing the sum by 3. Once the mean for each set of triplicates is determined, the mean OD450 readings are plotted against the serial dilutions. The OD readings decrease as the serum is diluted, indicating that less antibodies are found in the more diluted samples. In the quantitative sandwich ELISA, dilutions of known standard, in this case recombinate Human TNFalpha, were added to a 96-well plate and read along with the unknown samples.
To create the standard curve, the mean absorbance value for each set of readings of the known concentrations was calculated. Then, the mean absorbance value was plotted on the y-axis, against the known protein concentrations on the x-axis. A best fit curve is added through the points in the graph.
Once the standard curve is generated, the amount of TNFalpha protein in the test sample can be determined by first calculating the mean absorbance value for the test sample. In this example, the test samples gave OD450 readings of 0.636 and 0. 681. Adding these values and dividing the sum by 2 gives an average of 0.659. From the y-axis on the standard curve graph, extend a horizontal line from this absorbance value to the standard curve. At the point of intersection, extend a vertical line to the x-axis and read the corresponding concentration which, in this test sample, corresponds to a TNFalpha concentration of 38.72 picograms per milliliter.