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Microscopie de fluorescence confocale
 

Microscopie de fluorescence confocale : une technique pour déterminer la localisation des protéines dans les fibroblastes de souris

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La microscopie par fluorescence confocale est une technique d'imagerie spécialisée pour la localisation d'une protéine ou d'un antigène d'intérêt dans un échantillon de cellules ou de tissus en étiquetant l'antigène avec un colorant fluorescent conjugué par anticorps et en détectant le signal fluorescent. Il offre une résolution spatiale plus élevée que la microscopie à fluorescence à large champ, à l'aide de deux trous d'épingle placés sur les plans focaux de la lentille objective, lui donnant le nom confocal. Il permet aux utilisateurs de visualiser la coloration à un niveau subcellulaire, comme la différenciation entre la coloration de la membrane de surface de la coloration intracellulaire.

Un microscope confocal suit un principe de base semblable à un microscope classique de fluorescence. Le faisceau d'une source lumineuse, généralement un laser pour confocal, est réfléchi par un miroir dichroïque et focalisé par une lentille objective sur l'échantillon. Cette lumière excite les fluorophores à émettre une longueur d'onde différente, qui remonte à travers l'objectif objectif et miroir dichroïque à un appareil photo ou un oculaire.

La résolution améliorée d'un microscope confocal est principalement due à la présence de deux trous d'épingle, qui sont de très petits trous pour que la lumière passe à travers sur les chemins d'excitation et d'émission de lumière. Les trous d'épingle sont placés stratégiquement au plan focal de la lentille objective. Maintenant, passons à un schéma de vue latérale de l'arrangement de microscope pour examiner le chemin de lumière. Après avoir traversé le trou d'épingle de l'excitation, le faisceau lumineux d'excitation a pour effet d'être originaire d'un point focal, ce qui permet à la lentille objective de concentrer la lumière jusqu'à un point sur l'échantillon. Le faisceau d'émission de ce point focal converge vers le trou d'épingle d'émission, ce qui lui permet de passer à travers. Maintenant, pendant l'excitation, les fluorophores dans le chemin de lumière, au-dessus et au-dessous du point focal, sont également légèrement excités. Tandis que la lumière d'émission provenant du point focal passe à travers le trou d'épingle, les émissions des points hors foyer convergent avant ou après le trou d'épingle d'émission, et sont donc bloquées, ce qui entraîne une diminution de la fluorescence de fond.

Le cycle d'excitation-émission-détection doit être répété pour chaque point d'imagerie dans la région d'intérêt, ce qui peut être fait de différentes façons. Par exemple, le confocal de balayage laser emploie des miroirs de balayage de galvanomètre, qui détournent la lumière d'excitation à différents angles. Par conséquent, balayer le faisceau lumineux à travers le spécimen dans le plan XY. Spinning disc confocal utilise un disque avec un tableau de trous d'épingle, qui tourne pour déplacer l'arrangement des trous d'épingle. Cela permet aux utilisateurs d'éclairer plusieurs petits points d'imagerie dans l'échantillon à chaque fois, couvrant progressivement toute la zone pendant la rotation du disque. En raison des trous d'épingle, l'image XY au détecteur représente un plan Z étroit. Par conséquent, les images peuvent être recueillies à partir d'une série de plans Z consécutifs, souvent appelés une pile Z. À partir de ces images, un logiciel approprié peut générer une représentation 3D du modèle de signal de fluorescence dans l'échantillon.

Dans ce protocole, vous observerez l'immunostaining des fibroblastes de souris, suivi de l'imagerie sur un microscope confocal pour visualiser différentiellement une protéine de surface cellulaire et une protéine lysosomal.

Pour commencer, en utilisant des techniques stériles, resuspendre les cellules d'intérêt dans 500 microlitres de support de croissance par puits, puis les ensemencer dans les puits d'une glissière de chambre à quatre puits. Ici, nous utilisons des fibroblastes de souris qui ont été transfectés pour exprimer la molécule antigène-présentation, CD1d. Pour permettre aux cellules d'adhérer au verre, placez la glissière de chambre dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % à 37 degrés Celsius, et incuber pendant la nuit. Le matin, aspirez les médias de chaque puits, puis lavez les cellules une fois avec 500 microlitres de PBS pendant quelques secondes.

Pour fixer les cellules, ajouter 500 microlitres de solution de paraformaldéhyde de 1 % dans chaque puits, et couver pendant 15 minutes à température ambiante. Après l'incubation, recueillir le paraformaldéhyde dans un contenant de déchets liquides dangereux approprié, puis enlever les restes du fixatif en lavant les cellules trois fois avec PBS pendant quelques secondes.

Pour permettre la pénétration des anticorps dans les cellules, ajouter 500 microlitres de tampon de perméabilisation à chaque puits, et incuber sur le banc pendant 15 minutes à température ambiante. Après la perméabilisation, lavez les cellules brièvement trois fois avec 500 microlitres de PBS. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de blocage à chaque puits, et incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius pour empêcher la liaison non spécifique d'anticorps.

Préparer les anticorps primaires, anti-CD1d et anti-LAMP-1, à des concentrations de travail appropriées. Ensuite, aspirez le tampon des puits et couvrez les cellules de chaque puits avec 500 microlitres de solution d'anticorps primaire dilué, puis incubez la glissière sur une surface plane pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, diluer les anticorps secondaires, dans ce cas un anticorps anti-souris et anti-rat avec des étiquettes fluorescentes distinctes, en bloquant tampon à des concentrations de travail appropriées. Ensuite, aspirez la solution d'anticorps primaire des puits, puis lavez les cellules quatre fois avec 500 microlitres de PBS. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de la solution d'anticorps secondaire diluée à chaque puits, et incubez à température ambiante pendant une heure dans l'obscurité. Après l'incubation, aspirez la solution d'anticorps secondaire et lavez les puits quatre fois avec 500 microlitres de PBS pour enlever tout anticorps secondaire non lié.

Pour monter les échantillons après le lavage final, détachez soigneusement et retirez les chambres de la glissière. Pour enlever le PBS résiduel, maintenez la glissière à un angle au-dessus d'une lingette délicate de tâche, et retirez le fluide des bords sans toucher les cellules. Une fois que l'excès de PBS est enlevé, ajouter une goutte de milieu de montage antifade, contenant la tache nucléaire DAPI, sur chaque section de cellules. Ensuite, prenez un bordereau de 20 par 60 millimètres, et en utilisant juste le bout des doigts commencer à abaisser le bordereau lentement sur l'un ou l'autre bord, en prenant soin d'éviter la formation de bulles sur les cellules. Essuyez tout support de montage supplémentaire sur les toboggans avec une lingette délicate et rangez les lames dans l'obscurité à température ambiante jusqu'à une semaine.

Pour commencer l'imagerie des cellules, cliquez d'abord sur l'icône logicielle NIS sur le bureau. Une fois dans la fenêtre de contrôle, cliquez sur l'onglet TiPad en haut et choisissez l'objectif souhaité pour l'imagerie. Ensuite, chargez la diapositive avec des cellules sur la scène, et centrez-la sous la lentille. Ensuite, sur l'onglet A1plus Compact GUI à côté de l'onglet TiPad, configurez les lasers appropriés pour les fluorophores utilisés. Cliquez sur le symbole de l'engrenage pour ouvrir le menu de teinture et de réglages spectrals. Une fois que le menu de teinture et de réglages spectrals est ouvert, sélectionnez les canaux nécessaires et fixez le laser pour chaque canal. Ensuite, sélectionnez les émissions appropriées dans le menu de descente sous le premier miroir dichroïque. Ensuite, sous la fenêtre A1plus Compact GUI, cliquez sur Ch.Series pour configurer la série de canaux de ligne, qui configure si les lasers utilisés tireront sur l'échantillon simultanément ou séquentiellement.

Après cela, commencez à numériser en cliquant sur l'icône de pointe de flèche sur le dessus. À ce stade, pendant que l'imagerie est en direct, sous la fenêtre A1plus Compact GUI, cliquez sur l'échelle coulissante, et modifier la taille du sténopé pour assurer la limitation de la lumière hors foyer. Ensuite, ajustez les réglages de haute tension et de décalage sous chaque laser à des niveaux appropriés en utilisant les échelles coulissantes pour permettre la détection de la coloration spécifique tout en limitant toute coloration de fond potentielle. Si un échantillon de coloration positive est disponible, commencez par l'imagerie de cet échantillon pour chaque canal afin de s'assurer que les réglages laser donnent des rapports signal-bruit optimaux. Après avoir défini les valeurs HV et offset optimales pour chaque laser, cliquez sur l'onglet Acquisition ND, puis sélectionnez l'icône Z pour configurer les paramètres de la série Z.

Ensuite, tout en acquérant une image en direct de l'échantillon, d'abord définir le fond en trouvant le bas de l'image et en cliquant sur le bouton du bas. Ensuite, trouvez la position supérieure de l'échantillon et cliquez sur le bouton supérieur. Définir la taille de l'étape soit en tapant spécifiquement la taille d'étape préférée en microns pour chaque étape ou en spécifiant combien d'étapes totales sont nécessaires. Pour sélectionner la résolution de taille/pixel souhaitée de l'image, cliquez sur la fenêtre Aiplus Compact GUI, et sous l'icône de taille, sélectionnez la résolution désirée.

Pour diminuer le bruit de l'image, vous pouvez sélectionner le menu déroulant à côté du symbole theta pour faire la moyenne du nombre d'images sélectionnés. Après cela, cliquez sur l'onglet Run Now sur le menu acquisition ND afin de commencer à imagerie de l'échantillon. Une fois l'imagerie terminée, enregistrez l'image en cliquant sur le fichier, puis enregistrez comme, qui exportera le fichier d'image avec l'extension point-nd2. Enfin, répétez le processus pour chacun des autres échantillons.

Dans cette expérience, les fibroblastes de souris exprimant le gène cD1d de glycoprotéine de surface ont été fixés, immunostained, et imaged sur un microscope confocal. Cette image montre une seule section d'une pile Z à un grossissement de 40X, où le CD1d est taché en rouge. L'échantillon a été costained avec LAMP-1, un marqueur lysosomal, en vert. La tache nucléaire DAPI a été employée pour montrer les noyaux des cellules.

Dans une image composite où les trois canaux différents sont fusionnés, l'apparition de jaunes résulte du chevauchement des canaux rouges et verts, et indique une zone où CD1d et LAMP-1 sont co-localisés dans les lysosomes. Les zones où une seule couleur est présente indiquent la présence de CD1d ou LAMP-1 sans co-localisation. Cette image montre un rendu 3D des cellules construites à partir d'images capturées dans la z-pile et cette méthode a permis la construction d'une vue latérale de ce groupe de cellules. Cette image suivante montre une tranche de la z-pile au grossissement 100X, démontrant les modèles d'expression de ces deux protéines plus en détail. La boîte rose sur le côté droit de l'image affiche la section transversale de la x-coordinate désignée par la ligne rose de l'image, qui représente la vue latérale à la ligne rose. De même, la boîte bleue sur le bas de l'image montre la section transversale de la y-coordinate désignée par la ligne bleue dans l'image, qui représente la vue avant à la ligne bleue. Le rendu 3D de l'image z-stack permet aux utilisateurs de visualiser l'image en 3D, en visualisant tous les plans x, y et z. Cela peut être utilisé pour étudier la co-localisation des différentes taches à différentes régions de la cellule.

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