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Techniques basées sur l'immunoprécipitation
 

Techniques basées sur l'immunoprécipitation : Purification des protéines endogènes à l'aide de perles d'agarose

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L'immunoprécipitation, ou IP, est une technique largement utilisée pour isoler une protéine d'intérêt d'un lysate cellulaire ou tissulaire ou d'un liquide corporel pour la caractérisation des protéines ou pour étudier les interactions protéines-protéines.

Le processus commence par un anticorps, qui a une forte affinité et spécificité pour la protéine cible. Cet anticorps est mélangé à l'échantillon, ce qui permet aux complexes anticorps-cibles de se former. Toute protéine liée à la protéine cible est également indirectement attaché à l'anticorps dans le processus. Ensuite, la solution est incubée avec des perles d'agarose, conjuguées à une protéine bactérienne, qui a une forte affinité pour la région constante des anticorps. La protéine bactérienne se lie à l'anticorps et relie les complexes anticorps cibles aux perles. Ensuite, la solution est centrifugepour précipiter les perles, extrayant ainsi l'ensemble du complexe contenant l'anticorps liant, la protéine cible et toutes les protéines en interaction. Enfin, les protéines liées sont extraites des perles et libérées les unes des autres et sont utilisées pour une analyse plus approfondie par des techniques telles que le ballonnement occidental.

Plusieurs variantes de différentes parties de cette technique sont couramment utilisées, comme le pré-dédouanement, l'utilisation d'étiquettes peptidiques ou de perles magnétiques, ou l'analyse d'autres partenaires de liaison non protéiques. La propriété intellectuelle peut être précédée par une étape de pré-compensation, afin d'éliminer les protéines non spécifiques liant les anticorps dans l'échantillon et de minimiser l'arrière-plan. Il s'agit d'abord d'incuber l'échantillon avec des anticorps anti-isotypes, ce qui leur permet de se lier à ces protéines, puis d'utiliser des perles d'agarose pour précipiter les complexes. L'échantillon est alors prêt à passer à la propriété intellectuelle réelle.

Les balises Peptide sont utiles si un anticorps spécifique n'est pas disponible pour la propriété intellectuelle. Ici, la protéine cible peut être génétiquement modifiée pour contenir une étiquette d'épitope peptidique et un anticorps contre l'étiquette est capable de retirer la protéine d'intérêt. Les perles magnétiques sont souvent utilisées au lieu d'agarose pour précipiter la cible. Après s'être reliuté au complexe anticorps-cible, le tube d'échantillon est placé dans un champ magnétique fort, qui extrait les perles de la solution. Cela élimine le besoin de centrifugation et améliore la vitesse et la commodité.

L'immunoprécipitation est également utilisée pour l'étude de l'ADN ou des protéines liant esquimables par l'ARN et sont connues sous le nom d'immunoprécipitation de chromatine et d'immunoprécipitation d'ARN, respectivement. Ces variations sont utiles pour le dépannage et l'adaptation de la méthode pour différentes applications expérimentales. Dans cette vidéo, vous observerez comment pré-effacer un lysate cellulaire et effectuer l'immunoprécipitation pour extraire une protéine d'intérêt, suivie de l'analyse de tache occidentale pour valider l'expérience.

Pour commencer, placez les cellules pré-collectées dans un microcentrifugeet et tournez à 13 mille tr/min pendant trois minutes. Après le spin, retirez le supernatant, puis resuspendles les cellules en 500 microlitres de tampon de lyse RIPA avec PMSF. Maintenant, perturber les cellules en utilisant quelques impulsions rapides avec un vortex, puis aspirer le lysate à quelques reprises avec une aiguille de 25 jauges attachée à une seringue, en prenant soin d'éviter de créer des bulles. Placer les cellules sur la glace pendant 15 minutes. Après avoir incubé les échantillons sur la glace, centrifuger la lysation pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Étiquetez un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Après la rotation, transférer le supernatant dans le tube fraîchement étiqueté et jeter la pastille. Ensuite, pré-effacer le lysate des contaminants qui se lient non spécifiquement aux perles d'agarose ou à l'anticorps primaire en ajoutant 20 microlitres des perles de protéine A/G PLUS-agarose et un microgramme d'un anticorps de contrôle d'isotype au lysate, qui dans ce par exemple est une souris IgG1 isotype de contrôle. Incuber le tube sur un rotateur dans une chambre froide pendant 30 minutes. Après avoir fait tourner le lysate dans la chambre froide pendant 30 minutes, centrifuger l'échantillon à 3200 tr/min pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius. Retirez le tube de la centrifugeuse et transférez le supernatant pré-autorisé dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre étiqueté frais. Jeter la boulette.

Maintenant, déterminez la concentration en protéines du lysate cellulaire en effectuant un résultat d'exécution bradford. Étiquette sept 1. Tubes microcentrifugede de 5 millilitres un à six et échantillon et aliquot 1000 microlitres du réactif Bradford dans chaque tube. Six des tubes seront utilisés pour faire une courbe standard en ajoutant diverses quantités de quantités connues de BSA à chaque tube. Les montants à ajouter sont énumérés dans ce tableau. Dans le septième tube d'échantillon, ajouter un microlitre du lysate pré-éclairci. Placer 200 microlitres de chacun des sept tubes dans des puits individuels d'une plaque plate de 96 puits, en répétant chaque échantillon en triplette afin qu'il y ait trois colonnes de sept échantillons. Lisez la plaque sur un lecteur de plaque, à l'aide d'une longueur d'onde de 595 nanomètres. Après avoir créé une courbe standard dans Excel, calculer la concentration en protéines du lysate pré-éclairci.

Ensuite, étiquetez deux tubes microcentrifugede de 1,5 millilitre, l'un comme contrôle et l'autre comme test, qui dans cet exemple, sera l'anticorps c-myc. Placez 500 microgrammes du lysate pré-dédouané dans chacun de ces tubes, puis apportez le volume total pour chaque tube jusqu'à 500 microlitres à l'aide de tampon de lyse. Ensuite, ajoutez deux microgrammes de l'anticorps anti-c-myc au tube du groupe d'essai. Pour le contrôle, ajouter deux microgrammes de la souris IgG1 anticorps anti-isotype. Une fois que les anticorps sont ajoutés aux tubes, placez les échantillons sur un rotateur dans une chambre froide et incuber pendant deux heures. Maintenant, ajoutez les perles d'agarose. Pour ce faire, il est recommandé de couper l'extrémité d'une pointe de pipette, puis, à l'aide de cette pointe modifiée, ajouter 200 microlitres de la protéine A/ G PLUS-agarose perles à chaque tube. Incuber les tubes sur un rotateur dans la chambre froide pendant la nuit.

Après l'incubation, retirer les tubes du rotateur et faire tourner les lysates dans le microcentrifuge pour tirer vers le bas les perles. Une fois la rotation terminée, retirer les tubes de la centrifugeuse et aspirer le supernatant de chaque tube. Ensuite, lavez les perles à l'aide de 500 microlitres de 1X Dulbecco PBS. Placer les tubes dans un microcentrifugeet et faire tourner pendant 30 secondes à quatre degrés Celsius. Après cela, retirez le supernatant. Répétez le lavage et la centrifugeuse marche une fois de plus pour un total de deux fois. Retirez les tubes de la microcentrifuge et aspirez le tampon de chaque tube. À l'aide de pointes de chargement de gel, retirer les restes de tampon des perles, en gardant les perles sur la glace pour éliper la protéine liée.

Dans cet exemple, la protéine est éludée dans le tampon de fonctionnement SDS-PAGE en faisant bouillir pour l'analyse de tache occidentale. Pour ce faire, resuspendre les perles dans 20 microlitres de colorant de chargement SDS-PAGE contenant du bêta-mercaptoéthanol, ou BME. Faire bouillir les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes pour dissocier les immunocomplexes des perles. Ensuite, centrifuger les perles à vitesse maximale pendant 10 secondes à température ambiante. Retirer les tubes de la microcentrifugeuse et les tenir dans une grille à température ambiante. À l'aide de pointes de chargement de gel, pipette soigneusement les échantillons des perles et les charger dans des puits d'un gel SDS-PAGE de gradient de 4 à 15 %. En plus des échantillons, chargez une voie avec une échelle protéique ainsi qu'une voie avec le lysate pré-dédouané pour servir de contrôle de chargement. Une fois le gel chargé, faire fonctionner le gel à 100 volts.

Après que l'avant de teinture a atteint le fond du gel, qui devrait prendre approximativement une heure, arrêter le gel et faire un sandwich de tache occidentale, s'assurant que la membrane de PVDF est entre le gel et la cathode. Placer le sandwich western dans l'appareil de transfert et transférer les protéines sur le gel à la membrane pendant une heure à 100 volts. Une fois le transfert terminé, placez la membrane en cinq millilitres de bloc pour empêcher les anticorps de se lier non spécifiquement à la membrane. Rock à un réglage bas pendant une heure à température ambiante. Lorsque la minuterie retentit, retirez le tampon de blocage. Ajouter cinq millilitres du tampon de blocage avec l'anticorps de détection à la membrane. Ici, un anticorps anti-c-myc, qui est différent de celui utilisé pour la traction vers le bas, est utilisé.

Incuber la tache pendant la nuit, à quatre degrés Celsius sur un rocker à un réglage bas. Après l'incubation, retirer l'anticorps et bloquer le tampon. Laver la tache, en utilisant cinq millilitres de TBST pendant cinq minutes à température ambiante, sur un rocker à un réglage bas. Cette étape de lavage doit être répétée deux à cinq fois pour un total de trois à six lavages, en utilisant du TBST frais pour chaque lavage. Ajouter cinq millilitres d'un à 1000 anticorps secondaires et bloquer tampon à la tache. Dans ce cas, l'anticorps secondaire est HRP-étiqueté anti-lapin chaîne de lumière. Incuber la tache sur un rocker à un réglage bas pour un notre à température ambiante. Ensuite, retirez le tampon et lavez la tache avec cinq millilitres de TBST. Incuber ce lavage sur un rocker à un réglage bas pendant cinq minutes à température ambiante. Répétez ce lavage pour un total de six à 12 lavages, chacun avec un frais de cinq millilitres de TBST. Retirer le lavage final en versant d'abord le liquide hors de la tache. Ensuite, à l'aide d'une pince à épiler, tamponner le bord de la tache sur une lingette de laboratoire pour enlever tout excès de liquide, puis placer la tache dans un récipient frais. Ensuite, couvrir la tache avec 1X Chemiluminescent Detection Reagent et couver pendant une minute.

En travaillant rapidement, tamponnez le bord de la tache sur une lingette de laboratoire pour enlever tout réactif de détection excédentaire, puis placez la tache sur la surface d'imagerie du plateau imageur. Image utilisant le programme Chemiluminescent pour capturer plusieurs points de temps de 10 à 30 secondes. Une fois la tache représentée, choisissez une image avec une visibilité optimale de la bande, puis exportez cette image. Avant de déplacer la tache, utilisez l'Imager pour prendre une photo de la tache pour capturer l'emplacement de l'échelle. Ensuite, exportez cette image aussi. Enfin, à l'aide d'un logiciel de préparation de diapositives, comme PowerPoint, alignez les bandes et les images de l'échelle pour former une image.

Cette image montre le résultat de tache occidentale pour l'immunoprécipitation du c-myc de protéine des cellules de thymocyte. De gauche à droite, les voies représentent le contrôle de l'isotype, l'IP c-myc et l'entrée de lysate pré-dédouanée. La voie à l'extrême droite est une image fusionnée de l'échelle de poids moléculaire. La bande forte, à environ 25 kilodaltons est de la chaîne de lumière et celui à 50 kilodaltons est de la chaîne lourde de l'anticorps de liaison et ne sont pas spécifiques à la propriété intellectuelle ou les échantillons. C-myc court environ 67 kilodaltons sur les taches occidentales et est généralement visible juste en dessous de la bande d'échelle de 75 kilodalton. Dans cette tache, la bande de c-myc est visible dans la deuxième voie mais absente dans la première voie, indiquant que l'anticorps IP a réussi à tirer vers le bas c-myc. Il n'y a pas de bande visible dans la voie de lysate pré-dédouanée, ce qui suggère que cette protéine a de faibles niveaux d'expression endogènes.

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