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Antikörper-Generierung: Herstellung monoklonaler Antikörper mit Hybridomen

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Antikörper sind ein leistungsfähiges Werkzeug für Forschung und Diagnose, was bedeutet, dass es oft notwendig ist, sie in großen Mengen herzustellen.

Der erste Schritt zur Erzeugung von Antikörpern besteht darin, das Antigen von Interesse in ein Wirtstier zu injizieren. Das Antigen aktiviert die B-Zellen des Wirts, die dann Antikörper produzieren und freisetzen, die spezifisch für dieses Antigen sind. Anschließend wird das Antisera des Wirtstiers regelmäßig auf das Vorhandensein des Zielantikörpers unter Verwendung von ELISA oder einer anderen Detektionsmethode überprüft. Sobald es entdeckt wird, wird die Milz des Wirtstiers, die die B-Zellen enthält, entfernt. Wenn nun alle B-Zellen aus der Milz isoliert sind, sollte dies eine Population umfassen, die Antikörper gegen das Antigen von Interesse absondert. Wir bezeichnen diese Population als polyklonal, da jede Zelle wahrscheinlich an ein anderes Epitop des Antigens gebunden ist und daher ihren eigenen individuellen und einzigartigen Antikörper erzeugt hat.

Um monoklonale Antikörper zu erzeugen, müssen Antikörper, die angehoben werden, um ein bestimmtes Epitop zu erkennen, die einzelne B-Zelle, die den gewünschten Antikörper produziert, zunächst isoliert und kultiviert werden. Leider überleben B-Zellen in der Kultur nicht gut. Um diese Hürde zu überwinden, verschmelzen Wissenschaftler B-Zellen mit unsterbsamen Myelomzellen, was zu Hybridomen führt. Diese Zellen werden dann in einem selektiven Medium angebaut, das nur die Hybridome wachsen und Antikörper freisetzen lässt. Auch hier wird das Medium mit einer Methode wie ELISA für den gewünschten Antikörper gescreent. Sobald es entdeckt wird, werden die Hybridome über einen Prozess geklont, der als Limiting-Verdünnung bezeichnet wird, eine serielle Verdünnung der Übergeordnetenkultur, die dazu führen sollte, dass einzelne Zellen in die Brunnen einer Siebplatte gesät werden. Dies ermöglicht das Wachstum von Hybridomen aus einer einzigen übergeordneten Zelle, wodurch eine monoklonale Zelllinie entsagt wird, die nur den gewünschten Antikörper freisetzt. Diese monoklonalen Linien können in Gewebekulturkolben erweitert werden, um große Mengen monoklonaler Antikörper zu produzieren. Danach, wenn die Zellen absterben, können die Antikörper aus dem Medium mit Ammoniumsulfat ausgefällt werden. Normalerweise interagieren Antikörper in Lösung durch hydrophile Wechselwirkungen mit Wasser. Ammonium und Sulfat sind jedoch hochgeladene Ionen, die die Wassermoleküle von den Antikörpern trennen, wodurch die Löslichkeit der Antikörper verringert wird und sie ausfallen.

Überprüfen Sie zunächst die Materialliste, und bereiten Sie zunächst alle Medien, Verbrauchsmaterialien und Arbeitsflächen für das Protokoll vor.

Dann schalten Sie ein Wasserbad ein und stellen Sie es auf 37 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter komplettes RPMI zu einem 15-Milliliter konischen Rohr und 15 Milliliter vollständiger RPMI zu einem T75-Zellkulturkolben hinzu und legen sie beiseite. Entfernen Sie mit Vorsicht und dem Tragen der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung die gefrorene Durchstechflasche, die Hybridomzellen enthält, aus der Flüssigkeitsstickstofflagerung. Um den Druck in der Durchstechflasche loszulassen, lösen Sie die Kappe leicht. Jetzt bebrüten Sie sorgfältig die Durchstechflasche im Wasserbad, um sicherzustellen, dass die Kappe über der Wasseroberfläche bleibt, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zu minimieren. Wenn die Zellen fast aufgetaut sind, was in der Regel etwa zwei Minuten dauert, bewegen Sie die Durchstechflasche zur Gewebekulturhaube.

Wischen Sie dann die Außenseite der Durchstechflasche mit 70% Ethanol ab, bevor Sie die Kappe entfernen. Übertragen Sie die Zellen mit einer sterilen Pipette in das konische Rohr, das 10 Milliliter komplettes RPMI-Medium enthält. Zentrifugieren Sie das Rohr dann für fünf Minuten bei 1200 U/min. Nach der Zentrifugation das Rohr zurück zur Gewebehaube bewegen und die Außenseite des Rohres mit Ethanol abwischen. Ohne das Pellet zu stören, entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie dann fünf Milliliter frisches komplettes RPMI-Medium und sanfte Pipette nach oben und unten hinzu, um sie wieder aufzuhängen. Als nächstes übertragen Sie die Zellen in den T75-Zellkulturkolben und legen Sie den Kolben in einen 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Lassen Sie die Zellen etwa 80% Konfluenz erreichen, was in der Regel etwa drei Tage dauert. Beachten Sie, dass Hybridomzellen nicht haftende sind und im Medium suspendiert wachsen. Die Zeit bis zur Erreichung einer ausreichenden Konfluenz kann je nach der Startzahl der lebenden Zellen und der Art der verwendeten Hybridomzelle variieren.

Sobald die Zellen ausreichend konfluent sind, verwenden Sie eine sterile 25-Milliliter-Pipette, um sie aus dem Kulturkolben in ein konisches Zentrifugenrohr zu übertragen. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 1200 U/min für fünf Minuten. Während sich die Zellen in der Zentrifuge befinden, fügen Sie 18 Milliliter vollständigen RPMI in jede der drei neuen T75-Zellkulturkolben ein und legen Sie diese beiseite. Nach der Zentrifugation den Überstand entfernen und das Zellpellet vorsichtig in sechs Millilitern kompletten RPMI wieder aufhängen. Fügen Sie als Nächstes zwei Milliliter der Zellsuspension in jeden der drei neuen Zellkulturkolben ein. Schließlich legen Sie die Kolben in einen Inkubator eingestellt 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius und inkubieren, bis die Kolben sind etwa 80% konfluent, etwa drei Tage.

An dieser Stelle sind die Zellen bereit, ihr Wachstum in dem serumfreien Medium für Hybridom-Zelllinien fortzusetzen, wie z. B. kommerziell erhältliches HB Basal Liquid Medium, das die HB101-Ergänzung enthält. Übertragen Sie die Zellen aus jedem Zellkulturkolben in konische Zentrifugenröhren und pellet die Zellen dann fünf Minuten lang durch Zentrifugation bei 1200 U/min. Fügen Sie nun 230 Milliliter ergänztes HB101-Serum-freies Medium in jeweils sechs 225-Zentimeter-Quadrat-Zellkulturkolben ein und legen Sie sie beiseite. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie jedes Pellet in 10 Milliliter nupzierten HB101 Medium. Dann, in jedem Zellkulturkolben, fügen Sie fünf Milliliter der Zellsuspension hinzu. Legen Sie die Kolben in den 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius und weiter die Zellen für etwa drei Wochen wachsen. Während dieser Zeit produzieren und geben die Zellen den monoklonalen Antikörper von Interesse in das Kulturmedium frei und der Antikörper wird bereit für die Reinigung sein, wenn die Zellen zu sterben beginnen.

Um den zellulären Schmutz aus den antikörperhaltigen Kulturmedien zu entfernen, gießen Sie den Inhalt der Kulturkolben in Rohre für einen festen Winkelrotor. Legen Sie die Rohre in den Rotor und stellen Sie sicher, dass sie vor der Zentrifugation richtig ausbalanciert sind. Drehen Sie die Rohre bei 10.000 U/min für acht Minuten. Während die Proben zentrifugieren, legen Sie einen Zweiliter-Plastikbecher mit Rührstange in einen Eiskübel und legen Sie den Eiskübel dann auf eine Rührplatte.

Als nächstes befestigen Sie eine 500-Milliliter-Filterplatte an einer Ein-Liter-Flasche. Befestigen Sie diese Flaschen-Top-Filtereinheit mit den entsprechenden Schläuchen an einem Hausvakuum. Dann gießen Sie den Überstand, der den Antikörper enthält, in die Filteroberseite. Zentrifugieren Sie die verbleibenden Medien, um die Zellablagerungen vom antikörperhaltigen Überstand zu trennen. Wenn die Filterplatte voll von Überstand ist, starten Sie das Vakuum. Wenn die Ein-Liter-Sammelflasche dann fast voll ist, entfernen Sie die Filterplatte und gießen Sie den gefilterten Überstand in den Zweiliter-Becher auf Eis. Wiederholen Sie die Filtrationsschritte, bis der gesamte Überstand verarbeitet ist.

Wenn die gesamte Probe verarbeitet ist, wiegen Sie 295 Gramm Ammoniumsulfat pro Liter gefilterten Überstands. Beginnen Sie die Rührplatte und fügen Sie das Ammoniumsulfat in den nächsten Stunden langsam dem Überstand hinzu. Dies verhindert eine lokalisierte hohe Konzentration von Ammoniumsulfatsalz, die unerwünschte Proteine ausbrechen lassen kann. Nachdem das gesamte Ammoniumsulfat zugegeben ist, bedecken Sie den Becher mit Folie und bewegen Sie es zusammen mit der Rührplatte in einen Kühlraum bei vier Grad Celsius und stellen Sie ihn so ein, dass er die Antikörperlösung über Nacht rührt.

Am nächsten Morgen die Ammoniumsulfat-haltige Antikörperlösung aus dem Zweiliterbecher in saubere Rohre für den Festwinkelrotor gießen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 6500 U/min für 20 Minuten ohne Pause, um den Antikörper an der Unterseite der Rohre zu pellet. Als nächstes, Vakuum aspirat den Überstand, mit Vorsicht nicht das weiche Pellet zu saugen. Verwenden Sie weiterhin den gleichen Satz von Rohren, um den pelletierten Antikörper aus dem Rest des Ammoniumsulfat-haltigen Überstandes zu sammeln. Nach der letzten Aspiration jedes Antikörperpellet in etwa einem Milliliter PBS wieder aussetzen.

Um das Ammoniumsulfat aus der Antikörperlösung zu entfernen, schneiden Sie zunächst etwa einen Zoll Dialyseschlauch für jeden Milliliter Antikörperlösung. Als nächstes wischen Sie die Schläuche mit destilliertem Wasser ab und binden Sie einen Knoten an einem Ende des Schlauches. Füllen Sie die Schläuche mit destilliertem Wasser, um die Leckage aus dem Knoten zu überprüfen. Wenn es nach ein paar Minuten keine Leckage gibt, entleeren Sie das Wasser aus dem Schlauch.

Als nächstes pipette die Antikörperlösung in den Schlauch. Um so viel Antikörper wie möglich zurückzugewinnen, spülen Sie die Schläuche mit zusätzlichen 0,25 MilliliterPBS ab und übertragen Sie diese auch auf die Schläuche. Sichern Sie die Oberseite des Schlauches so nah wie möglich an der Lösung mit einem Dialyseclip. Dann kleben Sie die Oberseite des Schlauches an die Außenoberseite eines Vierliter-Bechers mit dem gefüllten Teil des Schlauches, der in den Becher hängt. Nun nehmen Sie das Becherglas in den vier Grad Celsius kalten Raum und legen Sie es auf eine Rührplatte. Füllen Sie den Becher oben mit PBS und fügen Sie eine Rührstange hinzu. Lassen Sie die Röhre und die Lösung über Nacht für etwa acht Stunden rühren. Am nächsten Morgen die PBS im Becher durch frische PBS ersetzen und dann den Becher für etwa acht Stunden wieder rühren lassen. Später am Abend wiederholen Sie den Vorgang ein letztes Mal. Am Morgen das Dialyserohr öffnen und dann die Antikörperlösung aus den Schläuchen in 15-Milliliter Konusröhren übertragen. Um alle Niederschlagsmittel zu entfernen, die sich während der Dialyse gebildet haben könnten, zentrieren Sie die Rohre für fünf Minuten bei 1200 U/min. Schließlich übertragen Sie den Überstand auf frische Schläuche.

Um die Antikörperkonzentration zu quantifizieren, machen Sie zunächst eine 20-fache Verdünnung, indem Sie fünf Mikroliter aus einem Antikörper, der aliquot zu 95 Mikroliter PBS hinzufügt, hinzufügen. Dann pipette den verdünnten Antikörper in eine Küvette und verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Konzentration bei 280 Nanometern aufzuzeichnen. Berechnen Sie als Nächstes die Antikörperkonzentration mit der gezeigten Formel. Schließlich beschriften Sie Schraubverschlussfläschchen mit dem Antikörpernamen, der Konzentration, dem Herstellungsdatum und gegebenenfalls der Chargennummer und dem Experimentiernamen, und aliquotieren Sie dann den Antikörper in die beschrifteten Schraubverschlussfläschchen. Diese können bis zum Bedarf bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Beispielerträge mit der 120G8 Anti-Maus-CD317 oder PDCA-1 Hybridom-Linie reichten zwischen 44 und 99,6 Milligramm, was in der Regel ergibt, im Durchschnitt 67,3 Milligramm Menge. Es ist wichtig zu beachten, dass jeder Produktionslauf mit der gleichen Hybridom-Zelllinie in der Menge an monoklonalen Antikörpern, die am Ende verfügbar sind, leicht unterschiedlich sein kann.

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