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16S rRNA测序:基于PCR的技术,用于识别细菌物种
 

16S rRNA测序:基于PCR的技术,用于识别细菌物种

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地球是数以百万计的细菌物种的家园,每个物种都有独特的特征。识别这些物种对于评估环境样本至关重要。医生还需要区分不同的细菌种类来诊断感染的病人。

为了识别细菌,可以使用多种技术,包括对特定介质上的形态或生长进行微观观察,以观察菌群形态。基因分析是另一种识别细菌的技术,近年来越来越受欢迎,部分是由于16S核糖体RNA基因测序。

细菌核糖体是一种蛋白质RNA复合物,由两个亚单位组成。30S 亚单位,这两个亚单位中较小的,包含 16S rRNA,由基因组 DNA 中包含的 16S rRNA 基因编码。16S rRNA 的特定区域由于在核糖体组装中的基本功能而高度保存。而其他地区,不太关键的功能,可能不同细菌物种。16S rRNA 中的可变区域可作为细菌物种的独特分子指纹,使我们能够区分表象相同的菌株。

获得gDNA质量样本后,16S rRNA编码基因的PCR可以开始。PCR是一种常用的分子生物学方法,包括双链DNA模板变性周期、通用引物对退火(扩增基因高度保守的区域)以及DNA聚合酶对引物的延伸。虽然一些引源扩增了大多数16S rRNA编码基因,但其他引体只放大了它的碎片。PCR后,可通过胶质胶电泳对产物进行分析。如果扩增成功,凝胶应包含一个预期大小的单带,具体取决于所使用的底漆对,最高为1500bp,即16S rRNA基因的近似长度。

经过纯化和测序,获得的序列可以输入BLAST数据库,与参考16S rRNA序列进行比较。由于此数据库基于最高相似性返回匹配,因此可以确认感兴趣的细菌的身份。在本视频中,您将观察 16S rRNA 基因测序,包括 PCR、DNA 序列分析和编辑、序列组装和数据库搜索。

在处理微生物时,必须遵循良好的微生物实践,包括使用无菌技术和穿戴适当的个人防护设备。对感兴趣的微生物或环境样本进行适当的风险评估后,获得测试培养物。在此示例中,使用了纯亚氏杆菌区域性。

首先,在适当的条件下,在合适的介质上生长微生物。在本例中,在LB肉汤中生长一夜,在37摄氏度的摇动培养箱中设置为200rpm。接下来,使用市售试剂盒从1.5毫升的B.subtilis过夜培养物中分离基因组DNA或gDNA。

为了检查分离的DNA的质量,首先将5微升的分离gDNA与一微升的DNA凝胶加载染料混合。然后,将样品加载到含有DNA染色试剂的0.8%角糖凝胶中,如SYBR安全剂或EtBr。在此之后,将一千基分子质量标准加载到凝胶上,并运行电泳,直到前染料距离凝胶底部约 0.5 厘米。凝胶电泳完成后,在蓝光转光器上可视化凝胶。gDNA 应显示为一个厚带,大小超过 10 千基,并且具有最小的涂抹。

之后,要创建 gDNA 的连续稀释,将三个微离心管标记为 10X、100X 和 1000X。然后,使用移液器将 90 微升无菌蒸馏水放入每个管中。接下来,在 10X 管中加入 10 微升的 gDNA 溶液。上下移移整个体积,以确保溶液彻底混合。然后,从 10X 管中取出 10 微升溶液,并将其转移到 100X 管中。混合解决方案,如前所述。最后,将10微升溶液在100X管中转移到1000X管中。

要开始 PCR 协议,在冰上解冻必要的试剂。然后,准备 PCR 主组合。由于DNA聚合酶在室温下是活跃的,因此反应必须发生在冰上。将49微升的主混合物混合到每个PCR管中。然后,在每个实验管中加入一个微升模板,在负控制管中加入一微升无菌水,上下移液混合。在此之后,根据表中描述的程序设置 PCR 机器。将管子放入热循环器中,然后启动程序。

程序完成后,通过胶质电泳检查产品质量,如前所述。使用所述协议的成功反应应产生大约 1.5 千碱的单个波段。在此示例中,含有 100X 稀释 gDNA 的样品产生了最高质量的产品。接下来,用市售的试剂盒来纯化最好的PCR产品,在本例中为100X gDNA。现在,PCR 产品可以发送进行测序。

在此示例中,PCR 产品使用正向和反向引漆进行排序。因此,生成两个数据集,每个数据集包含 DNA 序列和 DNA 色谱图:一个用于正向引体,另一个用于反向引色。首先,检查从每个引漆生成的色谱图。理想的色谱图应具有均匀间距的峰值,几乎没有背景信号。

如果色谱图显示双峰,PCR 产品中可能存在多个 DNA 模板,应丢弃序列。如果色谱图在同一位置包含不同颜色的峰值,则测序软件可能误称核苷酸。可以在文本文件中手动识别和更正此错误。色谱中存在宽峰表示分辨率损失,导致相关区域的核苷酸计数错误。此错误很难更正,任何后续步骤中的不匹配都应被视为不可靠。色谱图读数质量差,由存在多个峰值指示,通常发生在序列的五个素数和三个素端。某些排序程序会自动删除这些低质量部分。如果序列未自动截断,请识别低质量片段,并从文本文件中删除各自的基。

使用 DNA 组装程序将两个引体序列组装成一个连续序列。请记住,使用正向和反向引漆获得的序列应部分重叠。在 DNA 装配程序中,以 FASTA 格式将两个序列插入相应的框中。然后,单击提交按钮并等待程序返回结果。

要查看已装配的序列,请单击结果选项卡中的"Contigs"。然后,要查看对齐的详细信息,请选择装配体详细信息。导航到网站的基本本地对齐搜索工具,或BLAST,并选择核苷酸BLAST工具,以比较您的序列与数据库。在查询序列文本框中输入序列,并在向下滚动菜单中选择相应的数据库。最后,单击页面底部的 BLAST 按钮,然后等待该工具从数据库中返回最相似的序列。

在此示例中,命中数最高的是B. subtilis应变 168,显示与 BLAST 数据库中序列的 100% 标识。如果热门命中未显示您预期物种或应变的 100% 标识,请单击与您的查询最匹配的序列以查看对齐的详细信息。对齐的核苷酸将由短的垂直线连接,不匹配的核苷酸之间会有间隙。聚焦已识别的不匹配区域,修改序列并根据需要重复 BLAST 搜索。

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