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16S rRNA-Sequenzierung: Eine PCR-basierte Technik zur Identifizierung bakterieller Arten

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Die Erde ist die Heimat von Millionen von Bakterienarten, jede mit einzigartigen Eigenschaften. Die Identifizierung dieser Arten ist bei der Bewertung von Umweltproben von entscheidender Bedeutung. Ärzte müssen auch verschiedene Bakterienarten unterscheiden, um infizierte Patienten zu diagnostizieren.

Um Bakterien zu identifizieren, können eine Vielzahl von Techniken eingesetzt werden, einschließlich mikroskopischer Beobachtung der Morphologie oder Deswachstum auf einem bestimmten Medium, um koloniemorphologische zu beobachten. Genetische Analyse, eine andere Technik zur Identifizierung von Bakterien hat in den letzten Jahren an Popularität gewonnen, zum Teil aufgrund der 16S ribosomalen RNA-Gensequenzierung.

Das bakterielle Ribosom ist ein Protein-RNA-Komplex, der aus zwei Untereinheiten besteht. Die 30S-Untereinheit, die kleinere dieser beiden Untereinheiten, enthält 16S rRNA, die durch das 16S rRNA-Gen in der genomischen DNA kodiert wird. Spezifische Regionen von 16S rRNA sind aufgrund ihrer wesentlichen Funktion in der Ribosom-Montage hochkonserviert. Während andere Regionen, weniger wichtig für die Funktion, kann zwischen Bakterienarten variieren. Die variablen Regionen in 16S rRNA können als einzigartige molekulare Fingerabdrücke für Bakterienarten dienen, so dass wir phänotypisch identische Stämme unterscheiden können.

Nach Erhalt einer Qualitätsprobe von gDNA kann PCR des 16S rRNA-Codierungsgens beginnen. PCR ist eine häufig verwendete molekularbiologische Methode, die aus Zyklen der Denaturierung der doppelsträngigen DNA-Vorlage, dem Glühen von universellen Primerpaaren, die hochkonservierte Regionen des Gens verstärken, und der Erweiterung von Primern durch DNA-Polymerase besteht. Während einige Primer den größten Teil des 16S rRNA-Codierungsgens verstärken, verstärken andere nur Fragmente davon. Nach pcR können die Produkte mittels Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert werden. Wenn die Amplifikation erfolgreich war, sollte das Gel ein einzelnes Band von einer erwarteten Größe enthalten, abhängig vom verwendeten Primerpaar, bis zu 1500bp, der ungefähren Länge des 16S rRNA-Gens.

Nach der Reinigung und Sequenzierung können die erhaltenen Sequenzen dann in die BLAST-Datenbank eingegeben und mit Referenzsequenzen von 16S rRNA verglichen werden. Da diese Datenbank Übereinstimmungen auf der Grundlage der höchsten Ähnlichkeit zurückgibt, ermöglicht dies die Bestätigung der Identität der Bakterien von Interesse. In diesem Video beobachten Sie die 16S rRNA-Gensequenzierung, einschließlich PCR, DNA-Sequenzanalyse und -bearbeitung, Sequenzmontage und Datenbanksuche.

Beim Umgang mit Mikroorganismen ist es wichtig, eine gute mikrobiologische Praxis zu befolgen, einschließlich der Verwendung aseptischer Technik und des Tragens geeigneter persönlicher Schutzausrüstung. Nach durchführung einer geeigneten Risikobewertung für den Mikroorganismus oder die Umweltprobe von Interesse, erhalten Sie eine Testkultur. In diesem Beispiel wird eine reine Kultur von Bacillus subtilis verwendet.

Zunächst wachsen Sie Ihren Mikroorganismus auf einem geeigneten Medium unter den entsprechenden Bedingungen an. In diesem Beispiel wird Bacillus subtilis 168 in LB-Brühe über Nacht in einem Schüttel-Inkubator angebaut, der auf 200 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius eingestellt ist. Als nächstes verwenden Sie ein kommerziell erhältliches Kit, um genomische DNA oder gDNA aus 1,5 Millilitern der B. subtilis Nachtkultur zu isolieren.

Um die Qualität der isolierten DNA zu überprüfen, mischen Sie zunächst fünf Mikroliter der isolierten gDNA mit einem Mikroliter DNA-Gel-Ladefarbstoff. Dann laden Sie die Probe auf ein 0,8% Agarose-Gel, das DNA-Färbungsreagenz enthält, wie SYBR safe oder EtBr. Danach einen ein Kilobase-Molekularmassenstandard auf das Gel laden und die Elektrophorese so lange ausführen, bis der Vorderfarbstoff etwa 0,5 Zentimeter vom Boden des Gels entfernt ist. Sobald die Gelelektrophorese abgeschlossen ist, visualisieren Sie das Gel auf einem blauen Lichttransilluminator. Die gDNA sollte als dickes Band erscheinen, über 10 Kilobase in der Größe und haben minimale Verschmierung.

Um anschließend serielle Verdünnungen der gDNA zu erstellen, beschriften Sie drei Mikrozentrifugenröhrchen als 10X, 100X und 1000X. Verwenden Sie dann eine Pipette, um 90 Mikroliter steriles destilliertes Wasser in jede der Rohre zu geben. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter der gDNA-Lösung in die 10X-Röhre. Pipette das gesamte Volumen nach oben und unten, um sicherzustellen, dass die Lösung gründlich gemischt wird. Entfernen Sie dann 10 Mikroliter der Lösung aus dem 10X-Rohr und übertragen Sie diese in das 100X-Rohr. Mischen Sie die Lösung wie zuvor beschrieben. Schließlich übertragen Sie 10 Mikroliter der Lösung in der 100X-Röhre, auf die 1000X-Röhre.

Um das PCR-Protokoll zu beginnen, tauen Sie die notwendigen Reagenzien auf Eis auf. Bereiten Sie dann den PCR-Master-Mix vor. Da die DNA-Polymerase bei Raumtemperatur aktiv ist, muss die Reaktion auf Eis erfolgen. Aliquot 49 Mikroliter des Master-Mix in jede der PCR-Röhren. Dann fügen Sie einen Mikroliter Schablone zu jedem der Versuchsröhrchen und einen Mikroliter sterilen Wassers in das negative Kontrollrohr, Pipettieren nach oben und unten, um zu mischen. Danach stellen Sie die PCR-Maschine entsprechend dem in der Tabelle beschriebenen Programm ein. Legen Sie die Rohre in den Thermocycler und starten Sie das Programm.

Sobald das Programm abgeschlossen ist, untersuchen Sie die Qualität Ihres Produkts durch Agarose-Gel-Elektrophorese, wie zuvor gezeigt. Eine erfolgreiche Reaktion mit dem beschriebenen Protokoll sollte zu einem einzigen Band von ca. 1,5 Kilobase führen. In diesem Beispiel lieferte die Probe, die 100X verdünnte gDNA enthielt, das produkthöchste Qualität. Als nächstes reinigen Sie das beste PCR-Produkt, in diesem Fall die 100X gDNA, mit einem handelsüblichen Kit. Jetzt kann das PCR-Produkt zur Sequenzierung gesendet werden.

In diesem Beispiel wird das PCR-Produkt mit Vorwärts- und Reverse-Primern sequenziert. So werden zwei Datensätze erzeugt, die jeweils eine DNA-Sequenz und ein DNA-Chromatogramm enthalten: einer für den Vorwärtsprimer und der andere für den umgekehrten Primer. Untersuchen Sie zunächst die Chromatogramme, die aus jedem Primer erzeugt werden. Ein ideales Chromatogramm sollte gleichmäßig verteilte Spitzen mit wenig bis gar keinen Hintergrundsignalen haben.

Wenn die Chromatogramme doppelte Spitzen anzeigen, können mehrere DNA-Vorlagen in den PCR-Produkten vorhanden gewesen sein, und die Sequenz sollte verworfen werden. Wenn die Chromatogramme Spitzen in verschiedenen Farben an der gleichen Stelle enthielten, wurde die Sequenzierungssoftware wahrscheinlich falsch als Nukleotide bezeichnet. Dieser Fehler kann manuell in der Textdatei identifiziert und korrigiert werden. Das Vorhandensein breiter Spitzen im Chromatogramm deutet auf einen Auflösungsverlust hin, der zu einer Fehlzählung der Nukleotide in den zugehörigen Regionen führt. Dieser Fehler ist schwer zu korrigieren, und Inkongruenzen in einem der nachfolgenden Schritte sollten als unzuverlässig behandelt werden. Schlechte Chromatogramm-Lesequalität, die durch das Vorhandensein mehrerer Spitzen angezeigt wird, tritt in der Regel an den fünf Prim- und drei Primenden der Sequenz auf. Einige Sequenzierungsprogramme entfernen diese Abschnitte mit geringer Qualität automatisch. Wenn Ihre Sequenz nicht automatisch abgeschnitten wurde, identifizieren Sie die Fragmente niedriger Qualität, und entfernen Sie deren entsprechende Basen aus der Textdatei.

Verwenden Sie ein DNA-Montageprogramm, um die beiden Primersequenzen in einer kontinuierlichen Sequenz zusammenzubauen. Denken Sie daran, dass Sequenzen, die mit Vorwärts- und Rückwärtsprimern erhalten wurden, sich teilweise überlappen sollten. Fügen Sie im DNA-Montageprogramm die beiden Sequenzen im FASTA-Format in die entsprechende Box ein. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Senden, und warten Sie, bis das Programm die Ergebnisse zurückgibt.

Um die zusammengebaute Sequenz anzuzeigen, klicken Sie auf Contigs in der Ergebnis-Registerkarte. Um dann die Details der Ausrichtung anzuzeigen, wählen Sie Die Baugruppendetails aus. Navigieren Sie zur Website für das grundlegende Suchwerkzeug für lokale Ausrichtungen (BLAST), und wählen Sie das Nukleotid-BLAST-Tool aus, um ihre Sequenz mit der Datenbank zu vergleichen. Geben Sie Ihre Sequenz in das Textfeld der Abfragesequenz ein und wählen Sie die entsprechende Datenbank im Bildlauf-Down-Menü aus. Klicken Sie schließlich auf die SCHALTFLÄCHE BLAST am unteren Rand der Seite, und warten Sie, bis das Tool die ähnlichsten Sequenzen aus der Datenbank zurückgibt.

In diesem Beispiel ist der Top-Treffer B. subtilis-Stamm 168, der eine 100%ige Identität mit der Sequenz in der BLAST-Datenbank anzeigt. Wenn der Top-Treffer nicht 100% Identität zu Ihrer erwarteten Art oder Sorte zeigt, klicken Sie auf die Sequenz, die Ihrer Abfrage am ehesten entspricht, um die Details der Ausrichtung anzuzeigen. Ausgerichtete Nukleotide werden durch kurze vertikale Linien verbunden, und nicht übereinstimmende Nukleotide haben Lücken zwischen ihnen. Konzentrieren Sie sich auf die identifizierten nicht übereinstimmenden Regionen, überarbeiten Sie die Reihenfolge und wiederholen Sie die BLAST-Suche, falls gewünscht.

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