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16S séquençage de l'ARNr : une technique à base de PCR pour identifier les espèces bactériennes

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La Terre abrite des millions d'espèces bactériennes, chacune ayant des caractéristiques uniques. L'identification de ces espèces est essentielle à l'évaluation des échantillons environnementaux. Les médecins doivent également distinguer différentes espèces bactériennes pour diagnostiquer les patients infectés.

Pour identifier les bactéries, une variété de techniques peuvent être utilisées, y compris l'observation microscopique de la morphologie ou de la croissance sur un média spécifique pour observer la morphologie des colonies. L'analyse génétique, une autre technique pour identifier les bactéries a gagné en popularité ces dernières années, en partie en raison du séquençage du gène de l'ARN ribosomal 16S.

Le ribosome bactérien est un complexe d'ARN protéique composé de deux sous-unités. La sous-unité 30S, la plus petite de ces deux sous-unités, contient 16S rRNA, qui est codé par le gène 16S rRNA contenu dans l'ADN génomique. Les régions spécifiques de 16S rRNA sont fortement conservées, en raison de leur fonction essentielle dans l'assemblage de ribosome. Tandis que d'autres régions, moins critiques pour fonctionner, peuvent varier entre les espèces bactériennes. Les régions variables dans l'ARNr 16S, peuvent servir d'empreintes moléculaires uniques pour les espèces bactériennes, ce qui nous permet de distinguer les souches phénotypiquement identiques.

Après avoir obtenu un échantillon de qualité de gDNA, PCR du gène de codage 16S rRNA peut commencer. PCR est une méthode de biologie moléculaire couramment utilisée, consistant en des cycles de dénaturation du modèle d'ADN à double brin, l'annexion des paires d'apprêt universels, qui amplifient les régions hautement conservées du gène, et l'extension des amorces par la polymérase d'ADN. Alors que certains amorces amplifient la plupart du gène de codage 16S rRNA, d'autres ne font qu'amplifier des fragments de celui-ci. Après PCR, les produits peuvent être analysés par électrophoresis de gel d'agarose. Si l'amplification a été un succès, le gel devrait contenir une seule bande d'une taille prévue, selon la paire d'amorce utilisée, jusqu'à 1500bp, la longueur approximative du gène 16S rRNA.

Après la purification et le séquençage, les séquences obtenues peuvent ensuite être entrées dans la base de données BLAST, où elles peuvent être comparées avec des séquences de référence 16S rRNA. Comme cette base de données retourne les correspondances basées sur la similitude la plus élevée, cela permet de confirmer l'identité des bactéries d'intérêt. Dans cette vidéo, vous observerez le séquençage du gène 16S rRNA, y compris le PCR, l'analyse et l'édition de séquences d'ADN, l'assemblage de séquences et la recherche de bases de données.

Lors de la manipulation des micro-organismes, il est essentiel de suivre de bonnes pratiques microbiologiques, y compris en utilisant la technique aseptique et le port d'équipement de protection individuelle approprié. Après avoir effectué une évaluation appropriée des risques pour le micro-organisme ou l'échantillon environnemental d'intérêt, obtenir une culture d'essai. Dans cet exemple, une culture pure de Bacillus subtilis est utilisée.

Pour commencer, développez votre micro-organisme sur un milieu approprié dans les conditions appropriées. Dans cet exemple, Bacillus subtilis 168 est cultivé dans le bouillon LB pendant la nuit dans un incubateur secouant réglé à 200 tr/min à 37 degrés Celsius. Ensuite, utilisez un kit disponible dans le commerce pour isoler l'ADN génomique ou l'ADN g de 1,5 millilitres de la culture de nuit B. subtilis.

Pour vérifier la qualité de l'ADN isolé, d'abord mélanger cinq microlitres de l'ADN g isolé avec un microlitre de colorant de chargement de gel d'ADN. Ensuite, chargez l'échantillon sur un gel agarose de 0,8 %, contenant un réactif de coloration de l'ADN, comme sYBR sûr ou EtBr. Après cela, chargez une norme de masse moléculaire d'un kilobase sur le gel, et exécutez l'électrophorèse jusqu'à ce que le colorant avant soit à environ 0,5 centimètre du fond du gel. Une fois l'électrophoresis de gel terminée, visualisez le gel sur un transilluminator de lumière bleue. L'ADNc doit apparaître comme une bande épaisse, au-dessus de 10 kilobase sa taille et avoir un minimum de frottis.

Après cela, pour créer des dilutions en série de l'ADNc, étiqueter trois tubes de microcentrifuge comme 10X, 100X, et 1000X. Ensuite, utilisez une pipette pour distribuer 90 microlitres d'eau distillée stérile dans chacun des tubes. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de la solution gDNA au tube 10X. Pipette tout le volume de haut en bas pour s'assurer que la solution est mélangée à fond. Ensuite, retirez 10 microlitres de la solution du tube 10X et transférez-le dans le tube 100X. Mélanger la solution telle qu'elle a été décrite précédemment. Enfin, transférer 10 microlitres de la solution dans le tube 100X, sur le tube 1000X.

Pour commencer le protocole PCR, décongeler les réactifs nécessaires sur la glace. Ensuite, préparez le mix PCR master. Étant donné que la polymérase d'ADN est active à température ambiante, la réaction installée doit se produire sur la glace. Aliquot 49 microlitres du mélange maître dans chacun des tubes PCR. Ensuite, ajoutez un microlitre de modèle à chacun des tubes expérimentaux et un microlitre d'eau stérile au tube de commande négatif, pipetting de haut en bas pour mélanger. Après cela, définir la machine PCR en fonction du programme décrit dans le tableau. Placez les tubes dans le thermocycler et commencez le programme.

Une fois le programme terminé, examinez la qualité de votre produit par électrophoresis de gel d'agarose, comme précédemment démontré. Une réaction réussie utilisant le protocole décrit devrait donner une bande simple d'environ 1.5 kilobase. Dans cet exemple, l'échantillon contenant 100X d'ADN dilué a donné le produit de la plus haute qualité. Ensuite, purifier le meilleur produit PCR, dans ce cas, l'ADN 100X g, avec un kit disponible dans le commerce. Maintenant, le produit PCR peut être envoyé pour le séquençage.

Dans cet exemple, le produit PCR est séquencé à l'aide d'amorces avant et inverses. Ainsi, deux ensembles de données, chacun contenant une séquence d'ADN et un chromatogramme d'ADN, sont générés : l'un pour l'amorce avant et l'autre pour l'amorce inverse. Tout d'abord, examiner les chromatogrammes générés par chaque amorce. Un chromatogramme idéal devrait avoir des pics espacés uniformément avec peu ou pas de signaux de fond.

Si les chromatogrammes affichent des pics doubles, plusieurs modèles d'ADN peuvent avoir été présents dans les produits PCR et la séquence doit être jetée. Si les chromatogrammes contenaient des pics de différentes couleurs au même endroit, le logiciel de séquençage probablement mal appelé nucléotides. Cette erreur peut être identifiée manuellement et corrigée dans le fichier texte. La présence de larges pics dans le chromatogramme indique une perte de résolution, ce qui provoque une mauvaise dépouillement des nucléotides dans les régions associées. Cette erreur est difficile à corriger et les décalages dans l'une ou l'autre des étapes suivantes doivent être considérés comme peu fiables. Une mauvaise qualité de lecture du chromatogramme, indiquée par la présence de pics multiples, se produit habituellement aux cinq extrémités principales et aux trois extrémités principales de la séquence. Certains programmes de séquençage suppriment automatiquement ces sections de mauvaise qualité. Si votre séquence n'a pas été tronquée automatiquement, identifiez les fragments de mauvaise qualité et supprimez leurs bases respectives du fichier texte.

Utilisez un programme d'assemblage d'ADN pour assembler les deux séquences d'amorce en une seule séquence continue. N'oubliez pas que les séquences obtenues à l'aide d'amorces avant et arrière devraient se chevaucher partiellement. Dans le programme d'assemblage d'ADN, insérez les deux séquences en format FASTA dans la case appropriée. Ensuite, cliquez sur le bouton Soumettre et attendre que le programme retourne les résultats.

Pour afficher la séquence assemblée, cliquez sur Contigs dans l'onglet résultats. Ensuite, pour afficher les détails de l'alignement, sélectionnez les détails d'assemblage. Naviguez sur le site Web pour l'outil de recherche d'alignement local de base, ou BLAST, et sélectionnez l'outil blast nucléotide pour comparer votre séquence à la base de données. Entrez votre séquence dans la boîte de texte de séquence de requête et sélectionnez la base de données appropriée dans le menu défilement vers le bas. Enfin, cliquez sur le bouton BLAST au bas de la page, et attendez que l'outil retourne les séquences les plus similaires de la base de données.

Dans cet exemple, le hit le plus haut est la souche 168 de B. subtilis, montrant l'identité à 100% avec la séquence dans la base de données BLAST. Si le coup supérieur n'affiche pas l'identité à 100 % de votre espèce ou souche attendue, cliquez sur la séquence qui correspond le plus étroitement à votre requête pour voir les détails de l'alignement. Les nucléotides alignés seront rejoints par de courtes lignes verticales et les nucléotides dépareillés auront des espaces entre eux. En se concentrant sur les régions dépareillées identifiées, révisez la séquence et répétez la recherche BLAST si vous le souhaitez.

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