Name: Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprenda a purificar e visualizar complexos de ribonucleoproteínas virais do influenza A usando centrifugação em gradiente de glicerol e microscopia eletrônica de transmissão. Este método permite analisar a estrutura dos vRNPs com clareza.

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Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Canadense para a Inovação (CFI), o Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR), e as Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia Council of Canada (NSERC).

Parte 1: Rompimento da Influenza A Virion <ol><li> Adicionar 750 mL de tampão MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) em um tubo de centrífuga Beckman policarbonato (11 mm x 34 mm) projetado para caber em um rotor TLA-120,2 para uso em um Optima Beckman Max-E ultracentrífuga. </li><li> Adicionar 500 mL do vírus influenza A (H3N2 X-31 A/AICHI/68 tensão; 2 mg / ml) em que o tubo. Misture o vírus com o buffer MNT pipetando cima e para baixo várias vezes. </li><li> Centrifugar por 10 minutos a 109.000 xg, 4 ° C, em uma centrífuga Beckman Optima Max-E usando um rotor TLA-120,2. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 mL de buffer interrupção (100 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 5% (w / v) de glicerol, 50 octylglucoside mM, 10 mg / ml lysolecithin, 1,5 mM ditiotreitol, 100 mM MES, pH 5,5). </li><li> Vortex vigorosamente, e em seguida, agitar a 31 ° C por 20 minutos em um Thermomixer eppendorf. </li></ol> Parte 2: O glicerol Gradient Centrifugação Velocity Sedimentos <ol><li> Prepare um gradiente de glicerol, colocando as seguintes quantidades de glicerol em um tubo de centrífuga Beckman UltraClear (13 mm x 51 mm): 1 ml de 70% (v / v) de glicerol, 0,75 ml de glicerol 50%, 0,375 ml de glicerol 40%, e 1,8 ml de glicerol 33%. Soluções de glicerol são feitos através da mistura de glicerol puro com tampão NM (150 mM NaCl, 50 mM MES, pH 5,5). Também preparar um tubo de equilíbrio contendo tanto glicerol e buffer. </li><li> Vortex da amostra viral interrompeu novamente, e coloque-os no gradiente de glicerol. </li><li> Centrifugar o gradiente para 3,75 horas em 217.000 xg, 4 ° C, em um MLS-50 Beckman rotor balançando-balde. </li><li> Após a centrifugação é completa, coletar manualmente 250 mL alíquotas do gradiente a partir do topo do tubo. Mantenha frações no gelo ou a 4 ° C. </li></ol> Parte 3: Análise das Frações Gradient Glicerol por SDS Eletroforese em Gel de Poliacrilamida <ol><li> Remover 20 l de cada fração para um novo tubo. </li><li> Adicionar 5 mL de tampão de amostra SDS-PAGE 5x. </li><li> Calor a 95 ° C por 5 minutos. </li><li> Girar as amostras de forma breve e carregá-los em um gel de poliacrilamida 10%, e os marcadores de peso molecular em um dos poços. </li><li> Executar os exemplos sobre o gel até o corante azul de bromofenol carregamento chega perto do fundo do gel. </li><li> Manchar o gel com Coomassie blue. </li></ol> Parte 4: Concentração das frações vRNP <ol><li> Escolha as frações de glicerol contendo principalmente NP, combiná-los e distribuí-los em dois tubos de centrífuga Beckman policarbonato (11 mm x 34 mm). </li><li> Preencher cada tubo com dietil pyrocarbonate (DEPC) tratados com água ultrapura, e pipeta cima e para baixo várias vezes para misturar. </li><li> Centrífuga de 4,5 horas a 157.000 xg, 4 ° C, em um TLA-120,2 Beckman rotor. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 50 ul de água tratada DEPC-. </li><li> Se desejar, o 280 A do vRNPs concentrada pode ser medido. Como NP é o principal componente presente nas frações agrupadas, uma estimativa da molaridade de NP pode ser calculada usando seu coeficiente de extinção de 55.350 M -1 cm -1 (como determinado através ProtParam 3). </li><li> Alíquota do vRNPs purificado, e armazená-las congeladas a -80 ° C para uso posterior. </li></ol> Parte 5: Coloração Negativa de vRNPs <ol><li> Diluir 1 ml de vRNP purificada em 9 mL de recém-feitos e filtrada duas vezes-tampão MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5). Buffers outros também são OK para diluir o vRNPs e para lavar a grade de amostra (passo 5.5), mas não use PBS se acetato de uranila é usado para a coloração negativa. </li><li> De descarga luminescente grade um espécime (TEM cobre) previamente revestida com uma película de carbono e parlodion por 30 segundos. </li><li> Segure a grade espécime recém-brilho-alta com uma pinça, e aplicar uma queda de 5 mL de vRNP diluído na grade da amostra. </li><li> Deixe a gota de amostra na grade por 8 minutos. </li><li> Enquanto espera, coloque uma pequena tira de Parafilm no banco, e dispensar 2 gotas contendo 10 ml cada um buffer de MNT (para lavar a grade), e uma queda de 80 mL da solução de coloração feita recentemente (1 molibdato de amônio ou 1% acetato de uranila%) para o Parafilm. </li><li> Após os 8 minutos de adsorção, pavio de parte da solução da amostra a partir da rede amostra com um pedaço de papel de filtro (cortado em triângulos). Não deixe que a grade de amostra para secar. </li><li> Lavar grade amostra em 2 gotas contendo 10 ml cada um buffer de MNT para um tempo total de 1 minuto. Isto é feito com cuidado redução da grade amostra na queda, e depois wicking de parte da solução da amostra a partir da rede amostra com um pedaço de papel de filtro (sem deixar a grade amostra seca). </li><li> Imediatamente após wicking fora a última gota de tampão da rede de espécime, completasubmergir ly grade da amostra dentro da gota da mancha e esperar um minuto. </li><li> Pavio completamente off a solução mancha da rede amostra com um pedaço de papel de filtro. </li><li> Permitir que a grade espécime secarem por alguns minutos antes da observação ao microscópio eletrônico de transmissão. </li></ol> Parte 6: Resultados Representante: <img src="/files/ftp_upload/old/1105_2009_1_22_1/1105_Figure2.png" alt="Figura 2" width="600" height="215" /> Figura 1 Como influenza A NP (~ 56 kDa) é a principal proteína encontrada em complexos ribonucleoproteína viral, a banda NP geralmente é o mais forte da banda nas frações contendo o vRNPs (Figura 1). Além de NP, cada vRNP influenza também contém uma cópia de uma RNA polimerase trimérico (pesos moleculares de kDa 82, 86 e 86,5) complexo. Estes podem ou não ser visíveis por Coomassie coloração azul porque a sua abundância é baixa comparada com a de PN. O polimerases, no entanto, pode ser detectado se, em vez de um azul Commassie mancha, uma mancha de prata do gel é realizada. A proteína de matriz M1 influenza (~ 28 kDa) deve ser minimamente presentes nas frações onde o NP frações pico de proteína estão presentes. <img src="/files/ftp_upload/old/1105_2009_1_22_2/1105_3.png" alt="Figura 3" width="600" height="360" /> Figura 2 VRNPs negativamente manchada como visto sob um microscópio eletrônico de transmissão deve render vRNPs que se assemelham em forma de bastonete partículas com comprimento variável, que são cerca de 30 nm até 120 nm de comprimento (Figura 2a). O NP oligomérica é organizada como uma cadeia de moléculas de NP que é ainda mais dobrada em uma estrutura de dupla hélice repetir, assim loops de ambos os extremos destas partículas em forma de bastonete às vezes pode ser visto (Figura 2b).

<ol><li>Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+microinjected+influenza+virus+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins.</a> Virology. 202, 1028-1033 (1994).</li>
<li>Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+the+nuclear+localization+sequences+on+influenza+a+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes.</a> J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).</li>
<li>Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGasteiger%2C+E+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).</li>
<li>Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+import+of+influenza+A+viral+ribonucleoprotein+complexes+is+mediated+by+two+nuclear+localization+sequences+on+viral+nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein.</a> Virol J. 4, 49-49 (2007).</li>
<li>Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single-particle+tracking+to+study+nuclear+trafficking+of+viral+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes.</a> Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).</li>
</ol>

A purificação da vRNPs é baseado no procedimento descrito por Kemler et al. (1994). 1 Nós e os outros também têm usado este protocolo para isolar vRNPs para estudar sua importação nuclear. 2,4,5 Recomendamos o uso de RNase dicas e tubos ao manipular vRNPs porque o genoma viral é composto de RNA, e, portanto, degrada facilmente na presença de RNA. Além disso, todos os buffers deve ser feita em água que é RNase livre. O protocolo aqui descrito foi realizado com u...

<table><tbody><tr><td>H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A</td><td>Charles River Laboratories</td><td>490715</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8250</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Octilglicosídeo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O-8001</td><td></td></tr><tr><td>Lisolecitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4129</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotretol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9779</td><td></td></tr><tr><td>Azul brilhante de Coomassie G-250</td><td>Kodak</td><td>1367796</td><td></td></tr><tr><td>Água tratada com pirocarbonato de dietila (DEPC)</td><td>Invitrogen</td><td>750024</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranila</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>19481</td><td></td></tr><tr><td>Moilbdata de amônio</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-674</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Optima MAX-E</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>434491</td><td></td></tr><tr><td>Pacote de rotor MLS-50, de balde oscilante</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de rotor TLA-120.2, de ângulo fixo, em titânio</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer</td><td>Lauda Brinkmann</td><td>022670000</td><td></td></tr></tbody></table>

purificação e visualização de influenza a complexos de ribonucleoproteínas viral

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

A influenza A genoma viral é composto por oito sentido negativo, as moléculas de RNA de fita única, embalados individualmente com várias cópias da influenza A nucleoproteína (NP) em partículas ribonulceoprotein viral (vRNPs). O vRNPs influenza são colocados dentro do envelope viral. Durante a entrada de celulares, no entanto, esses complexos vRNP são liberados para o citoplasma, onde eles ter acesso ao equipamento de transportes anfitrião nuclear. A fim de estudar a importação nuclear de vRNPs influenza ea replicação do genoma da gripe, é útil para trabalhar com vRNPs isolada de modo que outros componentes do vírus não interferem com estes processos. Aqui, descrevemos um procedimento para purificar essas vRNPs do vírus influenza A. O procedimento começa com o rompimento da influenza A virion com detergentes, a fim de liberar os complexos vRNP do virion envolvido. O vRNPs são então separados dos outros componentes da influenza A virion em um gradiente de glicerol 33-70% descontínua por sedimentação velocidade. As frações obtidas a partir do gradiente de glicerol são analisados ​​na via SDS-PAGE após coloração com Coomassie blue. As frações de pico contendo NP são então reunidos e concentrados por centrifugação. Após a concentração, a integridade do vRNPs é verificada através da visualização do vRNPs por microscopia eletrônica de transmissão após coloração negativa. A purificação do gradiente de glicerol é uma modificação do que a partir de Kemler<em&gt; Et al.</em&gt; (1994)<sup&gt; 1</sup&gt;, Ea coloração negativa foi realizado por Wu<em&gt; Et al.</em&gt; (2007).<sup&gt; 2</sup

O genoma do vírus influenza A é composto por oito complexos separada de RNA e proteínas, denominadas complexos de ribonucleoproteínas viral (vRNPs). Este artigo descreve a purificação gradiente glicerol e transmissão de visualização microscopia eletrônica de influenza A vRNPs.

Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral

O genoma do vírus influenza A consiste em oito moléculas de RNA de fita simples e sentido negativo, individualmente empacotadas com múltiplas cópias da influenza A ...

Este procedimento começa removendo qualquer detrito do vírus da influenza por centrifugação. Em seguida, a membrana viral é rompida com o detergente e os VR nps liberados são separados em um gradiente de glicerol.As frações de centrifugação provenientes do gradiente são coletadas e uma alíquota de cada fração é analisada. Em uma eletroforese SDS-PAGE, os géis são corados com azul de Comassie para determinar as frações de pico contendo V NPS. As frações contendo as V NPS são então concentradas por centrifugação e os VRPs purificados são aplicados em uma grade de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de cobre, a qual é posteriormente negativamente contrastada para visualização dos VRPs por microscopia eletrônica de transmissão. Olá, sou WinCo Wu no laboratório da Dra. Nellie Pane no Departamento de Zoologia da Universidade da Colúmbia Britânica.Sou Lindsay Weaver, anteriormente do Laboratório Pane. Hoje mostraremos um procedimento para a purificação de complexos de proteína nucleocapsidial ribonucleica de influenza. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a importação nuclear do vírus da influenza A em células de cultura de tecidos.Então vamos começar. Pa

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Research

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Biology

Biologia

Este método descreve o uso de sistema de imagem de Infravermelhos corante baseada em para a detecção de A H1N1 no bronchioalveolar o lavado de fluido (BAL) de camundongos infectados em uma alta sensibilidade. Esta metodologia pode ser realizado em um 96 - ou 384-bem prato, requer &lt;volume de 10 uL de material de teste e tem o potencial para a triagem concomitante de agentes patogénicos múltiplos.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Neste artigo, um simples, quantitativa, na fase líquida ensaio de captura de afinidade é apresentado. É uma técnica fiável baseada na interacção entre as esferas magnéticas e proteínas marcadas (por exemplo, nanocorpos), por um lado ea afinidade entre a proteína marcada e uma proteína, segundo rotulada (por exemplo, poliovírus) sobre o outro.

A fase líquida ensaio de captura de afinidade usando pérolas magnéticas para estudar interação proteína-proteína: O Exemplo Poliovírus Nanobody-

Os vírus da gripe replicar seu genoma de RNA em associação com a célula hospedeira da cromatina. Aqui, apresentamos um método para purificar intactos os complexos de ribonucleoproteínas virais da cromatina das células infectadas. Purificou complexos virais podem ser analisados ​​por Western blot e tanto de extensão do primer de proteína e do conteúdo de ARN, respectivamente.

Purificação por afinidade de Complexos de Influenza Virus ribonucleoproteína da cromatina de células infectadas

Este protocolo de co-imunoprecipitação permite estudar a interação entre a nucleoproteína do vírus influenza A e a proteína antiviral Mx1 em células humanas. O protocolo enfatiza a importância da N-etilmaleimida para a co-imunoprecipitação bem-sucedida da nucleoproteína Mx1 e do vírus influenza A.

Co-imunoprecipitação da proteína do rato Mx1 com a nucleoproteína do vírus da gripe A

Fornecemos uma nova estratégia para isolar compartimentos de replicação viral (RC) de células humanas infectadas com adenovírus (Ad). Essa abordagem representa um sistema livre de células que pode ajudar a elucidar os mecanismos moleculares que regulam a replicação e expressão do genoma viral, bem como a regulação das interações viral-hospedeiro estabelecidas no RC.

Isolamento de Frações Sub-nuclear Viral Replication Compartimento enriquecidas de Adenovirus-infectados células normais Humanos

A desmontagem dos núcleos do vírus influenza A durante a entrada do vírus nas células hospedeiras é um processo de várias etapas. Descrevemos um método in vitro para analisar os estágios iniciais do desrevestimento viral. Nesta abordagem, a centrifugação por gradiente de velocidade é usada para dissecar bioquimicamente as etapas que iniciam o desrevestimento sob condições definidas.

In Vitro A desmontagem do vírus influenza A capsï¿½eos por centrifugação em gradiente

Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese de partículas semelhantes a vírus, seja através de baculovírus ou sistemas de expressão de mamíferos e purificação ultracentrifugação. Esta abordagem altamente personalizada é utilizado para identificar antigénios virais como alvos de vacinas de maneira segura e flexível.

Expressão e purificação de partículas semelhantes a vírus para a vacinação

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Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

Um ânion trocar o método à base de resina, adaptado para amostragem de bioaerosol baseado em choque de vírus é demonstrada o líquido. Quando acoplado com deteção molecular a jusante, o método permite a fácil e sensível de detecção de vírus de Bioaerossóis.

Detecção de vírus de Bioaerossóis usando resina de troca de ânion

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Determinação estrutural de hemaglutinina de resolução subnanométrica a partir de tomografia crioeletrônica de vírus influenza

Aprenda a purificar e visualizar complexos de ribonucleoproteínas virais do influenza A usando centrifugação em gradiente de glicerol e microscopia eletrônica de transmissão. Este método permite analisar a estrutura dos vRNPs com clareza.

Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral

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