Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

מיקרוסקופיה חיסונית
 
Click here for the English version

מיקרוסקופיה חיסונית: כתמי אימונופלואורסצנטיות של מקטעי רקמות משובצים בפרפין

Overview

מקור: תומאס צ'אפי1, תומאס ס גריפית2,3,4, וקתרין ל. שוורטפיגר1,3,4
1 המחלקה לרפואת מעבדה ופתולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
2 המחלקה לאורולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
3 מרכז הסרטן הבונים החופשיים, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455
4 המרכז לאימונולוגיה, אוניברסיטת מינסוטה, מיניאפוליס, MN 55455

ניתוחים פתולוגיים של מקטעי רקמות יכולים לשמש כדי לקבל הבנה טובה יותר של מבנה רקמות נורמלי ולתרום להבנתנו את מנגנוני המחלה. ביופסיות רקמות, בין אם מחולים או ממודלים ניסיוניים ב- vivo, נשמרות לעתים קרובות על ידי תיקון בפורמלין או paraformaldehyde והטבעה שעוות פרפין. זה מאפשר אחסון לטווח ארוך עבור הרקמות להיות חתך. רקמות נחתכות למקטעים דקים (5 מיקרומטר) באמצעות מיקרוטום והמקטעים דבקים בשקופיות זכוכית. מקטעי הרקמות יכולים להיות מוכתמים בנוגדנים, המאפשרים זיהוי של חלבונים ספציפיים בתוך מקטעי הרקמה. כתמים בנוגדנים הצמודים לפלורופורים (הידועים גם בשם פלואורוכרום) - תרכובות הפולטות אור באורכי גל ספציפיים כאשר הם מתרגשים מלייזר - ידועה בשם אימונופלואורסצנטיות. היכולת לזהות חלבונים בתוך סעיף יכולה לספק מידע כגון הטרוגניות של סוג התא בתוך הרקמה, הפעלה של מסלולי איתות ספציפיים וביטוי של סמנים ביולוגיים. בהתאם פלואורופורים בשימוש וסוג של מיקרוסקופ זמין לניתוח, צבעים מרובים ניתן להשתמש, המאפשר ניתוח multiplexed של מטרות.

הפרוטוקול הבא מתאר את הצעדים הבסיסיים הכרוכים בהכתמת אימונופלואורסצנטיות של מקטעי רקמות מוטבעים בפרפין. חשוב לציין כי פרוטוקול זה לא יכלול פרטים על קיבוע הרקמה, תהליך הטמעת פרפין או חתך של הרקמות. לאחר רקמות כבר חתך והונח על שקופיות זכוכית, הם rehydrated באמצעות סדרה של דגירות אתנול מדורג (EtOH). החלקים הם דגירה עם ריאגנט חסימה כדי להפחית כריכה לא ספציפית של נוגדן לחלק הרקמה. לאחר מכן, החלקים מסומנים בנוגדן ראשוני שעשוי או לא יכול להיות מתויג ישירות עם פלואורופור. אם הנוגדן העיקרי אינו מסומן ישירות, החלקים הם דגירה עם נוגדן משני שכותרתו פלואורופור. נוגדנים שונים עשויים לדרוש תנאי הכתמה שונים, ולכן הצעות לאופטימיזציה של נוגדנים כלולים. לאחר הכביסה כדי להסיר את כל הנוגדנים הלא מאוגדים, השקופיות מותקנות עם מדיה המכילה DAPI כדי לתייג את הגרעין באופן פלואורסצנטי. לאחר שהמדיה ההרכבה התייבשה, ניתן לדמיין את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ עם לייזרים שיכולים לזהות את הפלורופורים השונים.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הגדרת

  1. פרוטוקול הכתמים הטיפוסי כולל את השלבים הבאים:
    1. לחות מחדש של מקטעי הרקמות בשקופיות באמצעות סדרה של אתנולים מדורגים.
    2. דגירה של מקטעי הרקמה עם חוצץ חסימה, אשר יסייע לחסום כריכה לא ספציפית של נוגדן לרקמה ולהפחית פלואורסצנטיות ברקע.
    3. הסרת מאגר החסימה ודגורת החלק בנוגדן העיקרי, ואז הנוגדן יקשור את מטרת הפפטיד שלו.
    4. הסרת הנוגדן העיקרי ושטיפת החלקים בהרחבה במאגר הכביסה.
    5. דגירה של החלקים בנוגדן משני כדי לאפשר כריכה לנוגדן ראשוני, אם הנוגדן העיקרי אינו מסומן ישירות עם פלואורופור ונוגדן משני נדרש.
    6. שוטף את הנוגדן המשני מהמגלשות.
    7. הרכבת השקופיות במדיה הרכבה ומאפשרת להם להתייבש לפני הדמיה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  2. הפריטים הבאים נדרשים: מחזיקי שקופיות (זכוכית או פלסטיק), צנצנות, פיפטות, עט פאפ, תא לח, פתקי כיסוי ומדיה הרכבה עם DAPI.
  3. קסילן משמש להתייבשות של שקופיות. קסילן מסוכן ויש להשתמש בו במכסה אדים יחד עם PPE מתאים, כולל כפפות וחלוק מעבדה.
  4. מתכונים למאגרים, פתרונות ות reagents
    1. אתנולים מדורגים
      אתנול - 160 מ"ל 200 הוכחה EtOH ו 40mL ddH2O
      אתנול - 140 מ"ל 200 הוכחה EtOH ו 60mL ddH2O
    2. פתרון אחזור אנטיגן
      10 מ"מ נתרן סיטראט, pH 6.0
    3. חוסם מאגר
      סרום 100 μL מן החיה המארחת שממנו נוגדן משני נעשה
      900 מיקרול 1X PBS
      הערה: זהו אמצעי האחסון עבור 10 מקטעים; כוונן את עוצמת הקול עבור כ- 100 מאגר μL לכל מקטע, לפי הצורך.
    4. מאגר כביסה (1X PBS)

2. פרוטוקול

  1. התייבשות עם קסילן ואתנולים
    1. מקם שקופיות לתוך מחזיק שקופיות ולאחר מכן הטביע את השקופיות בפתרון 100% קסילן isomers, להבטיח כי השקופיות מכוסות לחלוטין עם פתרון.
    2. מגלשות דגירה ב-100% האיסומרים של קסילן למשך 3 דקות. חזור פעמיים עבור סך של 3 דגירה נפרדת. הקפד לנגב את מתלה השקופיות במגבת נייר לפני המעבר לפתרון חדש כדי למזער את הזיהום.
      הערה: מומלץ כי דגירה זו מבוצעת בשלוש מכולות נפרדות.
    3. דגירה שקופיות ב 100% EtOH במשך 2 דקות. חזור פעמיים עבור סך של 3 דגירה נפרדת.
      הערה: מומלץ כי דגירה זו מבוצעת בשלוש מכולות נפרדות.
    4. דגירה שקופיות ב 95% EtOH במשך 2 דקות.
    5. דגירה שקופיות ב 80% EtOH במשך 2 דקות.
    6. דגירה שקופיות ב 70% EtOH במשך 2 דקות.
    7. דגירה שקופיות ב 1X PBS במשך 5 דקות.
  2. (אופציונלי) אחזור אנטיגן כדי לחשוף אפיטופים מזוהה על ידי הנוגדן העיקרי
    הערה 1: הליך זה תלוי מאוד בנוגדן המשמש ומומלץ לבצע הליכי מיטוב ראשוניים כדי לקבוע את הדרישה לאחזור אנטיגן.
    הערה 2: הליך זה לא בוצע עם כתמי F4/80 המוצגים להלן. יש למטב את הדרישה לאחזור אנטיגן עם כל נוגדן חדש.
    1. הנח שקופיות במחזיק מגלשות פלסטיק או זכוכית עמיד בחום, והבטח שהמתלה מלא במגלשות כדי להבטיח חלוקת חום אחידה. ניתן להשתמש בשקופיות ריקות אם יש פחות דוגמאות מאשר חריצים בארון התקשורת.
    2. מקם ארון תקשורת ב 1000 מל של פתרון אנטיגן ללא חצייה ב 2L - 10 מל אנטיגן ללא חצייה מלאי כדי 990mL מים.
    3. מיקרוגל על גבוה במשך 20 דקות בסך הכל, לוודא שקופיות להישאר מכוסה במים.
    4. מצננים שקופיות במשך 20 דקות בכלוב.
    5. לשטוף את ארון התקשורת של השקופיות במחזיקי שקופיות המכילים ddH2O למשך 5 דקות כל אחד. יש לחזור פעמיים על הפעולה עבור 3 דגרות נפרדות באמצעות ddH2O טרי בכל פעם. ניתן לשטוף את השקופיות באותו מחזיק שקופיות במהלך כל שטיפה.
    6. דגירה שקופיות ב 1X PBS במשך 5 דקות.
  3. עיגול מקטעים עם עט פאפ. זה יאפשר שימוש בנפח מינימלי של חוצצים הדרושים כדי לכסות את מקטעי הרקמה. אין לאפשר לחלקי רקמות להתייבש.
  4. הוסף מאגר חסימה לכל מקטע. כמות המאגר הדרושה לכיסוי המקטע תשתנה בהתאם לגודל המקטע אך עשויה לנוע בין 25-500 μL. יש להשתמש במאגר מספיק כדי ליצור חרוז המכסה את כל משטח המקטע כולל הקצוות.
    הערה: הבחירה של חסימת מאגר עשויה להשתנות בהתאם לנוגדן הנמצא בשימוש. לדוגמה, 10% סרום מן החיה המארחת שבה הנוגדן המשני הועלה עשוי לשמש כדי להפחית כריכה לא ספציפית של הנוגדן המשני (לדוגמה, סרום עז רגיל יכול לשמש אם הנוגדן המשני גדל בעז). מיטוב של מאגר חסימה צריך להתבצע עבור כל נוגדן ראשי. כדי להכתים חלקי גידול מאמרי עם F4/80, 0.1 מ"ל של 10% סרום עזים רגיל PBS שימש.
  5. לדגור על החלקים בחסימת חוצץ בתא לח במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר או 4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות. התא הלח מבטיח שהמקטעים לא יתייבשו.
  6. הסר את מאגר החסימה על-ידי ניקוזו מהשקופית. לחלופין, ניתן להסיר את מאגר החסימה באמצעות פיפטה, אם כי הדאג לא לגעת בסעיף עם קצה הפיפטה.
  7. לדלל את הנוגדן העיקרי בחסימת מאגר.
    הערה: הדילול הנכון יצטרך להיקבע עבור כל נוגדן וסוג מדגם. אופטימיזציה תכלול ביצוע סדרה של דילול כדי לזהות כתמים אופטימליים. כדי להכתים מקטעי גידול במלאית עם F4/80, מקטעי רקמות דוגרו בן לילה ב 4°C ב 0.1 מ"ל חולדה נגד F4/80 נוגדן מדולל 1:100 ב 1% סרום עז נורמלי PBS.
  8. מוסיפים את הנוגדן העיקרי לכל מקטע ודגרים בתא לח עד 16 שעות (לילה) ב-4 מעלות צלזיוס. השאר לפחות מקטע אחד במאגר חסימה ללא נוגדן ראשוני שישמש כפקד, אשר יסייע לזהות כריכה לא ספציפית על ידי הנוגדן המשני.
  9. רוקן את הנוגדן הראשי או את מאגר החסימה מהקטע, ושטוף מקטעים עם PBS על-ידי הצבת שקופיות בארון תקשורת של שקופיות והצבת מחזיק שקופיות עם PBS 1x. לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.
  10. לדלל את הנוגדן המשני 1: 200 בחסימת מאגר. הדילול יכול להיות ממוטב בהתאם לנוגדן המשני.
  11. מוסיפים את הנוגדן המשני לכל המקטעים, כולל השליטה, ודגור במשך שעה בתא לח המוגן מפני אור.
  12. מסננים את הנוגדן המשני מהחלקים, ושטפים 3 פעמים ב- PBS במשך 10 דקות בכל פעם.
  13. הוסף 2-3 טיפות של מדיה הרכבה המכיל DAPI לשקופיות והנח כיסוי על הדגימות. אם המדיה הרכבה אינה סוג ייבוש מהיר של מדיה, ייתכן שיהיה צורך לאטום את הקצוות של השקופית עם שעוות פרפין מומסת או לק ציפורניים כדי למנוע דליפה ולשמור על הדגימות לטווח ארוך.
  14. אפשר לשקופיות להתייבש למשך הלילה בחושך, וצלם את המקטעים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

3. ניתוח נתונים ותוצאות

  1. מקטעים מוכתמים מנותחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפרטים הספציפיים של לכידת תמונה וניתוח יהיו תלויים במפרטים של המיקרוסקופ והתוכנה המשמשת לביצוע הניתוח. בדרך כלל, ניתן להצלים תמונות כתמונות בצבע בודד וחופפות ליצירת תמונות מרובות צבעים. ניתן לכמת תאים חיוביים באחוזים על-ידי ספירת מספר התאים שהוכתמו באופן חיובי וחלוקה במספר הכולל של תאים מוכתמים ב- DAPI בתוך מקטע. עבור F4/80 כתמים של מקטעי גידול מאמרי, באמצעות חבילת יישום לייקה התוכנה, גירסה 3.8, תחת הכרטיסיה רכישה ובמצב רכישת שכבת-על תמונה, DAPI ו- RFP היו שניהם זמינים. חשיפה, רווח וגאמה הותאמו (20.0 מיל', 1.0x ו- 1.53 בהתאמה עבור DAPI ו- 944.2 מיל'ור, 1.0x ו- 1.08 בהתאמה עבור RFP), אם כי הדבר משתנה בין ניסויים. לחצן 'רכוש שכבת-על' שימש ליצירת תמונות שכבת-על של חשיפות DAPI ו- RFP.
  2. התמונה שלהלן (איור 1) מציגה תמונה חיסונית לדוגמה של קטע גידול המוכתם ב- F4/80, המזהה אנטיגן על מקרופאגים ותאי מיאלואיד אחרים. המקטע נטען באמצעות מדיית הרכבה המכילה DAPI והגרעין מוצג בכחול.

הפונקציה של חלבון בתא תלויה במידה רבה לוקליזציה נכונה בתוך התא. מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית היא שיטה שבאמצעותה ניתן לדמיין חלבון בתוך תאים באמצעות צבעים פלואורסצנטיים. צבע פלואורסצנטי הוא פלואורופור, כלומר מולקולה הסופגת אנרגיית אור אורך גל מסוים על ידי תהליך הנקרא עירור, ואז משחררת מיד את האנרגיה אורך גל אחר, המכונה פליטה.

צבעים פלואורסצנטיים מצומדים לנוגדן ספציפי למטרה ומוכנסים לתאים או לרקמות בתרבית על ידי חיסון. כאשר הנוגדן העיקרי הזה נקשר לחלבון העניין, החלבון מתויג בצבע פלואורסצנטי. לחלופין, ניתן להטות את הצבע הפלואורסצנטי לנוגדן משני, במקום לנוגדן העיקרי, והנוגדן המשני נקשר לתסביך הנוגדנים העיקרי של החלבון כדי לתייג את המטרה. לאחר מכן, המדגם אטום במדיום הרכבה נגד קפדה כדי לשמר את תיוג הפלואורסצנטיות ולאחר מכן הוא מוכן להדמיה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במקור אור רב עוצמה. קרן האור עוברת תחילה דרך מסנן עירור, המאפשר רק לאור אורך הגל העירור לעבור. לאחר מכן מגיע אור העירור למראה מיוחדת, הנקראת מראה דיכרואית או מפצל קרן, אשר נועד לשקף באופן סלקטיבי את אורך גל העירור לעבר עדשה אובייקטיבית. לאחר מכן העדשה ממקדת את האור על אזור קטן במדגם. עם ההגעה לדגימה, האור מרגש את הפלורופורים, אשר פולטים את אנרגיית האור אורך גל אחר. אור זה מועבר בחזרה דרך העדשה האובייקטיבית למראה הדיכרואית. מכיוון שאורך גל הפליטה שונה מאורך גל העירור, המראה הדיכרואית מאפשרת לאור הפליטה לעבור. לאחר מכן, הוא עובר דרך מסנן שני, הנקרא מסנן הפליטה, אשר מבטל אור מכל אורכי גל אחרים שעשויים להיות נוכחים. לאחר מכן, קרני האור מגיעות כעת לעין או למצלמה, שם הן מציגות תמונה מוגדלת שנוצרה מהאור הנפלט מהפלואורופורים הספציפיים. תמונה זו מייצגת את המיקום של חלבון העניין בתוך התא.

צבעי פלואורסצנטיים מחייבי DNA משמשים לעתים קרובות יחד עם חיסונים כדי לתייג גרעינים כנקודת התייחסות בתוך התאים. פלואורופורים שונים רבים, עם אורכי גל שונים של פליטת עירור, יכולים לשמש לחלבונים שונים באותה דגימה כדי להשוות לוקליזציה של החלבונים.

וידאו זה מדגים את ההליך להכתמה חיסונית של חלבון בעל עניין בדגימת רקמה ואחריו הדמיית הדגימה במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

לפני תחילת תהליך הכתמים, החלקים, אשר התייבשו במהלך תהליך ההטבעה, צריך להיות rehydrated. כדי לעשות זאת, תחילה, מקם את השקופיות לתוך מחזיק שקופית ולאחר מכן לחלוטין להטביע את השקופיות ב 100% isomers Xlene. אפשר לשקופיות לדגור במשך שלוש דקות. לאחר מכן, להסיר את השקופיות מן המיכל, לנגב כל עודף קסילן עם מגבת נייר, ומניחים אותם לתוך אמבט קסילן חדש במיכל טרי, במשך שלוש דקות נוספות. חזור על דגירה זו בכל פעם במיכל חדש עם קסילן טרי וניגוב המגלשות במגבות נייר לפני המעבר למיכל החדש, בסך הכל שלוש דגירות. לאחר מכן, לדגור על החלקים בסדרה של פתרונות אתנול מדורג, החל 100% אתנול במשך שתי דקות. נגב את מתלה השקופיות במגבת נייר, והעביר את השקופיות למיכל חדש של 100% אתנול לשתי דקות נוספות. המשך מחזור הכביסה, ניגוב אתנול עודף במגבת נייר, והעברת השקופיות לאמבטיה חדשה, בעקבות הריכוזים המצוינים של אתנול לזמן שצוין. לאחר שטיפת האתנול הסופית, לנער את הפתרון עודף ודגורת השקופיות ב 1X PBS במשך חמש דקות.

כדי להתחיל בתהליך הכתמים, ראשית, הקיפו את המקטעים בעט PAP כדי לזהות את האזור המינימלי שהמאגרים צריכים לכסות. לאחר שהמקטעים מסומנים בבירור בשקופית, הוסף 100 מיקרוליטרים של חסימת מאגר לכל שקופית, הקפד לכסות את כל משטח המקטע. לאחר שהרקמות מכוסות בחסימת חוצץ, מניחים את השקופיות בתא לח. השאירו את השקופיות לדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר זמן הדגירה הרצוי, הסר את מאגר החסימה על ידי ניקוזו מהשקופית. לאחר מכן, לדלל את הנוגדן העיקרי בחסימת מאגר. לדילול של 1:100, הוסיפו 990 מיקרוליטרים של חיץ חסימה לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ואחריו 10 מיקרוליטרים של הנוגדן הראשי לאותו צינור. סמן שקופית אחת כפקד ולאחר מכן הוסף 100 מיקרו-לייטרים של מאגר חסימה. פקד זה יסייע בזיהוי כל כריכה לא ספציפית של הנוגדן המשני. עכשיו, להוסיף 100 microliters של מאגר נוגדנים ראשי לשקופיות הנותרות. לדגור את החלקים לילה בתא לח בארבע מעלות צלזיוס, בחושך.

לאחר הדגירה הלילית, הסירו את החלקים מהתא ונקזו את הנוגדן העיקרי מכל שקופית ואת מאגר החסימה מהבקרה. מקם את השקופיות בארון שקופיות ולאחר מכן שטוף אותן שלוש פעמים ב- PBS 1X למשך עשר דקות כל אחת. בזמן שהמגלשות נשטפות ב-PBS 1X, לדלל את הנוגדן המשני בחסימת מאגר. לדילול של 1:200, הוסיפו 995 מיקרוליטרים של חסימת חוצץ לצינור 1.5 מיליליטר, ואחריו חמישה מיקרוליטרים של הנוגדן המשני לאותו צינור. מוסיפים את הנוגדן המשני לכל המקטעים, כולל השליטה, ודגר אותם במשך שעה בתא לח המוגן מפני אור. כאשר שעון התזמן נשמע, הסר את השקופיות מהאינקובטור. מסננים את הנוגדן המשני מהמקטעים. לאחר הסרת הנוגדן המשני, מקם את השקופיות בארון תקשורת של שקופיות ולאחר מכן הטביע לחלוטין את השקופיות ב- PBS 1X למשך 10 דקות, מוגנות מפני אור. חזור על שטיפה זו שלוש פעמים, תוך שימוש ב- PBS 1X טרי לכל שטיפה. לאחר הכביסה, הוסף שתיים עד שלוש טיפות של מדיה הרכבה המכיל DAPI לכל שקופית ומניח כיסוי זכוכית על הדגימות. אפשר לשקופיות להתייבש למשך הלילה במקום חשוך לפני הדמיית המקטעים באמצעות טווח פלואורסצנטי.

במהלך ההדמיה, הפרטים של לכידת תמונה יהיו תלויים במיקרוסקופ ובתוכנה הספציפיים הזמינים. עם זאת, בדוגמה מסוימת זו, חבילת היישומים לייקה התוכנה, גירסה 3. 8, משמש לביצוע הניתוח. באמצעות תוכנית זו, לחץ על הכרטיסיה רכישה ובמצב רכישת שכבת-על של תמונה, הפעל הן DAPI והן RFP. לאחר מכן, התאם את החשיפה, הרווח וגמא הן עבור DAPI והן עבור RFP, על-ידי לקיחת תמונה ראשונית באמצעות הגדרות ברירת המחדל שהוגדרו על-ידי התוכנה ולאחר מכן אופטימיזציה לבהירות על-ידי שינוי זמן החשיפה והרווח, תוך התחשבות בכך שהגדרות אופטימליות מינימליות רצויות כדי למנוע רוויית תמונה והלבנת תמונות של הדגימות. ניתן לשנות את גאמה כדי למטב אזורים כהים יותר של תמונה.

לאחר התאמת ההגדרות, לחץ על לחצן השג שכבת-על כדי ליצור תמונות שכבת-על של חשיפות DAPI ו- RFP. תמונה לדוגמה זו, שנתפסה בטכניקה המודגמת, מציגה קטע גידול ממארי עכבר, מוכתם בנוגדן F4/80, המזהה אנטיגן, המתואר באדום, על מקרופאגים ותאי מיאלואידים אחרים. מאז נעשה שימוש במדיה הרכבה המכילה DAPI, גרעינים מוצגים בכחול. הנתונים מההדמיה יספקו מידע על עוצמת ולוקליזציה של החלבון בתוך קטע הרקמה.

לדוגמה, בתמונה של הגידול מוכתם עם F4/80, כתמי פני התא של אנטיגן זה נצפתה. נתונים אלה יכולים גם לספק מידע לגבי התדירות של אוכלוסיות תאים ספציפיות בתוך סעיף הרקמה. ניתן לכמת זאת על-ידי ספירת מספר התאים המוכתמים באופן חיובי, המוצגים כאן באדום, והשוואת זה לאוכלוסיית התאים הכוללת, המוצגת בכחול, וחישוב התדירות באמצעות המשוואה הבאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figure 1
איור 1:כתמי F4/80 של גידול בממארי. לאחר הקיבעון, גידול ממארי עכבר היה חתך ומוכתם עם אנטי F4/80 והותקן באמצעות מדיה הרכבה המכילה DAPI. כתמים מוצגים על ידי משטח התא F4/80 מכתים באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הנתונים המתקבלים מההדמיה יספקו מידע על עוצמת ולוקליזציה של הביטוי של חלבון העניין בתוך סעיף הרקמה. בהתאם לחלבון הנבדק, נתונים אלה יכולים גם לספק מידע לגבי התדירות של אוכלוסיות תאים ספציפיות בתוך קטע הרקמה. ניתן לכמת זאת על ידי ספירת מספר התאים המוכתמים באופן חיובי והשוואה עם אוכלוסיית התאים הכוללת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אימונופלואורסצנטיות מאפשרת לחקור ביטוי חלבון ולוקליזציה בהקשר של קטע רקמות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי להבין כיצד רקמות משתנות בהקשר של המחלה על ידי בחינת לוקליזציה של חלבון או מספר תאים ברקמות רגילות ומחלות. ניתן לקבוע ולקשר שינויים בשינויים בתבניות ביטוי או בתבניות ביטוי לתכונות ספציפיות של הדגימות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Im K, Mareninov S., Diaz MFP, Yong WH. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Yong W. (eds) Biobanking. Methods in Molecular Biology. 1897, Humana Press, New York, NY (2019)
  2. Ramos-Vara JA. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Gautier JC. (eds) Drug Safety Evaluation. Methods in Molecular Biology. 1641, Humana Press, New York, NY (2017)
  3. Donaldson JG. Immunofluorescence Staining. Current protocols in Cell Biology. 69 (1):1 4.3.1-4.3.7. (2015)

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter