Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות קונפוקלית
 
Click here for the English version

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות קונפוקלית: טכניקה לקביעת לוקליזציה של חלבונים בפיברובלסטים של עכברים

Overview

מקור: דומיניק ר. בולינו1, אריק א. לגנצוב2, טוניה ג'יי ווב1
1 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מרילנד ומרכז הסרטן המקיף מרלן וסטיוארט גרינבאום, בולטימור, מרילנד 21201
2 המרכז להנדסה וטכנולוגיה ביו-רפואית, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מרילנד, בולטימור, מרילנד 21201

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות קונפוקלית היא טכניקת הדמיה המאפשרת רזולוציה אופטית מוגברת בהשוואה למיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית קונבנציונלית "רחבת שדה". מיקרוסקופים קונפוקליים מסוגלים להשיג רזולוציה אופטית משופרת x-y באמצעות "סריקת לייזר" - בדרך כלל קבוצה של מראות מבוקרות מתח (מראות גלוונומטר או "גלבו") המכוונות את תאורת הלייזר לכל פיקסל של הדגימה בכל פעם. חשוב מכך, מיקרוסקופים קונפוקליים משיגים רזולוציה z-צירית מעולה באמצעות חור סיכה כדי להסיר מאורת מיקוד שמקורה במיקומים שאינם במישור z נסרקים, ובכך מאפשרים לגלאי לאסוף נתונים ממישור z שצוין. בגלל רזולוציית z גבוהה בר השגה במיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן לאסוף תמונות מסדרה של z-planes (המכונה גם z-stack) ולבנות תמונה תלת-ממדית באמצעות תוכנה.

לפני דיון במנגנון של מיקרוסקופ קונפוקלי, חשוב לשקול כיצד מדגם אינטראקציה עם אור. האור מורכב מפוטונים, חבילות של אנרגיה אלקטרומגנטית. פוטון הפוחת במדגם ביולוגי יכול לקיים אינטראקציה עם המולקולות המרכיבות את המדגם באחת מארבע דרכים: 1) הפוטן אינו מתקשר ועובר דרך המדגם; 2) הפוטן משתקף / מפוזר; 3) הפוטון נספג על ידי מולקולה והאנרגיה הנספגת משתחררת כחום באמצעות תהליכים הידועים בשם ריקבון לא-רעיקטיבי; ו-4) הפוטן נספג והאנרגיה נספגת במהירות כפוטון משני בתהליך המכונה פלואורסצנטיות. מולקולה שהמבנה שלה מאפשר פליטת פלואורסצנטיות נקראת פלואורופור. רוב הדגימות הביולוגיות מכילות פלואורופורים אנדוגני זניחים; לכן פלואורופורים אקסוגניים חייבים לשמש כדי להדגיש תכונות של עניין במדגם. במהלך מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות, המדגם מואר באור של אורך הגל המתאים לספיגה על ידי הפלואורופור. עם ספיגת פוטון, פלואורופור הוא אמר להיות "נרגש" ואת תהליך הקליטה מכונה "עירור". כאשר פלואורופור מוותר על אנרגיה בצורה של פוטון, התהליך מכונה "פליטה", והפוטון הנפלט נקרא פלואורסצנטיות.

קרן האור המשמשת לרגש פלואורופור מתמקדת בעדשה האובייקטיבית של מיקרוסקופ ומתכנסת ב"נקודת מוקד "שבה היא ממוקדת באופן מקסימלי. מעבר לנקודת המוקד האור שוב מתפצל. ניתן לדמיין את הקורות הנכנסות והיוצאות כצמד קונוסים הנגעים בנקודת המוקד (ראו איור 1, החלונית השמאלית). תופעת עקיפה מטילה מגבלה על מידת ההדוקה של קרן אור יכולה להיות ממוקדת - הקרן מתמקדת למעשה בנקודה בגודל סופי. שני גורמים קובעים את גודל נקודת המוקד: 1) אורך הגל של האור, ו -2) את יכולת איסוף האור של העדשה האובייקטיבית, המאופיינת בצמצם המספרי שלה (NA). המוקד "ספוט" משתרע לא רק במישור x-y, אלא גם בכיוון z, והוא למעשה נפח מוקד. הממדים של אמצעי אחסון מוקדי זה מגדירים את הרזולוציה המרבית הניתנת להשגה על-ידי הדמיה אופטית. למרות שמספר הפוטונים הוא הגדול ביותר בנפח המוקד, נתיבי האור החרוטיים מעל ומתחת למוקד מכילים גם צפיפות נמוכה יותר של פוטונים. כל פלואורופור בנתיב האור יכול אפוא להתרגש. במיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית קונבנציונלית (רחבת-שדה), פליטה מפלואורופורים מעל ומתחת למישור המוקד תורמת פלואורסצנטיות מחוץ לפוקוס ("רקע מעורפל"), מה שמפחית את רזולוציית התמונה ואת הניגודיות, כפי שמדגים באיור 1, כאשר הקובייה האדומה מייצגת את פליטת הפלורופור מעל המישור המוקדי (כוכב אדום) שגורמת לפלאורסצנטיות מחוץ לפוקוס (מימין למעלה). בעיה זו משופכת במיקרוסקופיה קונפוצלית, עקב ניצול של חור סיכה. (איור 2, מימין למטה). כפי שמתואר באיור 3, חור הסיכה מאפשר לפליטות שמקורן במוקד להגיע לגלאי (משמאל), תוך חסימת הפלואורסצנטיות מחוץ לפוקוס (מימין) מלהגיע לגלאי, ובכך לשפר הן את הרזולוציה והן את הניגודיות.

Figure 1
איור 1. רזולוציה אופטית של אפיפלואורסצנטיות לעומת מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קרן האור המשמשת לרגש פלואורופור מתמקדת בעדשה האובייקטיבית של מיקרוסקופ ומתכנסת בנפח מוקד ואז מתפצלת (משמאל). הכוכב האדום מייצג את מישור המוקד של דגימה שתמונה בעוד הריבוע האדום מייצג פליטת פלואורופור מעל מישור המוקד. בעת לכידת תמונה של מדגם זה באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי, הפליטה מהכיכר האדומה מחוץ לפוקוס תהיה גלויה ותתרום ל"רקע מעורפל " (מימין למעלה). למיקרוסקופים קונפוקליים יש חור סיכה המונע גילוי אור הנפלט מחוץ למישור המוקד, ומבטל את "הרקע המעורפל" (מימין למטה).

Figure 1
איור 2. אפקט חור הסיכה במיקרוסקופיה קונפוקלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

למרות שהעוצמה הגבוהה ביותר של אור העירור נמצאת במוקד העדשה (שמאל, אליפסה אדומה), חלקים אחרים של המדגם שאינם במוקד (ימין, כוכב אדום) יקבלו אור ופלואורסצ'ה. כדי למנוע אור הנפלט מאזורים אלה מחוץ לפוקוס כדי להגיע לגלאי, מסך עם חור סיכה נמצא מול הגלאי. רק האור בפוקוס (משמאל) הנפלט ממטוס המוקד מסוגל לנוע דרך חור הסיכה ולהגיע לגלאי. האור מחוץ לפוקוס (מימין) נחסם עם חור הסיכה ואינו מצליח להגיע לגלאי.

Figure 1
איור 3. רכיבים עיקריים של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

למען הפשטות, התיאור המכניסטי של מיקרוסקופ קונפוקל יהיה מוגבל לזה של ניקון אקליפס Ti A1R. למרות ייתכנו הבדלים טכניים קלים בין מיקרוסקופים קונפוקליים שונים, A1R משמש היטב כמודל טוב לתיאור פונקציית מיקרוסקופ קונפוקלית. קרן אור העירור, המיוצרת על ידי מערך של לייזרי דיודה, משתקפת על ידי המראה הדיכרואית העיקרית אל המטרה, הממקדת את האור על הדגימה המצולמת. המראה הדיכרואית הראשית משקפת באופן סלקטיבי את אור העירור ומאפשרת לאור באורכי גל אחרים לעבור דרכם. לאחר מכן, האור נתקל במראות הסריקה שסוחפות את קרן האור על פני הדגימה באופן x-y, ומאירות פיקסל יחיד (x,Y) בכל פעם. פלואורסצנטיות הנפלטת על ידי פלואורופורים בפיקסל המואר נאספה על ידי העדשה האובייקטיבית ועוברת דרך המראה הדיכרואית הראשית כדי להגיע למערך של צינורות פוטומולטיפלייר (PMTs). מראות דיכרואיות משניות מכוונות את נורית הפליטה אל ה-PMT המתאים. אור העירור הפזור על ידי המדגם בחזרה למטרה משתקף על ידי המראה הדיכרואית הראשית בחזרה לכיוון הדגימה, ובכך נמנע מלהיכנס לנתיב אור הזיהוי ולהגיע ל-PMTs (ראו איור 3). זה מאפשר את הפלואורסצנטיות החלשה יחסית להיות כימות ללא זיהום על ידי אור מפוזרים מן קרן אור העירור, שהוא בדרך כלל סדרי גודל אינטנסיביים יותר מאשר פלואורסצנטיות. מכיוון שחור הסיכה חוסם אור מחוץ לנפח המוקד, האור המגיע לגלאי מגיע ממטוס zצר ונבחר. לכן, ניתן לאסוף תמונות מסדרה של מטוסי zסמוכים; סדרת תמונות זו מכונה לעתים קרובות 'z-stack'. באמצעות התוכנה המתאימה, z-stack ניתן לעבד כדי ליצור תמונה 3D של הדגימה. יתרון מסוים של מיקרוסקופיה קונפוקלית הוא היכולת להבחין בין לוקליזציה תת-תאית של כתמים. לדוגמה, ההבחנה בין מכתים ממברנה מכתמים תאיים, וזה מאוד מאתגר עם מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית קונבנציונלית (1, 2, 3).

הכנת מדגם היא היבט חשוב של הדמיה קונפוקלית. חוזק של טכניקות מיקרוסקופיה אופטית הוא הגמישות לתמונה של תאים חיים או קבועים. בעת ניסיון לייצר תמונות תלת-ממד, בגלל מספר התמונות שיש לרכוש עבור z-stack, הקושי לשמור על בריאות התא, ואת התנועה של תאים חיים organelles שלהם, השימוש בתאים קבועים אופייני. ההליך לתיקון והכתמת תאים לפלואורסצנטיות קונפוצלית דומה לזה המשמש באופן קונבנציונלי באימונופלואורסצנטיות. לאחר תרבית בשקופיות הקאמריות או על כיסויים, התאים קבועים באמצעות paraformaldehyde כדי לשמר את המורפולוגיה התאית. כריכת נוגדנים לא ספציפית נחסמת באמצעות אלבומין בסרום בקר, חלב או סרום רגיל. על מנת לשמור על הספציפיות של הנוגדנים המשניים, הפתרון המשמש לא צריך להיות מאותו מין שבו נוצרו הנוגדנים העיקריים. התאים דוגרים בנוגדנים ראשוניים שקושרים את האנטיגן של עניין. בעת סימון מספר מטרות תאיות, הנוגדנים העיקריים חייבים להיגזר כל אחד ממין אחר. נוגדנים המתייגים אנטיגן קשורים לאחר מכן בנוגדנים משניים מצומדים פלואורופור. נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור יש לבחור כך שהם תואמים לאורכי הגל של עירור לייזר זמין במיקרוסקופ הקונפוקלי. כאשר מדמיינים אנטיגנים מרובים, ספקטרום העירור/ הפליטה של הפלורופורים צריך להיות שונה מספיק, כך האותות שלהם ניתן להפלות על ידי ניתוח מיקרוסקופי. הדגימה המוכתמת מותקנת לאחר מכן על שקופית להדמיה. מדיום הרכבה משמש למניעת התייבשות של פוטו-דגימות. אם תרצה, ניתן להשתמש במדיום הרכבה המכיל כתם נגד גרעיני (למשל DAPI או Hoechst) (4).

בפרוטוקול הבא, פיברובלסטים עכבר transfected כדי לבטא CD1d (LCD1) היו מוכתמים בנוגדנים המזהים CD1d ו CD107a (LAMP-1). CD1d הוא קומפלקס היסטו-תאימות גדול 1 (MHC 1)דמוי קולטן נוכח על פני השטח של אנטיגן מציג תאים המציגים אנטיגנים שומנים בדם. LAMP-1 (חלבון ממברנה הקשורים ליזומלית-1) הוא חלבון טרנס-מברן הנמצא בעיקר בממברנות ליזומליות. עבור מצגת אנטיגן נכונה, CD1d נסחר דרך תא ליסומלי pH נמוך, כך LAMP-1 משמש כסמן של התא הליסומלי עבור פרוטוקול זה. על ידי בדיקות תאי LCD1 עם אנטי CD1d ו- ANTI-LAMP-1 שיוצרו במינים שונים, נוגדנים משניים עם פלואורופורים ייחודיים יכולים לשמש כדי לקבוע את לוקליזציה של כל חלבון בתא והאם CD1d קיים בתאים ליזוזום חיובי LAMP-1.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. חומרים

מאגרי

  1. חוצץ כביסה: 1 X תמיסת מלח סטרילית חוצצת פוספט (PBS) ללא סידן או מגנזיום
  2. מאגר קיבעון: 1% paraformaldehyde ב- PBS
  3. מאגר פרמזביליזציה: 0.1% טריטון X-100 ב- PBS
  4. חוסם חוצץ: 1% אלבומין סרום בקר ב- PBS
  5. בינוני לצמיחת תאים: DMEM בתוספת סרום בקר עוברי 10% (FBS), פניצילין/סטרפטומיצין ו-L-גלוטמין

ציוד

  1. מכסה המנוע של זרימה למינאר
  2. אינקובטור לח (37°C, 5% CO2)
  3. מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלית; הנה, ניקון ליקוי חמה Ti לייזר

חומרים ריגנטים

  1. שקופיות של תרבית תאים קאמרית
  2. מדיה נגד עמעום הרכבה עם DAPI (להכתמת גרעינים)
  3. זכוכית כיסוי מיקרוסקופ
  4. מגבוני משימה עדינים
  5. פיפטורים וטיפים

ריאגנטים ספציפיים לאסיי

  1. תאים חסידיים (תאים ראשיים או שורות תאים); כאן, פיברובלסטים עכבר transfected עם CD1d שימשו (LCD1).
  2. נוגדנים עיקריים לזיהוי מטרות תאיות; כאן, עכברוש נגד עכבר CD107a (LAMP-1) ועכבר נגד עכבר CD1d שימשו.
  3. נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור ספציפיים לאיזוטיפים נוגדנים ראשוניים; כאן אנטי חולדה IgG מצומד אל Alexafluor 488 ו נגד עכבר IgG מצומד אל Alexafluor 647 שימשו.

2. פרוטוקול

הכנה להכתמת נוגדנים

זריעת תאים

  1. resuspend התאים של עניין בתקשורת הצמיחה.
  2. לאחר מכן, זרע 500 μL של השעיית התא / לכל באר לתוך בארות של שקופית תא 4-טוב. (כאן, תאי LCD1 נזרעו ב 2.5x105 תאים / תא ב 500 μL של מדיה צמיחה. צפיפות הזריעה עשויה להשתנות בין קווי תאים).
  3. לדגור על החלקה התא לילה באינקובטור 5% CO2 ב 37°C, כדי לאפשר לתאים לדבוק בכוס.
  4. למחרת, לשאוף את המדיה מכל באר ולאחר מכן לשטוף את התאים 1X עם 500 μL PBS.

קיבוע

  1. כדי לתקן את התאים, להוסיף 500 μL 1% פתרון paraformaldehyde לתוך כל באר ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. לאחר הדגירה, לאסוף את paraformaldehyde לתוך מיכל פסולת נוזלית מסוכנת מתאימה.
  3. לאחר מכן, לשטוף את התאים 3 פעמים עם 500 μL PBS כדי להסיר את כל שרידי הקיבעון.

פרמזביליזציה

  1. Permeabilize התאים על ידי דגירה עם 500 μL permeabilization חוצץ / באר במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. לאחר מכן, לשטוף את התאים לזמן קצר 3 פעמים עם 500 μL של PBS.

חסימת

  1. לדגור על התאים בכל באר עם 500 μL חסימת חוצץ במשך 1 שעה ב 4 ° C, כדי לחסום כריכת נוגדנים ספציפית.

דגירה ראשונית של נוגדנים

  1. שאף את מאגר החסימה מתאי השקופיות.
  2. לאחר מכן, להוסיף 500 μL של פתרון נוגדנים ראשוני מדולל לתאים. (כאן, אנטי CD107a (LAMP-1) היה מדולל 1:500 ו anti-CD1d שימש לא מדולל (נוגדן חד שבטי 1H6 סופק בחביבות על ידי ד"ר רנדי Brutkiewicz)).
  3. לדגור את השקופיות בלילה ב 4°C.

הערה: אם אתם מחפשים יותר מיעד אחד, ודאו שהנוגדנים העיקריים הם איזוטיפים שונים. ריכוזי הנוגדנים המומלצים משתנים בין היצרנים ויש לתבל לפני השימוש.

דגירה משנית של נוגדנים

  1. שאפו את תמיסת הנוגדנים העיקרית מהבארות.
  2. לשטוף את תאי הבאר 4 פעמים עם 500 μL PBS.
  3. לאחר מכן, להוסיף 500 μL של פתרון נוגדנים משני מדולל לכל באר. (כאן, הן הנוגדנים המשניים - אנטי עכבר IgG Alexafluor 647 ו נגד חולדה IgG Alexafluor 488 היו מדוללים 1:2000 במאגר חסימה).
  4. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה בחושך.
  5. לאחר הדגירה, שאפו את תמיסה נוגדן משני.
  6. לשטוף את התאים 4 פעמים עם 500 μL PBS כדי להסיר כל נוגדן משני מאוגד.

הערה: ריכוזי הנוגדנים המומלצים משתנים בין היצרנים ויש לצייץ לפני השימוש. אם מחפשים יותר מיעד אחד, יש להטות נוגדנים משניים לפלורופורים שונים עם ספקטרום עירור/פליטה ייחודי. כמו כן, זכור את העירור / פליטה של הנגד הגרעיני (כלומר DAPI) בעת בחירת פלואורופורים. בחירת פלואורופור עשויה להיות מושפעת מתצורת הלייזר של המיקרוסקופ הקונפוקלי המשמש. תצורת הלייזר של המכונה תכתיב אילו פלואורופורים מתאימים לניסוי.

3. כיסויי הרכבה

  1. ראשית, הסר בזהירות את התאים מהשקופית.
  2. לאחר מכן, החזק את השקופית בזווית מעל מחיקת משימה עדינה והסר את הנוזל מהקצוות מבלי לגעת בתאים.
  3. הוסף טיפה אחת של מדיום הרכבה נגד דבק, המכיל את הכתם הגרעיני DAPI, על כל חלק של תאים.
  4. לאחר מכן, מניחים כיסוי 20 מ"מ x 60 מ"מ מעל השקופית על ידי החזקתה מעל הקצוות באמצעות קצות האצבעות. (הימנע היווצרות בועה על התאים, כפי שהם מפריעים הדמיה).
  5. נגב את כל מדיום הרכבה נוסף בצדדים עם ניגוב משימה עדין ולאחסן את השקופיות בחושך בטמפרטורת החדר עד שבוע.

4. הדמיה קונפוקלית

דגימות תמונה על מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. לנתונים המוצגים באיור 2, נעשה שימוש ב-Nikon Eclipse Ti A1R עם תוכנת מחקר מתקדם של אלמנטים שקלים. הסעיף הבא מפרט את ההליך ללכידת תמונות באמצעות התוכנה הנ"ל.

  1. כדי להתחיל להדמיה את התאים, פתחו אתתוכנת 'מחקר מתקדם של אלמנטים ש"ח'על ידי לחיצה על'סמל התוכנה NIS'.
  2. לאחר מכן, בחלון הבקרה לחץ על הכרטיסיה 'TiPad' ובחר את המטרה הרצויה להדמיה. (כאן, המטרה הראשונה 40x שימש).
  3. טען את השקופית עם תאים על הבמה ומרכז אותה מתחת לעדשה.
  4. עכשיו, בכרטיסייה 'A1plus Compact GUI', הגדר את הלייזרים המתאימים לפלורופורים המשמשים. לחץ על סמל גלגל השיניים כדי לפתוח את תפריט הצבע וההגדרות הספקטרליות ולבחור את הערוצים הדרושים ולהגדיר את הלייזר לכל ערוץ.
  5. לאחר מכן, בחר את הפליטות המתאימות בתפריט הנפתח תחת המראה הדיכרואית הראשונה.
  6. לאחר מכן, תחת חלון 'A1plus Compact GUI', לחץ על 'סדרת Ch.' כדי להגדיר את סדרת ערוצי הקו, המגדירה אם הלייזרים המשמשים יורים על המדגם בו זמנית או ברצף. (כאן נבחרו מעברים רצפים, החל מערוץ 1, ואחריו ערוץ 2, ואז 4).
  7. לאחר מכן, התחל לסרוק על-ידי לחיצה על סמל 'קצה החץ' בחלק העליון. בשלב זה, כאשר ההדמיה חיה, תחת חלון 'A1plus Compact GUI', לחץ על סולם ההזזה ושנה את גודל חור הסיכה כדי להבטיח הגבלה מחוץ לאור המיקוד. (כאן נעשה שימוש בהגדרה הזמינה הנמוכה ביותר (0.5).
  8. לאחר מכן, התאם את הגדרות 'המתח הגבוה' ו'היסט' מתחת לכל לייזר לרמות המתאימות, באמצעות סולמות ההזזה כדי לאפשר זיהוי של הכתמים הספציפיים תוך הגבלת כל כתמי רקע פוטנציאליים. אם קיימת דגימה עם כתמים חיוביים, התחל בהדמיית דגימה זו עבור כל ערוץ כדי לוודא שהגדרות הלייזר מניבות יחסי אות ורעשי אופטימליים.
    אזהרה: עוצמת לייזר גבוהה לתקופות ממושכות עלולה לגרום להלבנה.
  9. לאחר הגדרת ערכי HV והיסט אופטימליים עבור כל לייזר, לחץ על הכרטיסיה 'רכישת ND' ולאחר מכן בחר את סמל 'Z' כדי להגדיר את הפרמטרים עבור סדרת z. לאחר מכן, בעת רכישת תמונה חיה של המדגם, הגדר תחילה את החלק התחתון על ידי מציאת תחתית התמונה ולחיצה על לחצן 'התחתון' ולאחר מכן מצא את המיקום העליון של המדגם ולחץ על לחצן 'עליון'. הגדר את גודל השלב על-ידי הקלדה ספציפית של גודל השלב המועדף ב- μm עבור כל שלב או על-ידי ציון מספר השלבים הכולל הדרושים.
  10. לאחר הגדרת הפרמטרים של סידרת z, בחרו ברזולוציית הגודל/הפיקסלים הרצויה של התמונה. כדי לעשות זאת, לחץ על החלון 'A1plus Compact GUI' ותחת הסמל 'גודל' בחר את הרזולוציה הרצויה. כדי להקטין את רעש התמונה, ניתן לבחור את התפריט הנפתח לצד הסימן 'ø' כדי לממוצע את מספר התמונות שנבחר.
  11. כעת, לחץ על הכרטיסיה 'הפעל כעת' בתפריט 'רכישת ND' כדי להתחיל להדמיה את הדוגמה.
  12. לאחר השלמת ההדמיה, שמור את התמונה על-ידי לחיצה על 'קובץ'ולאחר מכן 'שמירה בשם', אשר ייצא את קובץ התמונה עם הסיומת '.nd2'. לבסוף, חזור על התהליך עבור כל אחת מהדגימות האחרות.

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות קונפוקלית היא טכניקת הדמיה מיוחדת לוקליזציה של חלבון או אנטיגן של עניין בדגימת תא או רקמה על ידי תיוג האנטיגן עם צבע פלואורסצנטי מצומד נוגדנים וזיהוי האות הפלואורסצנטי. הוא מציע רזולוציה מרחבית גבוהה יותר מאשר מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות רחבת שדה, בעזרת שני חורי סיכה שהוצבו במישורי המוקד של העדשה האובייקטיבית, המעניקים לו את השם confocal. זה מאפשר למשתמשים לדמיין את הכתמים ברמה תת תאית, כגון ההבחנה בין מכתים קרום פני השטח מכתמים תאיים.

מיקרוסקופ קונפוקלי פועל על פי עיקרון בסיסי דומה למיקרוסקופ פלואורסצנטי קלאסי. הקרן ממקור אור, בדרך כלל לייזר לקונפוקל, משתקפת על ידי מראה דיכרואית וממוקדת בעדשה אובייקטיבית על המדגם. אור זה מרגש את הפלורופורים לפלוט אורך גל שונה, אשר נע חזרה דרך העדשה האובייקטיבית ואת המראה dichroic למצלמה או לעין.

הרזולוציה המשופרת של מיקרוסקופ קונפוקלי נובעת בעיקר מנוכחותם של שני חורי סיכה, שהם חורים קטנים מאוד עבור האור לעבור על נתיבי האור העירור והפליטה. חורי הסיכה ממוקמים אסטרטגית במישור המוקד של העדשה האובייקטיבית. כעת, בואו נעבור לתצוגה צדדית של סידור המיקרוסקופ כדי לסקור את נתיב האור. לאחר שעבר דרך חור הסיכה עירור, קרן אור העירור יש את ההשפעה של מקורו מנקודת המוקד, אשר מאפשר עדשה אובייקטיבית אז למקד את האור לנקודה על המדגם גם כן. קרן הפליטה מנקודת מוקד זו מתכנסת בחור פין הפליטה, המאפשר לו לעבור. עכשיו במהלך עירור, פלואורופורים בתוך נתיב האור, מעל ומתחת לנקודת המוקד, הם גם קצת נרגשים. בעוד שאור הפליטה שמקורו בנקודת המוקד עובר דרך חור הסיכה, הפליטות מנקודות המיקוד שאינן ממוקדות מתכנסות לפני או אחרי חור הפליטה, ולכן נחסמות, וכתוצאה מכך פלורסצנטיות רקע מופחתת.

מחזור גילוי פליטת העירור צריך לחזור על עצמו עבור כל נקודת הדמיה באזור העניין, אשר ניתן לעשות בכמה דרכים שונות. לדוגמה, קונפוקלי סריקת לייזר משתמש במראות סריקת גלוונומטר, אשר להסיט את אור העירור בזוויות שונות. לפיכך, סוחף את קרן האור על פני הדגימה במישור XY. ספינינג דיסק confocal משתמש בדיסק עם מערך של חורי סיכה, אשר מסתובב כדי להזיז את הסידור של חורי הסיכה. הדבר מאפשר למשתמשים להאיר מספר נקודות הדמיה קטנות במדגם בכל פעם, המכסות בהדרגה את כל האזור כאשר הדיסק מסתובב. כתוצאה מהחורים, תמונת ה-XY בגלאי מייצגת מישור Z צר. לכן, ניתן לאסוף תמונות מסדרה של מטוסי Z רצופים, המכונים לעתים קרובות מחסנית Z. מתמונות אלה, תוכנה מתאימה יכולה ליצור תיאור תלת-ממדי של תבנית אות הפלואורסצנטיות במדגם.

בפרוטוקול זה, תוכלו לצפות בחיסון של פיברובלסטים של עכברים, ואחריו הדמיה על מיקרוסקופ קונפוקל כדי לדמיין באופן דיפרנציאלי חלבון פני השטח של התא וחלבון ליזומלי.

כדי להתחיל, באמצעות טכניקות סטריליות, resuspend התאים של עניין 500 microliters של מדיה צמיחה לכל טוב, ולאחר מכן לזרוע אותם לתוך בארות של שקופית תא ארבע בארות. כאן, אנו משתמשים פיברובלסטים עכבר כי היו transfected כדי לבטא את המולקולה אנטיגן מציג, CD1d. כדי לאפשר לתאים לדבוק בזכוכית, מניחים את החלקה התאית באינקובטור פחמן דו חמצני של 5% ב-37 מעלות צלזיוס, ודגרה בן לילה. בבוקר, לשאוף את התקשורת מכל באר, ולאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת עם 500 microliters של PBS במשך כמה שניות.

כדי לתקן את התאים, להוסיף 500 microliters של 1% פתרון paraformaldehyde לתוך כל באר, ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, לאסוף את paraformaldehyde לתוך מיכל פסולת נוזלי מסוכן מתאים, ולאחר מכן להסיר את כל שרידי הקיבעון על ידי שטיפת התאים שלוש פעמים עם PBS במשך כמה שניות.

כדי לאפשר חדירת נוגדנים לתאים, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של חוצץ פרמביליזציה לכל באר, ודגרו על הספסל במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר permeabilization, לשטוף את התאים לזמן קצר שלוש פעמים עם 500 microliters של PBS. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של חוצץ חסימה לכל באר, ודגור במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי למנוע כריכת נוגדנים לא מינית.

הכן את הנוגדנים העיקריים, אנטי CD1d ו anti-LAMP-1, בריכוזים מתאימים לעבודה. לאחר מכן, שאפו את החיץ מהבארות וכיסו את התאים בכל באר עם 500 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים ראשונית מדוללת ואז לדגור על משטח שטוח בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לדלל את הנוגדנים המשניים, במקרה זה נוגדן נגד עכברים ואנטי חולדות עם תגי פלורסנט ברורים, בחסימת חוצץ לריכוזים מתאימים בעבודה. לאחר מכן, שאפו את תמיסת הנוגדנים העיקרית מהבארות ולאחר מכן שטפו את התאים ארבע פעמים עם 500 מיקרוליטרים של PBS. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של פתרון נוגדנים משני מדולל לכל באר, ודגור בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת בחושך. לאחר הדגירה, שאפו את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטפו את הבארות ארבע פעמים עם 500 מיקרוליטרים של PBS כדי להסיר כל נוגדן משני לא מאוגד.

כדי לטעון את הדגימות לאחר הכביסה הסופית, לנתק בזהירות ולהסיר את התאים מן השקופית. כדי להסיר את שאריות ה-PBS, החזק את השקופית בזווית מעל מחיקת משימה עדינה, והסר את הנוזל מהקצוות מבלי לגעת בתאים. לאחר הסרת ה-PBS העודף, הוסף טיפה אחת של מדיום הרכבה נגד דבק, המכיל את הכתם הגרעיני DAPI, על כל חלק של התאים. לאחר מכן, יש ליטול כיסוי של 20 על 60 מ"מ, ובעזרת קצות האצבעות בלבד מתחילים להוריד את כיסוי הכיסוי לאט משני קצות, תוך שמירה על הימנעות מהיווצרות בועה מעל התאים. נגב את כל מדיום ההרכבה הנוסף על השקופיות עם ניגוב משימה עדין ולאחסן את השקופיות בחושך בטמפרטורת החדר עד שבוע.

כדי להתחיל להדמיה את התאים, לחץ תחילה על סמל התוכנה NIS בשולחן העבודה. פעם אחת בחלון הבקרה, לחץ על הכרטיסיה TiPad בחלק העליון ובחר את המטרה הרצויה להדמיה. לאחר מכן, טען את השקופית בתאים על הבמה ומרכז אותה מתחת לעדשה. לאחר מכן, בכרטיסיה A1plus Compact GUI לצד הכרטיסיה TiPad, הגדר את הלייזרים המתאימים לפלואורופורים בהם נעשה שימוש. לחץ על סמל גלגל השיניים כדי לפתוח את צבע ותפריט הגדרות ספקטרליות. לאחר פתיחת תפריט הצבע וההגדרות הספקטרליות, בחר את הערוצים הדרושים והגדר את הלייזר עבור כל ערוץ. לאחר מכן, בחר את הפליטות המתאימות בתפריט הנפתח תחת המראה הדיכרואית הראשונה. לאחר מכן, תחת חלון A1plus Compact GUI, לחץ על Ch.Series כדי להגדיר את סדרת ערוץ הקו, אשר מגדיר אם הלייזרים המשמשים יורים על המדגם בו זמנית או ברצף.

לאחר מכן, התחל לסרוק על-ידי לחיצה על סמל קצה החץ בחלק העליון. בשלב זה, בעוד ההדמיה היא חיה, תחת חלון A1plus Compact GUI, לחץ על סולם הזזה, ולשנות את גודל חור הסיכה כדי להבטיח הגבלת אור מחוץ לפוקוס. לאחר מכן, התאם את הגדרות המתח הגבוה וההיסט מתחת לכל לייזר לרמות המתאימות באמצעות סולמות ההזזה כדי לאפשר זיהוי של הכתמים הספציפיים תוך הגבלת כל כתמי רקע פוטנציאליים. אם קיימת דגימת כתמים חיובית, התחל על-ידי הדמיית דגימה זו עבור כל ערוץ כדי לוודא שהגדרות הלייזר מניבות יחסי אות לרעש אופטימליים. לאחר הגדרת ערכי HV והיסט אופטימליים עבור כל לייזר, לחץ על הכרטיסיה רכישת ND ולאחר מכן בחר בסמל Z כדי להגדיר את הפרמטרים עבור סידרת z.

לאחר מכן, בעת רכישת תמונה חיה של המדגם, הגדר תחילה את התחתית על-ידי מציאת תחתית התמונה ולחיצה על הכפתור התחתון. לאחר מכן, מצא את המיקום העליון של המדגם ולחץ על הלחצן העליון. הגדר את גודל השלב על-ידי הקלדה ספציפית של גודל השלב המועדף במיקרונים עבור כל שלב או על-ידי ציון מספר השלבים הכולל הדרושים. לבחירת גודל/פיקסל הרצוי של התמונה, לחץ על החלון Aiplus Compact GUI ותחת סמל הגודל, בחר את הרזולוציה הרצויה.

כדי להקטין את רעש התמונה, ניתן לבחור בתפריט הנפתח לצד סמל הטטה כדי לממוצע את מספר התמונות שנבחר. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסיה הפעל כעת בתפריט רכישת ND כדי להתחיל להדמיה את הדוגמה. לאחר השלמת ההדמיה, שמור את התמונה על-ידי לחיצה על הקובץ ולאחר מכן שמור בשם, אשר ייצא את קובץ התמונה עם הסיומת dot-nd2. לבסוף, חזור על התהליך עבור כל אחת מהדגימות האחרות.

בניסוי זה, פיברובלסטים עכבר מבטאים את פני השטח גליקופרוטאין גן CD1d תוקנו, חיסונים, ותמונה על מיקרוסקופ קונפוקל. תמונה זו מציגה מקטע יחיד של מחסנית Z בהגדלה של פי 40, כאשר CD1d מוכתם באדום. המדגם היה costained עם LAMP-1, סמן ליסום, בירוק. כתם גרעיני DAPI שימש כדי להראות את הגרעינים של התאים.

בתמונה מורכבת שבה ממוזגים שלושת הערוצים השונים, הופעת הצהוב נובעת מחפיפה של הערוצים האדומים והירוקים, ומציינת אזור שבו CD1d ו- LAMP-1 הם לוקליים משותפים בליזוזומים. אזורים שבהם קיים צבע אחד בלבד מציינים את נוכחותם של CD1d או LAMP-1 ללא לוקליזציה משותפת. תמונה זו מציגה עיבוד תלת-ממדי של התאים הבנויים מתמונות שנלכדו בערימת z ושיטה זו אפשרה בניית תצוגה צדדית של קבוצת תאים זו. תמונה זו מציגה פרוסה מתוך ערימת z בהגדלה של פי 100, ומדגימה את דפוסי הביטוי של שני חלבונים אלה בפירוט רב יותר. התיבה עם קווי המתאר הוורודים בצד ימין של התמונה מציגה את החלק הצולב של קואורדינטת ה- x המיועדת לקו הוורוד בתמונה, המייצג את התצוגה הצדדית בקו הוורוד. באופן דומה, התיבה עם קווי המתאר הכחולים בתחתית התמונה מציגה את החלק הצולב של קואורדינטת ה- y המיועדת על-ידי הקו הכחול בתמונה, המייצגת את התצוגה הקדמית בקו הכחול. העיבוד בתלת-ממד של תמונת הערימה z מאפשר למשתמשים להציג את התמונה בתלת-ממד, ומדמיין את כל המישורים x, y ו- z. זה יכול לשמש כדי ללמוד לוקליזציה משותפת של כתמים שונים באזורים שונים בתוך התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בניסוי זה, פיברובלסטים עכבר מבטאים את פני השטח גליקופרוטאין גן CD1d תוקנו, חיסונים ותמונה על מיקרוסקופ קונפוקלי. תמונה מייצגת המתקבלת באמצעות הפרוטוקול שלעיל מוצגת באיור 4. בחלונית העליונה של A מוצגות תמונות בעלות ערוץ יחיד המציגות את תבנית הכתמים של כל יעד בודד. תמונות אלה מהוות מקטע יחיד (פרוסה) של ערימת z שנלכדה. החלונית הימנית מציגה כתמי DAPI של גרעיני התאים. הלוחות המרכזיים מראים CD1d מוכתם באדום ו LAMP-1, סמן ליסום, מוכתם בירוק. החלונית השמאלית היא תמונה מורכבת שבה ממוזגים שלושת הערוצים השונים. המראה של צהוב נובע מחפיפה של הערוצים האדומים והירוקים, ומציין אזור שבו CD1d ו- LAMP-1 הם לוקליים משותפים. תוצאות הכתמים מאשרות כי CD1d הוא מקומי בתאים אנדוסומלית LAMP-1+ . ישנם גם אזורים שבהם קיים רק צבע אחד, המציין את נוכחותם של CD1d או LAMP-1 ללא לוקליזציה משותפת. החלונית התחתונה של A מציגה עיבוד תלת-ממדי של התאים הבנויים מתמונות שנלכדו בערימת z.

לוח B מציג פרוסה מתוך ערימת z בהגדלה של פי 100 המדגימה את דפוסי הביטוי של שני חלבונים אלה בפירוט רב יותר. התיבה עם קווי המתאר הוורודים בצד ימין של התמונה מציגה את החלק הצולב של קואורדינטת ה- x המיועדת לקו הוורוד בתמונה, המייצג את התצוגה הצדדית בקו הוורוד. באופן דומה, התיבה עם קווי המתאר הכחולים בתחתית התמונה מציגה את החלק הצולב של קואורדינטת ה- y המיועדת על-ידי הקו הכחול בתמונה, המייצגת את התצוגה הקדמית בקו הכחול. העיבוד בתלת-ממד של תמונת הערימה z מאפשר למשתמשים להציג את התמונה בתלת-ממד, ומדמיין את כל מישורי x, y ו- z.

Figure 4
איור 4: הכתמת CD1d ו-LAMP1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

A, החלונית העליונה: תאי LCD1 תוקנו, חדרו והוכתמו בנוגדנים ל- CD1d (אדום) ו- LAMP-1 (ירוק, סמן של התא ליזומלי). DAPI (כחול, שימש להדמיה של הגרעין). המיזוג (החלונית השמאלית) מראה כי CD1d הוא localized בתא האנוסומאלי המאוחר /ליסוסום חיובי LAMP-1 (צהוב).
A, החלונית התחתונה: עיבוד תלת-ממדי של אותם תאים בחלונית העליונה. התמונות נרכשו באמצעות יעד טבילת שמן פי 40 על ניקון אקליפס Ti, באמצעות תוכנת המחקר המתקדמת של אלמנטים NIS.
B: תמונה 100x של תאי LCD1d מוכתמים כמו ב- A, עם מידע מחסנית עבור קואורדינטת y מסוימת (המסוימת על ידי הקו הכחול) בתחתית התמונה (תיבה כחולה). מידע המחסנית עבור קואורדינטת x מסוימת (המסומנים על-ידי הקו הוורוד) מוצג בצד ימין של התמונה (תיבה ורודה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כתמי פלואורסצנטי קונפוקלי הוא הליך פשוט יחסית המביא לתמונות באיכות גבוהה מאוד של דגימות המוכנות באופן דומה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית. בקצרה, הדגימות קבועות, מחלחלות, ואז נחסמות. נוגדנים ראשוניים נגד חלבון או חלבונים בעלי עניין מותרים להיקשר, ואז נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור משמשים כדי לדמיין את הכתמים. למיקרוסקופיית פלואורסצנטיות קונפוצלית יש יישומים בתחומים רבים של מחקר. לדוגמה, על ידי כתמים עבור סמנים של אברונים תת-תאיים יחד עם חלבון של עניין, מיקרוסקופיה קונפוקלית יכולה לשמש כדי לקבוע את המיקומים התת-תאיים של חלבונים מגוונים. בהשוואה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית, הדמיה קונפוקלית יכולה להבחין בצורה יעילה יותר בין פני השטח של התא למיקום תאי של חלבון. בנוסף, ניתן להשתמש בהדמיה קונפוקלית גם כדי לקבוע אם שני חלבונים שותפים לוקליזציה בתוך התא. למרות שלא מתואר בפרוטוקול זה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית confocal יכול להתבצע גם על תאים חיים כדי לזהות שינויים דינמיים.

Video 1
וידאו 1: וידאו שנוצר בתוכנת מחקר מתקדם של רכיבי NIS, המדגיש את היכולת לנוע דרך עיבוד תלת מימדי של התמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Claxton, N. S., Fellers, T. J. and Davidson, M. W. Laser scanning confocal microscopy. Department of Optical Microscopy and Digital Imaging, National High Magnetic Field Laboratory, Florida State University, 37 p., Unpublished (2010). Available at- http://www.vertilon.com/pdf/PP6207.pdf.
  2. Ojcius, D. M., Niedergang, F., Subtil, A., Hellio, R. and Dautry-Varsat, A. Immunology and the confocal microscope. Research in Immunology, 147 (3),175-88 (1996).
  3. Paddock, S. W. and Eliceiri K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods in Molecular Biology, 1075, 9-47 (2014).
  4. Hoff. F. How to prepare your specimen for immunofluorescence microscopy. Philipps University Marburg, Institute of Cytobiology and Cytopathology, Germany. (2015) Available at- http://www.leica-microsystems.com.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter