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Microscopía de Fluorescencia Confocal
 

Microscopía de Fluorescencia Confocal: Una Técnica para Determinar la Localización de Proteínas en Fibroblastos de Ratón

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La microscopía de fluorescencia confocal es una técnica de imagen especializada para la localización de una proteína o antígeno de interés en una muestra de células o tejidos etiquetando el antígeno con un colorfluorescente conjugado por anticuerpos y detectando la señal fluorescente. Ofrece una mayor resolución espacial que la microscopía de fluorescencia de campo ancho, con la ayuda de dos agujeros colocados en los planos focales de la lente objetivo, dándole el nombre de confocal. Permite a los usuarios visualizar la tinción a un nivel subcelular, como la diferenciación entre la tinción de membrana superficial de la tinción intracelular.

Un microscopio confocal sigue un principio básico similar al de un microscopio de fluorescencia clásico. El haz de una fuente de luz, generalmente un láser para confocal, se refleja en un espejo dicroroico y se centra en una lente objetiva en la muestra. Esta luz excita a los fluoróforos para emitir una longitud de onda diferente, que viaja de vuelta a través de la lente objetivo y el espejo dicroico a una cámara o ocular.

La resolución mejorada de un microscopio confocal se debe principalmente a la presencia de dos agujeros, que son agujeros muy pequeños para que la luz pase a través de las trayectorias de excitación y emisión de luz. Los agujeros se colocan estratégicamente en el plano focal de la lente objetivo. Ahora, cambiemos a un esquema de vista lateral de la disposición del microscopio para revisar la trayectoria de la luz. Después de pasar a través del agujero de excitación, el haz de luz de excitación tiene el efecto de originarse desde un punto focal, lo que permite que la lente objetivo para luego enfocar la luz a un punto en la muestra, así. El haz de emisión desde este punto focal converge en el agujero de emisión, lo que le permite pasar. Ahora, durante la excitación, los fluoróforos dentro del camino de luz, por encima y por debajo del punto focal, también están ligeramente excitados. Mientras que la luz de emisión que se origina desde el punto focal pasa a través del agujero, las emisiones de los puntos desenfocados convergen antes o después del agujero de emisión, y por lo tanto se bloquean, lo que resulta en una fluorescencia de fondo reducida.

El ciclo de detección de excitación-emisión debe repetirse para cada punto de imagen de la región de interés, lo que se puede hacer de varias maneras diferentes. Por ejemplo, el escaneo láser confocal utiliza espejos de escaneo galvanómetro, que desvían la luz de excitación en diferentes ángulos. Por lo tanto, barriendo el haz de luz a través de la muestra en el plano XY. El confocal de disco giratorio utiliza un disco con una matriz de agujeros, que gira para desplazar la disposición de los agujeros. Esto permite a los usuarios iluminar varios puntos de imagen pequeños en la muestra cada vez, cubriendo gradualmente toda el área a medida que el disco gira. Como resultado de los agujeros, la imagen XY en el detector representa un plano Z estrecho. Por lo tanto, las imágenes se pueden recopilar de una serie de planos Z consecutivos, a menudo denominados pila Z. A partir de estas imágenes, un software adecuado puede generar una representación 3D del patrón de señal de fluorescencia en la muestra.

En este protocolo, observará inmunomanchación de fibroblastos de ratón, seguido de imágenes en un microscopio confocal para visualizar diferencialmente una proteína de superficie celular y una proteína lisosomal.

Para empezar, utilizando técnicas estériles, resuspender las células de interés en 500 microlitros de medios de crecimiento por pozo, y luego sembrarlas en los pozos de un tobogán de cámara de cuatro pozos. Aquí, estamos usando fibroblastos de ratón que fueron transinfectados para expresar la molécula que presenta antígenos, CD1d. Para permitir que las células se adhieran al vidrio, coloque el deslizamiento de la cámara en una incubadora de dióxido de carbono del 5% a 37 grados centígrados e incubadurante durante la noche. Por la mañana, aspirar los medios de cada poca, y luego lavar las células una vez con 500 microlitros de PBS durante unos segundos.

Para fijar las células, agregue 500 microlitros de 1% de solución de paraformaldehído en cada pocal e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, recoja el paraformaldehído en un contenedor de residuos líquidos peligrosos apropiado, y luego retire cualquier resto del fijador lavando las células tres veces con PBS durante unos segundos.

Para permitir la penetración de anticuerpos en las células, agregue 500 microlitros de tampón de permeabilización a cada poca, e incubar en el banco durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la permeabilización, lave las células brevemente tres veces con 500 microlitros de PBS. A continuación, agregue 500 microlitros de tampón de bloqueo a cada poca, e incubar durante una hora a cuatro grados Celsius para evitar la unión inespecífica de anticuerpos.

Preparar los anticuerpos primarios, anti-CD1d y anti-LAMP-1, a concentraciones de trabajo adecuadas. Luego, aspirar el amortiguador de los pozos y cubrir las células en cada pozo con 500 microlitros de solución de anticuerpos primarios diluidas y luego incubar la diapositiva en una superficie plana durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, diluir los anticuerpos secundarios, en este caso un anticuerpo anti-ratón y anti-rata con etiquetas fluorescentes distintas, en el bloqueo del tampón a las concentraciones de trabajo adecuadas. A continuación, aspirar la solución primaria de anticuerpos de los pozos y luego lavar las células cuatro veces con 500 microlitros de PBS. Luego, añadir 500 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios diluidas a cada pocal, e incubar a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad. Después de la incubación, aspirar la solución secundaria de anticuerpos y lavar los pozos cuatro veces con 500 microlitros de PBS para eliminar cualquier anticuerpo secundario no unido.

Para montar las muestras después del lavado final, desmonte cuidadosamente y retire las cámaras de la diapositiva. Para eliminar el PBS residual, sostenga la diapositiva en un ángulo sobre una toallita de tarea delicada y retire el líquido de los bordes sin tocar las celdas. Una vez que se elimina el exceso de PBS, agregue una gota de medio de montaje antidescoloro, que contiene la mancha nuclear DAPI, en cada sección de las células. A continuación, tome un resbalón de 20 por 60 milímetros, y usando sólo las yemas de los dedos comience a bajar el cubreobjetos lentamente en cada borde, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas sobre las células. Limpie cualquier medio de montaje adicional en las diapositivas con una delicada limpieza de tareas y guarde las diapositivas en la oscuridad a temperatura ambiente durante un máximo de una semana.

Para comenzar a crear imágenes de las celdas, primero haga clic en el icono del software NIS en el escritorio. Una vez en la ventana de control, haga clic en la pestaña TiPad en la parte superior y elija el objetivo deseado para la creación de imágenes. Luego, cargue la diapositiva con células en el escenario y céndala debajo de la lente. A continuación, en la pestaña A1plus Compact GUI junto a la pestaña TiPad, configure los láseres adecuados para los fluoróforos utilizados. Haga clic en el símbolo de engranaje para abrir el menú de ajustes espectrales y de tinte. Una vez abierto el menú de ajustes espectrales y de tinte, seleccione los canales necesarios y ajuste el láser para cada canal. A continuación, seleccione las emisiones adecuadas en el menú desplegable bajo el primer espejo dicroico. A continuación, en la ventana de A1plus Compact GUI, haga clic en Ch.Series para configurar la serie de canales de línea, que configura si los láseres utilizados se dispararán en la muestra simultáneamente o secuencialmente.

Después de eso, comience a escanear haciendo clic en el icono de punta de flecha en la parte superior. En este punto, mientras la imagen está activa, en la ventana de la GUI de A1plus Compact, haga clic en la escala deslizante y modifique el tamaño del agujero para asegurar la limitación de la luz desenfocada. A continuación, ajuste los ajustes de alto voltaje y desplazamiento debajo de cada láser a los niveles adecuados mediante el uso de las escalas deslizantes para permitir la detección de la tinción específica mientras se limita cualquier posible tinción de fondo. Si hay disponible una muestra de tinción positiva, comience por tomar imágenes de esta muestra para cada canal para asegurarse de que los ajustes del láser producen proporciones óptimas de señal a ruido. Después de establecer los valores óptimos de HV y desplazamiento para cada láser, haga clic en la pestaña ND Acquisition y, a continuación, seleccione el icono Z para configurar los parámetros de la serie z.

A continuación, mientras adquiere una imagen en vivo de la muestra, primero establezca la parte inferior encontrando la parte inferior de la imagen y haciendo clic en el botón inferior. A continuación, busque la posición superior de la muestra y haga clic en el botón superior. Establezca el tamaño del paso escribiendo específicamente el tamaño de paso preferido en las micras para cada paso o especificando cuántos pasos totales se necesitan. Para seleccionar el tamaño/resolución de píxeles deseado de la imagen, haga clic en la ventana GUI de Aiplus Compact y, en el icono de tamaño, seleccione la resolución deseada.

Para reducir el ruido de la imagen, puede seleccionar el menú desplegable junto al símbolo theta para promediar el número seleccionado de imágenes. Después de esto, haga clic la pestaña Run Now en el menú ND Acquisition para comenzar a tomar imágenes de la muestra. Una vez completada la creación de imágenes, guarde la imagen haciendo clic en archivo y, a continuación, guarde como, que exportará el archivo de imagen con la extensión dot-nd2. Por último, repita el proceso para cada una de las otras muestras.

En este experimento, los fibroblastos de ratón que expresaban el gen de la glicoproteína superficial CD1d fueron fijos, inmunomanchados e imágenes en un microscopio confocal. Esta imagen muestra una sola sección de una pila Z en la ampliación 40X, donde CD1d se tiñe en rojo. La muestra fue corinado con LAMP-1, un marcador lisosomal, en verde. La mancha nuclear DAPI se utilizó para mostrar los núcleos de las células.

En una imagen compuesta donde se fusionan los tres canales diferentes, la apariencia de amarillo resulta de la superposición de los canales rojo y verde, e indica un área donde CD1d y LAMP-1 se colocalizan en los lisosomas. Las áreas donde sólo hay un color indican la presencia de CD1d o LAMP-1 sin colocalización. Esta imagen muestra una representación 3D de las celdas construidas a partir de imágenes capturadas en la pila z y este método habilitó la construcción de una vista lateral de este grupo de celdas. Esta siguiente imagen muestra un segmento de la pila z con un aumento de 100X, lo que demuestra los patrones de expresión de estas dos proteínas con mayor detalle. El cuadro delineado rosa en el lado derecho de la imagen muestra la sección transversal de la coordenada X designada por la línea rosa en la imagen, que representa la vista lateral en la línea rosa. Del mismo modo, el cuadro azul delineado en la parte inferior de la imagen muestra la sección transversal de la coordenada Y designada por la línea azul en la imagen, que representa la vista frontal en la línea azul. La representación 3D de la imagen de la pila z permite a los usuarios ver la imagen en 3D, visualizando todos los planos x, y y z. Esto se puede utilizar para estudiar la colocalización de las diferentes manchas en diferentes regiones dentro de la célula.

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