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Génération d'anticorps : Production d'anticorps monoclonaux à l'aide d'hybridomas

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Les anticorps sont un outil puissant pour la recherche et le diagnostic, ce qui signifie qu'il est souvent nécessaire de les produire en grandes quantités.

La première étape pour générer des anticorps est d'injecter l'antigène d'intérêt dans un animal hôte. L'antigène active les cellules B de l'hôte qui produisent et libèrent ensuite des anticorps spécifiques à cet antigène. Ensuite, un dépistage régulier de l'antisera de l'animal hôte pour détecter la présence de l'anticorps cible est effectué, à l'aide d'ELISA ou d'une autre méthode de détection. Une fois qu'il est détecté, la rate de l'animal hôte, qui contient les cellules B, est enlevée. Si toutes les cellules B de la rate sont maintenant isolées, cela devrait inclure une population qui sécrètent des anticorps à l'antigène d'intérêt. Nous nous référons à cette population comme polyclonal, parce que chaque cellule probablement liée à un épitope différent de l'antigène, et donc, a généré son propre anticorps individuel et unique.

Pour générer des anticorps monoclonaux, les anticorps élevés pour reconnaître un épitope spécifique, la cellule B individuelle qui produit l'anticorps désiré doivent d'abord être isolés et cultivés. Malheureusement, les cellules B ne survivent pas bien en culture. Ainsi, pour surmonter cet obstacle, les scientifiques fusionnent les cellules B avec des cellules de myélome immortelles, résultant en hybridomas. Ces cellules sont ensuite cultivées dans un milieu sélectif qui ne permet aux hybridomes de croître et de libérer des anticorps. Encore une fois, le milieu est examiné à l'aide d'une méthode telle que ELISA pour l'anticorps désiré. Une fois qu'il est détecté, les hybridomas sont clonés par un processus appelé dilution limitante, une dilution sérielle de la culture mère, qui devrait avoir comme conséquence les cellules simples étant ensecées dans les puits d'une plaque de criblage. Cela permet la croissance d'hybridomas à partir d'une cellule monoparentale, donnant une lignée cellulaire monoclonale qui ne libère que l'anticorps désiré. Ces lignées monoclonales peuvent être étendues dans des flacons de culture tissulaire pour produire de grandes quantités d'anticorps monoclonaux. Après cela, comme les cellules commencent à mourir, les anticorps peuvent être précipités à partir du milieu avec du sulfate d'ammonium. Normalement, en solution, les anticorps interagissent avec l'eau par le biais d'interactions hydrophiles. Cependant, l'ammonium et le sulfate sont des ions très chargés qui séparent les molécules d'eau des anticorps, diminuant la solubilité des anticorps et les faisant précipiter.

Pour commencer, vérifiez d'abord la liste des matériaux et préparez tous les supports, fournitures et surfaces de travail pour le protocole.

Ensuite, allumez un bain d'eau et placez-le à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de RPMI complet à un tube conique de 15 millilitres et 15 millilitres de RPMI complet à un flacon de culture cellulaire T75 et les mettre de côté. En utilisant la prudence et en portant l'équipement de protection individuelle approprié, retirez le flacon congelé contenant des cellules d'hybridome du stockage d'azote liquide. Pour relâcher la pression à l'intérieur du flacon, desserrer légèrement le bouchon. Maintenant, incubez soigneusement le flacon dans le bain d'eau, en s'assurant que le bouchon reste au-dessus de la surface de l'eau pour minimiser les risques de contamination. Lorsque les cellules sont presque décongelées, ce qui prend généralement environ deux minutes, déplacez le flacon vers le capuchon de culture tissulaire.

Ensuite, essuyez l'extérieur de la fiole avec 70% d'éthanol avant d'enlever le bouchon. À l'aide d'une pipette stérile, transférer les cellules dans le tube conique qui contient 10 millilitres de milieu complet RPMI. Ensuite, centrifuger le tube pendant cinq minutes à 1200 tr/min. Après centrifugation, déplacez le tube vers le capot tissulaire et essuyez l'extérieur du tube avec de l'éthanol. Sans déranger la pastille, jetez le supernatant, puis ajoutez cinq millilitres de frais complet RPMI moyen et doucement pipette de haut en bas pour resuspendre. Ensuite, transférez les cellules dans le flacon de culture cellulaire T75 et placez le flacon à l'intérieur d'un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % à 37 degrés Celsius. Permettre aux cellules d'atteindre environ 80% de confluence, ce qui prend habituellement environ trois jours. Notez que les cellules hybridotomes ne sont pas adhérentes et se développeront suspendues dans le milieu. Le temps d'atteindre une confluence suffisante peut varier en fonction du nombre de départ de cellules vivantes et du type de cellule hybride utilisée.

Une fois que les cellules sont suffisamment confluentes, utilisez une pipette stérile de 25 millilitres pour les transférer du flacon de culture dans un tube conique de centrifugeuse. Pelleter les cellules par centrifugation à 1200 tr/min pendant cinq minutes. Tandis que les cellules sont dans la centrifugeuse, ajoutez 18 millilitres de RPMI complet dans chacun de trois nouveaux flacons de culture de cellules de T75 et de les mettre de côté. Après centrifugation, retirer le supernatant et resuspendre doucement la pastille cellulaire en six millilitres de RPMI complet. Ensuite, ajoutez deux millilitres de la suspension cellulaire dans chacun des trois nouveaux flacons de culture cellulaire. Enfin, placez les flacons dans un incubateur réglé à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius et incubez jusqu'à ce que les flacons soient environ 80% confluents, environ trois jours.

À ce stade, les cellules sont prêtes à poursuivre leur croissance dans le milieu sans sérum conçu pour les lignées cellulaires hybridome, tels que le milieu liquide basal HB disponible dans le commerce contenant le supplément HB101. Transférer les cellules de chaque flacon de culture cellulaire dans des tubes coniques de centrifugeuse, puis granuler les cellules par centrifugation à 1200 tr/min pendant cinq minutes. Maintenant, ajoutez 230 millilitres de milieu sans sérum HB101 complété dans chacun des six flacons de culture cellulaire de 225 centimètres carrés et réservez-les. Lorsque la centrifugation est terminée, retirer le supernatant et resuspendre chaque granule dans 10 millilitres de milieu HB101 complété. Ensuite, dans chaque flacon de culture cellulaire, ajouter cinq millilitres de la suspension cellulaire. Placez les flacons dans l'incubateur de dioxyde de carbone de 5 % à 37 degrés Celsius et continuez à cultiver les cellules pendant environ trois semaines. Pendant ce temps, les cellules produiront et libéreront l'anticorps monoclonal d'intérêt dans le milieu de culture et l'anticorps sera prêt pour la purification quand les cellules commenceront à mourir.

Pour enlever les débris cellulaires du support culturel contenant des anticorps, versez le contenu des flacons de culture dans des tubes pour un rotor à angle fixe. Placez les tubes dans le rotor et assurez-vous qu'il est bien équilibré avant la centrifugation. Faites tourner les tubes à 10 000 tr/min pendant huit minutes. Pendant que les échantillons sont centrifuging, placez un bécher en plastique de deux litres avec une barre d'agitation dans un seau à glace et puis mettez le seau à glace sur une plaque à remuer.

Ensuite, attachez un dessus de filtre de 500 millilitres à une bouteille d'un litre. Fixez cette unité de filtre supérieure de bouteille à un vide de maison utilisant le tube approprié. Ensuite, versez le supernatant qui contient l'anticorps dans le dessus du filtre. Centrifuger le support restant pour séparer les débris cellulaires du supernatant contenant des anticorps. Lorsque le dessus du filtre est plein de supernatant, démarrer le vide. Ensuite, lorsque la bouteille de collecte d'un litre est presque pleine, retirez le dessus du filtre et versez le supernatant filtré dans le bécher de deux litres sur la glace. Répétez les étapes de filtration jusqu'à ce que tout le supernatant soit traité.

Lorsque tout l'échantillon a été traité, peser 295 grammes de sulfate d'ammonium par un litre de supernatant filtré. Démarrer la plaque d'agitation et ajouter lentement le sulfate d'ammonium au supernatant au cours des deux prochaines heures. Ceci empêche une concentration élevée localisée de sel de sulfate d'ammonium qui peut causer des protéines non désirées pour précipiter. Une fois que tout le sulfate d'ammonium a été ajouté, couvrir le bécher avec du papier d'aluminium et le déplacer, avec la plaque d'agitation, à une chambre froide à quatre degrés Celsius et le mettre à remuer la solution d'anticorps pendant la nuit.

Le lendemain matin, versez la solution d'anticorps contenant du sulfate d'ammonium du bécher de deux litres dans des tubes propres pour le rotor à angle fixe. Centrifuger les tubes à 6500 tr/min pendant 20 minutes sans casser pour granuler l'anticorps au fond des tubes. Ensuite, aspirez à l'aspiration du supernatant, en utilisant la prudence de ne pas aspirer la boulette molle. Continuer à utiliser le même ensemble de tubes pour recueillir l'anticorps granulé du reste du supernatant contenant du sulfate d'ammonium. Après la dernière aspiration, suspendre chaque granule d'anticorps dans environ un millilitre de PBS.

Pour enlever le sulfate d'ammonium de la solution d'anticorps, coupez d'abord environ un pouce de tube de dialyse pour chaque millilitre de solution d'anticorps. Ensuite, essuyez le tube avec de l'eau distillée et attachez un noeud à une extrémité de la tubulure. Remplissez le tube d'eau distillée pour vérifier s'il y a des fuites dans le noeud. S'il n'y a pas de fuite après quelques minutes, videz l'eau hors de la tubulure.

Ensuite, pipette la solution d'anticorps dans le tube. Pour récupérer autant d'anticorps que possible, rincez les tubes avec 0,25 millilitre supplémentaire de PBS et transférez-le également sur le tube. Fixez le haut du tube aussi près que possible de la solution avec un clip de dialyse. Ensuite, ruban adhésif le haut de la tuyauterie sur le dessus extérieur d'un bécher de quatre litres avec la partie remplie de la tuyauterie accrochée dans le bécher. Maintenant, prenez le bécher à la chambre froide de quatre degrés Celsius et placez-le sur une plaque à remuer. Remplissez le bécher vers le haut avec PBS et ajoutez une barre d'agitation. Laisser le tube et la solution remuer toute la nuit pendant environ huit heures. Le lendemain matin, remplacer le PBS dans le bécher par du PBS frais, puis laisser le bécher remuer à nouveau pendant environ huit heures. Plus tard dans la soirée, répétez le processus une dernière fois. Le matin, ouvrez le tube de dialyse, puis transférez la solution d'anticorps de la tuyauterie aux tubes coniques de 15 millilitres. Pour enlever tout précipité qui pourrait s'être formé pendant la dialyse, centrifuger les tubes pendant cinq minutes à 1200 tr/min. Enfin, transférer le supernatant dans des tubes frais.

Pour quantifier la concentration d'anticorps, faites d'abord une dilution 20 fois en ajoutant cinq microlitres d'un aliquot d'anticorps à 95 microlitres de PBS. Ensuite, pipette l'anticorps dilué dans une cuvette et utiliser un spectrophotomètre pour enregistrer la concentration à 280 nanomètres. Ensuite, calculez la concentration d'anticorps à l'aide de la formule indiquée. Enfin, étiquetez les flacons de bouchon de vis avec le nom de l'anticorps, la concentration, la date de préparation et, le cas échéant, le numéro de lot et le nom de l'expérimentateur, puis aliquot l'anticorps dans les flacons de bouchon de vis étiquetés. Ceux-ci peuvent être stockés à moins 80 degrés Celsius jusqu'à ce que nécessaire.

Les rendements d'exemple utilisant la ligne d'hybridome anti-souris CD317 ou PDCA-1 de 120G8 variaient entre 44 et 99,6 milligrammes, ce qui donne généralement, en moyenne, 67,3 milligrammes de quantité. Il est important de noter que chaque production avec la même lignée cellulaire hybride peut être légèrement différente dans la quantité d'anticorps monoclonal disponibles à la fin.

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