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Análisis del ciclo celular: Evaluación de la proliferación de células T CD4 y CD8 después de la estimulación mediante la tinción CFSE y la citometría de flujo

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Para la mayoría de los estudios de inmunología, la medición de la proliferación de células inmunitarias es un paso clave y el método basado en tintes fluorescentes CFSE se utiliza comúnmente. La división celular adecuada es importante para las células inmunitarias, ya que regula tanto los niveles como la especificidad de una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, las células T proliferan para identificar y matar las células cancerosas y las células B se someten a división celular para producir anticuerpos específicos. La premisa general del ensayo CSFE consiste en manchar las células con el tinte fluorescente verde CFSE, que entra en células vivas y se une de forma estable a las proteínas en su interior, lo que resulta en un etiquetado permanente. Como resultado, cuando la célula madre que contiene el tinte se divide, cada célula hija obtiene la mitad de la fluorescencia de la célula padre.

Este proceso continúa en las divisiones posteriores con la intensidad del tinte disminuyendo progresivamente con cada división. En el punto final deseado, la intensidad de fluorescencia de cada célula se mide por citometría de flujo. Estos datos se utilizan para cuantificar el número y el patrón de divisiones por las que han pasado las celdas. Como se muestra aquí, la población celular con la fluorescencia más alta es de la generación padre. La segunda más alta pertenece a la segunda generación y así sucesivamente. El número de picos determina el número de divisiones de celda.

Además, si se utilizan células inmunitarias primarias, las poblaciones celulares específicas, como las células T, por ejemplo, pueden etiquetarse con un tinte de fluorescencia de diferentes colores junto con CFSE, y se pueden identificar simultáneamente mediante citometría de flujo multicolor. Los nuevos datos se pueden trazar en el mismo gráfico, mostrando ahora la subpoblación de células T con diferentes intensidades de tinción CFSE, mediante la cual se puede analizar específicamente la tasa de proliferación de las células T. Este vídeo demuestra el protocolo para la tinción CFSE de los esplenocitos de ratón, que se estimulan con un anticuerpo anti-CD3. Esto es seguido por la tinción para etiquetar las células T y la citometría de flujo para rastrear su proliferación celular.

Para empezar, ponte ropa protectora adecuada y guantes de laboratorio. A continuación, lave un par de fórceps y diseccione las tijeras primero con un detergente y luego con 70% de etanol y luego séquelos con una toalla de papel limpia. Prepare 50 mililitros de solución sal equilibrada de Hank, o HBSS, con una concentración del 2% de suero de pantorrilla fetal, o FCS, combinando un mililitro de FCS con 49 mililitros de HBSS en un tubo de 50 mililitros. Mezcle pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces. A continuación, aísle las células del bazo del ratón como se muestra en el protocolo de vídeo para el aislamiento FACS de linfocitos B esplénicos.

Etiquete cuatro tubos de 15 mililitros uno a cuatro y agregue una por 10 a la séptima célula aislada del bazo. A continuación, agregue tres mililitros de HBSS 2% FCS a cada tubo. Luego, pipetear un microlitro de cinco micromolares carboxifluoresceína éster de succinimidilo, o CFSE, en cada tubo. Incubar los tubos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante 10 minutos. Las células en los tubos uno y dos no serán estimuladas. Se utilizarán para revelar el nivel basal de proliferación de células T esplénicas CD4 y CD8.

Pipetear 10 mililitros de HBSS 2% FCS en estos tubos. Los tubos tres y cuatro serán estimulados por anticuerpos anti-CD3 para observar los efectos en el ciclo celular. Añadir 10 mililitros de anticuerpos HBSS 2% FCS y anti-CD3 a una concentración final de 2,5 microgramos por mililitro a los tubos tres y cuatro. A continuación, centrifugar todos los tubos a 370 x g durante siete minutos a 10 grados centígrados. Descarta los supernatantes. Resuspenda los pellets en dos mililitros de HBSS 2% FCS y pipetee las soluciones resultantes en pozos separados en una placa de seis pocillos. Etiquete cuidadosamente la placa de uno a cuatro para realizar un seguimiento de las identidades de la muestra. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante tres días.

En el tercer día, agregue dos mililitros de HBSS 2% FCS a los pozos uno y tres, que deben contener las células de los tubos uno y tres. Pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente y luego transferir las muestras en tubos FACS etiquetados de cinco mililitros. Vuelva a colocar la placa de seis pocillos en la incubadora. Estas células restantes de los pozos dos y cuatro se analizarán en el día cinco para investigar los efectos a largo plazo de la estimulación en el ciclo celular. Centrifugar los tubos a 370 x g durante siete minutos a 10 grados centígrados y luego desechar los sobrenatonos. Ahora, agregue 100 microlitros de mezcla de anticuerpos a cada tubo. Incubar los tubos durante 20 minutos sobre hielo en la oscuridad. A continuación, agregue un mililitro de HBSS 2% FCS a cada tubo y centrifugar los tubos a 370 x g durante siete minutos a 10 grados centígrados. Descarta los supernatantes. Vuelva a suspender los pellets en 200 mililitros de HBSS 2% FCS y mezclar bien. Transfiera los pellets resuspendidos a los nuevos tubos FACS etiquetados.

A continuación, evalúe la proliferación de células T mediante la citometría de flujo como se muestra en el protocolo FACS. Acote las células a seleccionar células linfoides CD3 positivas y para distinguir las células CD4 positivas y CD8 positivas, y registre los datos de los tubos uno y tres. En el quinto día, repita el proceso de tinción celular con las células de los dos pozos restantes de la placa de seis pocillos.

Analizaremos los efectos de la estimulación CD3 en el ciclo celular de las células CD4 y CD8-positivas a los tres días y cinco días después de la estimulación. Para comenzar, haga clic en el icono FlowJo y arrastre sus archivos a la ventana Todos los ejemplos. Haga doble clic en el archivo de las celdas no estimuladas recopiladas en el tercer día para mostrar una gráfica de puntos con dispersión hacia delante en el eje Y y dispersión lateral en el eje X. Haga clic en polígono para rodear las poblaciones de linfocitos en función de su morfología. En la ventana de identificación de la subpoblación, asigne un nombre a los linfocitos de población y haga clic en Aceptar. A continuación, haga doble clic en la población en círculos y en la nueva ventana, seleccione Thy1.2 en el eje Y y CD3 en el eje X. Luego, haga clic en polígono para rodear las celdas positivas dobles CD3 y Thy1.2. En la nueva ventana de identificación de subpoblación, asigne un nombre a las células T de población y haga clic en Aceptar. A continuación, haga doble clic en la población en círculos. En la nueva ventana, seleccione CD4 en el eje Y y CD8 en el eje X. A continuación, haga clic en polígono para rodear la población de CD4 positivos. En la nueva ventana de identificación de subpoblación, asigne a la población el nombre CD4 T-Cells y haga clic en Aceptar. Ahora, haga clic en polígono para rodear la población con cd8 positivos. En la nueva ventana de identificación de subpoblación, asigne a la población el nombre CD8 T-Cells y haga clic en Aceptar. Repita estos pasos con los otros archivos.

Para determinar las frecuencias de las celdas divisorias y no divisorias, primero, visualice las poblaciones de celdas haciendo clic en Editor de diseño. A continuación, arrastre las células T CD4 y las células T CD8 de cada uno de los cuatro tubos a la ventana Toda la muestra. Aparecerán gráficos que representan sus poblaciones. Para cada tubo, haga doble clic en la gráfica de puntos para las celdas T CD8 y seleccione Histograma en Definición de gráfico para visualizar los resultados. Seleccione CFSE como parámetro para comparar las poblaciones de células estimuladas frente a las no estimuladas en cada punto de tiempo. Las células no divisorias mantienen niveles más altos de CFSE, mientras que las células que proliferan dividen el contenido de CFSE en células divisorias.

Ahora, mientras presiona la tecla Mayús, haga doble clic en el histograma. En la nueva ventana, haga clic en el rango y seleccione el rango de CFSE correspondiente al pico más alto. En la ventana de identificación de subpoblación, asigne a la población el nombre Células T CD8 no divisorias y etiquete la población Dividiendo células CD8. Ahora, repita para seleccionar las células T CD4 divisorias y no divisoras en cada tubo. Para examinar la frecuencia de división de celdas cd3 positivas, haga clic en Editor de tablas. A continuación, arrastre las poblaciones de interés, Dividiendo LAS Células T CD8 y Dividiendo las Células T CD4, en la tabla. En el menú Estadística, seleccione Frecuencia de celdas T. A continuación, haga clic en Crear tabla para mostrar la frecuencia en una nueva tabla.

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