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Zellzyklusanalyse: Bewertung der Proliferation von CD4- und CD8-T-Zellen nach Stimulation mit CFSE-Färbung und Durchflusszytometrie

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Für die meisten immunologischen Studien ist die Messung der Proliferation von Immunzellen ein wichtiger Schritt und die CFSE-Fluoreszenzfarbstoff-basierte Methode wird häufig verwendet. Die richtige Zellteilung ist wichtig für Immunzellen, da sie sowohl das Niveau als auch die Spezifität einer Immunantwort reguliert. Beispielsweise vermehren sich T-Zellen, um Krebszellen zu identifizieren und abzutöten, und B-Zellen durchlaufen eine Zellteilung, um spezifische Antikörper zu produzieren. Die allgemeine Prämisse des CSFE-Assays besteht darin, die Zellen mit dem grünen Fluoreszenzfarbstoff CFSE zu färben, der in lebende Zellen eindringt und stabil an die Proteine im Inneren bindet, was zu einer dauerhaften Kennzeichnung führt. Wenn sich die farbstoffhaltige Elternzelle teilt, erhält jede Tochterzelle die Hälfte der Fluoreszenz von der übergeordneten Zelle.

Dieser Prozess setzt sich in den nachfolgenden Divisionen fort, wobei die Farbintensität mit jeder Division allmählich abnimmt. Am gewünschten Endpunkt wird die Fluoreszenzintensität jeder Zelle durch Durchflusszytometrie gemessen. Diese Daten werden dann verwendet, um die Anzahl und das Muster der Divisionen zu quantifizieren, die die Zellen durchlaufen haben. Wie hier gezeigt, stammt die Zellpopulation mit der höchsten Fluoreszenz aus der Elterngeneration. Die zweithöchste gehört der zweiten Generation und so weiter. Die Anzahl der Spitzen bestimmt die Anzahl der Zellteilungen.

Darüber hinaus können bei verwendung sirdischer Immunzellen bestimmte Zellpopulationen, wie z.B. die T-Zellen, zusammen mit CFSE mit einem verschiedenfarbigen Fluoreszenzfarbstoff beschriftet und gleichzeitig mit mehrfarbiger Durchflusszytometrie identifiziert werden. Die neuen Daten können auf demselben Diagramm dargestellt werden, das nun die T-Zell-Unterpopulation mit unterschiedlichen CFSE-Färbungsintensitäten zeigt, mit denen die Proliferationsrate der T-Zellen gezielt analysiert werden kann. Dieses Video zeigt das Protokoll zur CFSE-Färbung von Maussplenozyten, die mit einem Anti-CD3-Antikörper stimuliert werden. Es folgt eine Färbung, um T-Zellen zu beschriften und zytometrie zu durchflussen, um ihre Zellproliferation zu verfolgen.

Zunächst geeignete Schutzkleidung und Laborhandschuhe anziehen. Als nächstes waschen Sie ein Paar Zangen und sezieren Schere zuerst mit einem Reinigungsmittel und dann mit 70% Ethanol und wischen Sie sie dann mit einem sauberen Papiertuch trocken. Bereiten Sie 50 Milliliter von Hanks Balanced Salt Solution, oder HBSS, mit einer Konzentration von 2% fetalem Kalbsserum, oder FCS, vor, indem Sie einen Milliliter FCS mit 49 Millilitern HBSS in einer 50-Milliliter-Röhre kombinieren. Mischen Sie die Lösung etwa 10 Mal, indem Sie die Lösung sanft nach oben und unten pfeifen. Dann isolieren Sie Mausmilzzellen, wie im Videoprotokoll zur FACS-Isolierung von Milz-B-Lymphozyten gezeigt.

Etikettieren Sie vier 15-Milliliter-Röhren eins bis vier und fügen Sie ein mal 10 zu den siebten isolierten Milzzellen hinzu. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter HBSS 2% FCS zu jeder Röhre hinzu. Dann pipette einen Mikroliter von fünf mikromolaren Carboxyfluorescein succinimidyl ester, oder CFSE, in jedes Rohr. Inkubieren Sie die Rohre bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator für 10 Minuten. Die Zellen in den Röhren eins und zwei werden nicht stimuliert. Sie werden verwendet, um den Basalgehalt der Proliferation von Milz-CD4- und CD8-T-Zellen zu enthüllen.

Pipette 10 Milliliter HBSS 2% FCS in diese Rohre. Die Röhren drei und vier werden durch Anti-CD3-Antikörper stimuliert, um die Auswirkungen auf den Zellzyklus zu beobachten. Fügen Sie 10 Milliliter HBSS 2% FCS und Anti-CD3-Antikörper mit einer Endkonzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter zu den Tuben drei und vier hinzu. Als nächstes zentrieren Sie alle Rohre bei 370 x g für sieben Minuten bei 10 Grad Celsius. Entsorgen Sie die Überräube. Setzen Sie die Pellets in zwei Milliliter HBSS 2% FCS wieder auf und pipette die resultierenden Lösungen in separate Bohrungen auf einer Sechs-Brunnen-Platte. Beschriften Sie die Platte sorgfältig von eins bis vier, um die Probenidentitäten nachzuverfolgen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 für drei Tage.

Am dritten Tag zwei Milliliter HBSS 2% FCS zu den Brunnen eins und drei hinzufügen, die die Zellen aus den Röhren eins und drei enthalten sollten. Rohrleitung kräftig nach oben und unten und dann die Proben in beschriftete Fünf-Milliliter-FACS-Rohre übertragen. Legen Sie die Sechs-Well-Platte wieder in den Inkubator. Diese verbleibenden Zellen aus den Brunnen zwei und vier werden am fünften Tag analysiert, um die langfristigen Auswirkungen der Stimulation auf den Zellzyklus zu untersuchen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 370 x g sieben Minuten bei 10 Grad Celsius und entsorgen Sie dann die Überräube. Fügen Sie nun 100 Mikroliter Antikörper-Mix zu jedem Rohr hinzu. Inkubieren Sie die Rohre für 20 Minuten auf Eis im Dunkeln. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter HBSS 2% FCS zu jedem Rohr hinzu und zentrifugieren Sie die Rohre bei 370 x g für sieben Minuten bei 10 Grad Celsius. Entsorgen Sie die Überräube. Die Pellets in 200 Milliliter HBSS 2% FCS wieder aufhängen und gut mischen. Übertragen Sie die resuspendierten Pellets in neue markierte FACS-Rohre.

Bewerten Sie dann die T-Zell-Proliferation mithilfe der Durchflusszytometrie, wie im FACS-Protokoll gezeigt. Gate die Zellen, um lymphoide CD3-positive Zellen auszuwählen und CD4-positive und CD8-positive Zellen zu unterscheiden, und die Daten für Röhren eins und drei aufzeichnen. Wiederholen Sie am fünften Tag den Zellfärbungsprozess mit den Zellen aus den verbleibenden zwei Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte.

Wir analysieren die Auswirkungen der CD3-Stimulation auf den Zellzyklus von CD4- und CD8-positiven Zellen an drei Tagen und fünf Tagen nach der Stimulation. Um zu beginnen, klicken Sie auf das FlowJo-Symbol und ziehen Sie Ihre Dateien in das Fenster Alle Beispiele. Doppelklicken Sie auf die Datei für die am dritten Tag gesammelten nicht stimulierten Zellen, um ein Punktdiagramm mit Vorwärtsstreuung auf der y-Achse und Seitenstreuung auf der x-Achse anzuzeigen. Klicken Sie auf Polygon, um die Lymphozytenpopulationen basierend auf ihrer Morphologie zu umkreisen. Benennen Sie im Fenster zur Identifizierung der Teilpopulation die Lymphozyten der Grundgesamtheit, und klicken Sie auf OK. Doppelklicken Sie anschließend auf die eingekreiste Grundgesamtheit und wählen Sie im neuen Fenster Thy1.2 auf der y-Achse und CD3 auf der x-Achse aus. Klicken Sie dann auf Polygon, um die CD3- und Thy1.2-Doppel-Positivzellen zu umkreisen. Benennen Sie im neuen Identifikationsfenster für die Untergrundgesamtheit die T-Zellen der Grundgesamtheit, und klicken Sie auf OK. Als Nächstes doppelklicken Sie auf die eingekreiste Bevölkerung. Wählen Sie im neuen Fenster CD4 auf der y-Achse und CD8 auf der x-Achse aus. Klicken Sie dann auf Polygon, um die CD4-positive Population zu umkreisen. Benennen Sie im neuen Identifikationsfenster für die Untergrundpopulation die CD4 T-Zellen der Grundgesamtheit, und klicken Sie auf OK. Klicken Sie nun auf Polygon, um die CD8-positive Population zu umkreisen. Benennen Sie im neuen Identifikationsfenster für die Untergrundpopulation die CD8 T-Zellen der Grundgesamtheit, und klicken Sie auf OK. Wiederholen Sie diese Schritte mit den anderen Dateien.

Um die Häufigkeiten von teilenden und nicht dividierenden Zellen zu bestimmen, visualisieren Sie zunächst die Zellpopulationen, indem Sie auf Layout-Editor klicken. Ziehen Sie dann die CD4-T-Zellen und CD8-T-Zellen von jedem der vier Röhren in das Fenster Alle Samples. Diagramme, die Ihre Populationen darstellen, werden angezeigt. Doppelklicken Sie für jede Röhre auf das Punktdiagramm für CD8-T-Zellen, und wählen Sie Histogramm unter Graphendefinition aus, um die Ergebnisse zu visualisieren. Wählen Sie CFSE als Parameter aus, um die stimulierten und nicht stimulierten Zellpopulationen zu jedem Zeitpunkt zu vergleichen. Nicht trennende Zellen halten höhere CFSE-Spiegel bei, während sich vermehrende Zellen den Gehalt von CFSE in teilende Zellen aufteilen.

Wenn Sie nun die Umschalttaste drücken, doppelklicken Sie auf das Histogramm. Klicken Sie im neuen Fenster auf den Bereich, und wählen Sie den CFSE-Bereich aus, der dem höchsten Peak entspricht. Benennen Sie im Identifikationsfenster für die Untergrundbevölkerung die Grundgesamtheit Nicht dividierende CD8-T-Zellen, und beschriften Sie die Grundgesamtheit, die CD8-Zellen teilt. Wiederholen Sie dies, um die teilenden und nicht teilenden CD4-T-Zellen in jeder Röhre auszuwählen. Um die Häufigkeit der Teilung von CD3-positiven Zellen zu untersuchen, klicken Sie auf Tabelleneditor. Ziehen Sie dann die von Interesse interessierten Populationen, teilen Sie CD8 T-Zellen und Teilen von CD4 T-Zellen, in die Tabelle. Wählen Sie im Menü Statistik die Option Frequenz der T-Zellen aus. Klicken Sie dann auf Tabelle erstellen, um die Häufigkeit in einer neuen Tabelle anzuzeigen.

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