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免疫沈殿ベースの技術:アガロースビーズを用いた内因性タンパク質の精製

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免疫沈殿、またはIPは、細胞または組織のリサートまたはタンパク質特性を有する体液から目的のタンパク質を分離したり、タンパク質とタンパク質の相互作用を調べたりするために広く使用されている技術です。

このプロセスは、標的タンパク質に対する高い親和性および特異性を有する抗体から始まる。この抗体は試料と混合され、抗体標的複合体が形成される。標的タンパク質に結合したタンパク質も、その過程で抗体に間接的に付着します。次に、溶液をアガロースビーズでインキュベートし、抗体の一定領域に対して強い親和性を有する細菌タンパク質に結合する。細菌タンパク質は抗体に結合し、抗体標的複合体をビーズに接続します。次いで、溶液を遠心分離してビーズを沈殿させ、それによって結合抗体、標的タンパク質、および任意の相互作用タンパク質を含む複合体全体を抽出する。最後に、結合タンパク質をビーズから抽出し、互いに放出し、ウェスタンブロッティングなどの技術によるさらなる分析に使用されます。

この技術のいくつかのバリエーションは、事前クリア、ペプチドタグまたは磁気ビーズの使用、または他の非タンパク質結合パートナーの分析など、一般的に使用されます。IPは、事前クリアステップによって前接することができ、試料中の非特異的抗体結合タンパク質を除去し、背景を最小限に抑える。これは、最初にアイソタイプコントロール抗体でサンプルをインキュベートし、これらのタンパク質に結合させ、次にアガロースビーズを使用して複合体を沈殿させることを含みます。次に、サンプルは実際の IP に進む準備が整いました。

ペプチドタグは、特定の抗体がIPに使用できない場合に有用である。ここで、標的タンパク質は、ペプチドエピトープタグとタグに対する抗体を含有するように遺伝子改変することができ、目的とするタンパク質を引き出すことができる。磁気ビーズは、多くの場合、ターゲットを沈殿させるためにアガロースの代わりに使用されます。抗体標的複合体に結合した後、試料チューブは強い磁場に置かれ、溶液からビーズを抽出する。これは遠心分離のための必要性を除去し、速度および便利を改善する。

免疫沈殿は、DNAまたはRNA結合タンパク質の研究にも使用され、クロマチン免疫沈殿およびRNA免疫沈殿としてそれぞれ知られています。これらのバリエーションは、さまざまな実験アプリケーションのトラブルシューティングと方法の適応に役立ちます。このビデオでは、細胞リサートを事前にクリアし、目的のタンパク質を抽出するために免疫沈殿を行う方法を観察し、続いてウェスタンブロット分析を行って実験を検証します。

まず、あらかじめ収集した細胞をマイクロ遠心分離機に入れ、13,000rpmで3分間回転させます。スピンに続いて、上清を取り除き、PMSFで500マイクロリットルのリシスバッファーRIPAで細胞を再中断します。さて、渦でいくつかのクイックパルスを使用して細胞を破壊し、その後、気泡を作成しないように注意して、注射器に取り付けられた25ゲージの針で数回リサートを吸引します。細胞を氷の上に15分間置きます。氷上でサンプルをインキュベートした後、4°Cで15分間リサートを遠心分離します。

新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心管にラベルを付けます。スピンに続いて、上清を新たに標識されたチューブに移し、ペレットを廃棄します。次に、タンパク質A/G PLUS-アガロースビーズの20マイクロリットルと同種コントロール抗体の1マイクログラムをリザートに添加することにより、非特異的にアガロースビーズまたは一次抗体に結合する汚染物質のライサートを事前にクリアします。例は、マウス IgG1 アイソタイプコントロールです。冷たい部屋で30分間回転子の管をインキュベートする。冷たい部屋で30分間リザートを回転させた後、サンプルを3200rpmで30秒間遠心分離し、摂氏4度で30秒間遠心分離する。遠心分離機からチューブを取り出し、クリア済みの上清を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。ペレットを捨てます。

さて、ブラッドフォードアッセイを行うことにより、細胞のタンパク質濃度を決定する。ラベル 7 1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブ1~6本、サンプルとアリコート1000マイクロリットルのブラッドフォード試薬を各チューブに入れます。6つのチューブは、各チューブにBSAの様々な量の既知の量を追加することにより、標準的な曲線を作るために使用されます。追加する金額は、この表に一覧表示されます。第7のサンプルチューブに、予クリアされたライサートの1マイクロリットルを加える。7つのチューブのそれぞれから200マイクロリットルを平底96ウェルプレートの個々のウェルに入れ、各サンプルを三つ三つ三つ返しにして、7つのサンプルの3つの列があるようにします。595ナノメートルの波長を使用して、プレートリーダー上のプレートを読みます。Excel で標準曲線を作成した後、クリア済みリサートのタンパク質濃度を計算します。

次に、2つの1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に標識を付け、1つは対照管として、もう1つは試験として、この例ではc-myc抗体となる。これらのチューブのそれぞれに500マイクログラムのクリアされたライサートを配置し、その後、ライシスバッファを使用して、各チューブの総容積を500マイクロリットルまで持って来ます。次に、抗c-myc抗体の2マイクログラムを試験群チューブに添加する。対照のために、マウスIgG1アイソタイプ対照抗体の2マイクログラムを添加する。抗体をチューブに加えたら、サンプルを冷たい部屋の回転子に置き、2時間インキュベートします。次に、アガロゼビーズを追加します。これを行うには、ピペット先端の端を切り取り、この修正された先端を使用して、各チューブにプロテインA/Gプラスアガロースビーズの200マイクロリットルを追加することをお勧めします。一晩冷たい部屋の回転子の管をインキュベートする。

インキュベーションの後、回転子からチューブを取り出し、マイクロ遠心分離機でライサテを回転させ、ビーズを引き下げる。スピンが完了したら、遠心分離機からチューブを取り外し、各チューブから上清を吸引します。次に、1XダルベッコのPBSの500マイクロリットルを使用してビーズを洗浄します。チューブをマイクロ遠心分離機に入れ、4°Cで30秒間スピンダウンします。この後、上清を取り除く。洗浄と遠心分離機のステップを合計2回繰り返します。マイクロ遠心分離機からチューブを取り外し、各チューブからバッファを吸引します。ゲルローディングの先端を使用して、ビーズから残ったバッファーを取り除き、ビーズを氷の上に保ち、結合したタンパク質を溶出させる。

この例では、タンパク質は、ウェスタンブロット分析のために沸騰することにより、SDS-PAGE実行バッファーにタンパク質をタンパク質にタンパク質で再生します。これを行うには、ベータメルカプトエタノール、またはBMEを含むSDS-PAGE負荷染料の20マイクロリットルでビーズを再中断します。サンプルを95°Cで5分間沸騰させ、ビーズから免疫錯体を解離します。次に、ビーズを室温で10秒間最高速度で遠心分離する。マイクロ遠心分離機からチューブを取り外し、室温でラックに保持します。ゲルローディングの先端を使用して、慎重にビーズからサンプルをピペットし、4〜15%の勾配SDS-PAGEゲルの井戸にそれらをロードします。サンプルに加えて、タンパク質のはしごを持つレーンと、事前にクリアされたライサテを持つレーンをロードして、ローディングコントロールとして機能します。ゲルがロードされたら、100ボルトでゲルを実行します。

染料の前面がゲルの底に達した後、約1時間かかります, ゲルを停止し、西洋のブロットサンドイッチを作ります, PVDF膜がゲルと陰極の間にあることを確認.移送装置にウェスタンブロットサンドイッチを置き、ゲル上のタンパク質を100ボルトで1時間膜に移します。転移が完了したら、抗体が膜に非特異的に結合するのを防ぐために、膜を5ミリリットルのブロックに入れます。室温で1時間の低い設定でロックします。タイマーが鳴ったら、ブロッキング バッファを削除します。検出抗体を膜に5ミリリットルのブロッキングバッファーを添加する。ここでは、プルダウンに使用されるものとは異なる抗c-myc抗体が使用される。

低い設定でロッカーに摂氏4度で、一晩ブロットをインキュベートします。インキュベーションに続いて、抗体および遮断バッファーを除去する。室温で5ミリリットルのTBSTを使用して、低い設定でロッカーでブロットを洗います。この洗浄工程は、各洗浄のために新鮮なTBSTを使用して、合計3〜6回の洗浄のために2〜5回繰り返す必要があります。1~1000の二次抗体の5ミリリットルを追加し、ブロットにブロックバッファーを追加します。この場合、二次抗体はHRPタグ付き抗ウサギ軽鎖である。室温で低い設定でロッカーのブロットをインキュベートします。次に、バッファを取り外し、TBSTの5ミリリットルでブロットを洗浄します。この洗浄を室温で5分間低い設定でロッカーにインキュベートします。この洗浄を6~12回繰り返し、それぞれに新鮮な5ミリリットルのTBSTを入れ直します。最初にブロットから液体を注ぐことによって、最終的な洗浄を削除します。次に、ピンセットを使用して、余分な液体を除去し、新鮮な容器にブロットを置くために実験室のワイプにブロットの端を塗ります。次に、1Xケミルミネッセンス検出試薬でブロットを覆い、1分間インキュベートします。

迅速に作業し、実験室のワイプでブロットの端を塗り、余分な検出試薬を取り除き、Imager トレイのイメージングサートの画像面にブロットを配置します。ケミルミネッセンスプログラムを使用して10~30秒の複数の時間ポイントをキャプチャする画像。ブロットをイメージした後、最適なバンドの可視性を持つ画像を選択し、そのイメージを書き出します。ブロットを移動する前に、Imager を使用してブロットの写真を撮り、はしごの位置をキャプチャします。次に、そのイメージもエクスポートします。最後に、PowerPoint などのスライド準備ソフトウェアを使用して、バンドとラダー イメージを位置合わせして 1 つのイメージを形成します。

この画像は、胸腺細胞からのタンパク質c-mycの免疫沈殿に対するウェスタンブロット結果を示す。左から右に、レーンはアイソタイプコントロール、c-myc IP、および事前にクリアされたリサート入力を表します。右上の車線は、分子量はしごのマージされた画像です。強いバンドは、約25キロダルトンで軽鎖からであり、50キロダルトンの1つは結合抗体の重鎖からのものであり、IPまたはサンプルに非特異的である。C-mycは西部のブロットで約67キロダルトンを走り、通常は75キロダルトンのはしごバンドのすぐ下に見えます。このブロットでは、c-mycバンドは第2車線に見えますが、第1レーンに存在せず、IP抗体が正常にc-mycを引き下がっていることを示します。事前にクリアされたリサートレーンには目に見えるバンドがなく、このタンパク質の内因性発現レベルが低いことが示唆されています。

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