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抗体生成:使用杂交瘤生产单克隆抗体
 

抗体生成:使用杂交瘤生产单克隆抗体

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抗体是研究和诊断的有力工具,这意味着大量生产它们通常是必要的。

产生抗体的第一步是将感兴趣的抗原注射到宿主动物体内。抗原激活宿主的B细胞,然后产生和释放该抗原特有的抗体。然后,使用ELISA或其他检测方法,对宿主动物的抗血清进行定期筛查,以检测目标抗体的存在。一旦检测到它,宿主动物的脾脏,包含B细胞,被删除。如果脾脏中的所有B细胞现在都被分离,这应该包括一个正在分泌感兴趣的抗原抗体的种群。我们称这个群体为多克隆,因为每个细胞可能绑定到抗原的不同表位,因此,产生自己的个体和独特的抗体。

要产生单克隆抗体,必须首先分离和培养用于识别特定表位的抗体,必须首先分离和培养产生所需抗体的单个B细胞。不幸的是,B细胞在培养中不能很好地存活。因此,为了克服这一障碍,科学家将B细胞与不朽的骨髓瘤细胞融合在一起,导致杂交瘤。这些细胞随后在选择性培养基中生长,仅允许杂交瘤生长和释放抗体。同样,使用ELISA等方法对该介质进行筛选,以寻找所需的抗体。一旦检测到杂交瘤,通过称为限制稀释的过程克隆,即父培养物的连续稀释,这将导致单细胞被播种到筛选板的孔中。这允许从单个母细胞生长杂交瘤,产生仅释放所需抗体的单克隆细胞系。这些单克隆线可以在组织培养瓶中扩展,以产生大量的单克隆抗体。在此之后,当细胞开始死亡时,抗体可以从介质中沉淀成硫酸铵。通常,在溶液中,抗体通过亲水相互作用与水相互作用。然而,铵和硫酸盐是高电荷离子,将水分子与抗体分离,降低抗体的溶解度,导致其沉淀。

首先,首先检查材料列表,并准备协议的所有介质、耗材和工作面。

然后,打开水浴,将其设置为 37 摄氏度。接下来,将 10 毫升完整的 RPMI 添加到 15 毫升锥形管中,将 15 毫升的完整 RPMI 添加到 T75 细胞培养瓶中,并将其放在一边。使用谨慎和穿着适当的个人防护设备,从液氮储存中取出含有杂交细胞的冷冻小瓶。要释放小瓶内的压力,应稍微松开瓶盖。现在,在水浴中小心孵育小瓶,确保瓶盖保持在水面上方,以尽量减少污染的可能性。当细胞几乎解冻时(通常需要大约两分钟)时,将小瓶移到组织培养罩上。

然后,在取下瓶盖之前,用70%乙醇擦拭小瓶外侧。使用无菌移液器,将细胞转移到含有10毫升完整RPMI培养基的锥形管中。然后,在 1200 RPM 下将管离心 5 分钟。离心后,将管子移回组织罩并用乙醇擦拭管外侧。在不干扰颗粒的情况下,丢弃上清液,然后加入五毫升新鲜完整的 RPMI 介质,然后轻轻上下移液以重新悬浮。接下来,将细胞转移到T75细胞培养瓶中,将烧瓶置于37摄氏度的5%二氧化碳培养箱内。允许细胞达到约80%的汇合,这通常需要大约三天。请注意,杂交瘤细胞是非粘附的,并且会生长在培养基中。达到足够的汇合时间可能因活细胞的起始数量和所使用的杂交瘤细胞类型而异。

一旦细胞充分结合,使用无菌的25毫升移液器将其从培养瓶转移到圆锥形离心管中。在1200RPM下通过离心将细胞进行5分钟的离心。当细胞在离心机中时,在三个新的T75细胞培养瓶中加入18毫升的完整RPMI,并将其放在一边。离心后,去除上清液,并轻轻地将细胞颗粒悬浮在六毫升完整的RPMI中。接下来,在三个新的细胞培养瓶中加入两毫升的细胞悬浮液。最后,将烧瓶放入设定为5%二氧化碳和37摄氏度的孵化器中,孵育至烧瓶约80%的汇入,约3天。

此时,细胞已准备好在专为杂交瘤细胞系设计的无血清培养基中继续生长,例如含有HB101补充剂的商用HB基底液体培养基。将细胞从每个细胞培养瓶转移到圆锥形离心管中,然后以1200RPM离心对细胞进行5分钟的离心。现在,在6个225厘米平方的细胞培养瓶中加入230毫升补充的HB101无血清培养基,并把它们放在一边。当离心完成时,去除上清液,并在10毫升补充的HB101培养基中重新悬浮每粒。然后,进入每个细胞培养瓶,加入五毫升的细胞悬浮液。将烧瓶置于37摄氏度的5%二氧化碳培养箱中,然后继续生长约三周。在此期间,细胞将产生并释放感兴趣的单克隆抗体到培养基,当细胞开始死亡时,抗体将准备好进行纯化。

要从含抗体培养基介质中清除细胞碎片,将培养瓶中的内容物倒入管中,用于固定角度转子。将管子放在转子中,并确保在离心前正确平衡。以 10,000 RPM 旋转管 8 分钟。当样品离心时,将一个装有搅拌棒的两升塑料烧杯放入冰桶中,然后将冰桶放在搅拌板上。

接下来,将 500 毫升的过滤器顶部连接到一升瓶。使用适当的管道将此瓶顶过滤单元连接到室内真空中。然后,将含有抗体的上清液倒入过滤器顶部。离心剩余的介质,以分离细胞碎片从含抗体的上清液。当过滤器顶部充满上清液时,启动真空。然后,当一升收集瓶接近满时,取下过滤器顶部,将过滤过的上清液倒入冰上两升烧杯中。重复过滤步骤,直到处理所有上清液。

处理完所有样品后,每升过滤上清液重量为295克硫酸铵。启动搅拌板,并在接下来的几个小时内缓慢地将硫酸铵添加到上清液中。这可以防止硫酸铵盐的局部高浓度,可能导致不需要的蛋白质沉淀。加入所有硫酸铵后,用箔覆盖烧杯,连同搅拌板一起将其移至四摄氏度的冷藏室,并设置在一夜之间搅拌抗体溶液。

第二天早上,将含硫酸铵的抗体溶液从两升烧杯倒入固定角度转子的清洁管中。在 6500 RPM 下将管离心 20 分钟,不中断以颗粒管底部的抗体。接下来,真空吸出上清液,小心不要吸吮软颗粒。继续使用同一组管子从含硫酸铵的上清液中收集颗粒抗体。在最后一次吸入后,将每个抗体颗粒重新悬浮在大约一毫升的PBS中。

要从抗体溶液中去除硫酸铵,首先每毫升抗体溶液切割大约一英寸的透析管。接下来,用蒸馏水擦拭管子,在油管的一端打一个结。在油管中加注蒸馏水,以检查结有无泄漏。如果几分钟后没有泄漏,则将水从管中倒空。

接下来,将抗体溶液移入管中。为了恢复尽可能多的抗体,用额外的0.25毫升的PBS冲洗管子,并将它转移到管中。使用透析夹将管的顶部固定在尽可能靠近溶液的地方。然后,将油管顶部带入四升烧杯的外部,将油管的填充部分悬挂在烧杯中。现在,把烧杯带到四摄氏度的寒冷房间,放在搅拌盘上。用 PBS 填充烧杯顶部,并添加搅拌棒。让管子和溶液搅拌约8小时。第二天早上,用新鲜的 PBS 替换烧杯中的 PBS,然后离开烧杯再次搅拌约 8 小时。那天晚上晚些时候,最后重复一次这个过程。早上,打开透析管,然后将抗体溶液从管转移到15毫升锥形管。要去除透析过程中可能形成的任何沉淀物,请以 1200 RPM 将管离心 5 分钟。最后,将上清液转移到新鲜管中。

为了量化抗体浓度,首先通过在95微升的PBS中加入5微升的抗体等分,进行20倍的稀释。然后,将稀释的抗体移入比色皿中,并使用分光光度计将浓度记录在280纳米。接下来,使用所示公式计算抗体浓度。最后,用抗体名称、浓度、制备日期以及(如适用)批号和实验者名称,将抗体与标记的螺帽小瓶等标记。这些可以储存在零下80摄氏度,直到需要。

使用 120G8 抗小鼠 CD317 或 PDCA-1 杂交瘤系列的示例产量范围在 44 到 99.6 毫克之间,通常平均产量为 67.3 毫克。需要注意的是,每个生产运行使用相同的杂交瘤细胞系可以略有不同的单克隆抗体在末端可用。

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