Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral

Este procedimento começa removendo quaisquer detritos da gripe. Uma solução de vírus por centrifugação. A membrana viral é então interrompida com o detergente e a liberação para VR nps é separada em um gradiente de glicerol.

Recolhem-se as fracções de centrifugação do gradiente e executa-se uma alíquota de cada fracção Em uma página SDS, os géis corados com azul de kumasi para determinar as frações de pico contendo frações V nps contendo o V NPS são então concentrados por centrifugação e os VRPs purificados são aplicados a uma grade de amostra TEM de cobre, que é então corada negativamente para visualização dos VRPs por microscopia eletrônica de transmissão. Olá, sou WinCo Wu no laboratório da Dra. Nellie Pane no Departamento de Zoologia da Universidade da Colúmbia Britânica.

Eu sou Lindsay Weaver, ex-membro do Pane Lab. Hoje vamos mostrar-lhe um procedimento para a purificação da gripe, um complexo de proteínas do núcleo da costela viral. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a importação nuclear do vírus influenza, A em células de cultura de tecidos.

Então vamos começar. Para iniciar o experimento, use 750 microlitros de tampão MNT em um tubo centrífugo de policarbonato Beckman de 11 milímetros por 34 milímetros. Em seguida, adicione 500 microlitros de uma solução de dois miligramas por mililitro de vírus influenza, A na pipeta do tubo para cima e para baixo várias vezes para misturar o vírus com o tampão MNT.

Após a mistura, coloque o tubo em um rotor TLA one 20.2 e centrifugue em uma centrífuga Beckman Optima max E por 10 minutos a 109.000 vezes G a quatro graus Celsius. Quando a rotação estiver concluída, remova o sobrenadante e, em seguida, suspenda o pellet em um vórtice tampão de ruptura de 500 microlitros. O pellet ressuspenso vigorosamente e depois agitar a 31 graus Celsius por 20 minutos em um misturador térmico einor.

Quando a agitação estiver concluída, prossiga com a centrifugação da velocidade do sedimento do gradiente de glicerol. Para preparar o gradiente de glicerol, coloque o seguinte glicerol em um tubo de centrífuga Beckman UltraClear de 13 milímetros por 51 milímetros, um mililitro 70% volume por volume GLICEROL 0.75 mililitro 50% glicerol 0.375 mililitro, 40% glicerol e 1.8 mililitros, 33% glicerol. Essas soluções de glicerol são feitas misturando glicerol puro com tampão NM.

Prepare também um tubo de equilíbrio contendo glicerol e tampão. Em seguida, vórtice a amostra viral interrompida novamente e carregue-a no gradiente de glicerol. Coloque o tubo em um rotor de caçamba oscilante Beckman MLS 50 e centrifugue o gradiente por três horas e 45 minutos a 217.000 vezes G a quatro graus Celsius.

Após a conclusão da centrifugação, colete manualmente alíquotas de 250 microlitros do gradiente a partir do topo do tubo. Mantenha as frações no gelo ou a quatro graus Celsius. Uma vez que as frações são coletadas, estamos prontos para analisá-las usando eletroforese em gel de poliacrilamida SDS.

Para iniciar a análise da página SDS, remova 20 microlitros de cada fração para um tubo novo. Em seguida, adicione cinco microlitros de cinco vezes o tampão de amostra de página SDS e aqueça a amostra a 95 graus Celsius por cinco minutos Após o aquecimento, gire as amostras brevemente e carregue-as em um gel de poliacrilamida a 10% com marcadores de peso molecular em um dos poços. Em seguida, passe as amostras pelo gel até que o corante de carregamento de azul de fenol brom chegue perto do fundo do gel.

Remova o gel do aparelho de página SDS e manche o gel com azul kumasi. Com base nos resultados da coloração, identifique as frações que contêm principalmente influenza. Uma proteína de núcleo.

A NP da influenza A tem aproximadamente 56 kilodaltons de tamanho e é a principal proteína encontrada nos complexos de ribonucleoproteínas virais. Portanto, a banda NP geralmente é a banda mais forte nas frações que contêm o VRN ps. Na próxima parte, vamos concentrar essas frações VRNP.

Combine as frações de glicerol contendo principalmente NP e distribua-as em dois tubos centrífugos de policarbonato Beckman de 11 milímetros por 34 milímetros, encha cada tubo com pirocarbonato de etila ou água ultrapura tratada com DEPC. Em seguida, pipete para cima e para baixo várias vezes para misturar. Coloque os tubos em um rotor Beckman TLA one 20.2 e centrifugue por quatro horas e meia a 157.000 vezes G a quatro graus Celsius.

Quando a centrifugação estiver concluída, remova o sobrenadante e ressuspenda o chumbinho. Em 50 microlitros de alíquota de água tratada com DEPC, o V NPS purificado separa uma alíquota e armazena as outras a 80 graus Celsius negativos. Agora estamos prontos para prosseguir com a coloração negativa dos VRPs.

Dilua um microlitro de VRNP purificado em nove microlitros de buffer PBS recém-feito e filtrado duas vezes descarregue uma grade de amostra TEM de cobre por 30 segundos. Esta grade foi previamente revestida com um Parlow Dion e filme de carbono. Usando uma pinça para segurar a grade de amostra de descarga de brilho recente, aplique uma gota de cinco microlitros de VRNP diluído na grade de amostra.

Deixe a gota ser absorvida na grade por oito minutos enquanto espera. Coloque uma pequena tira de perfume em uma bandeja e, em seguida, distribua sobre o perfume duas gotas contendo 10 microlitros de tampão PBS cada, bem como uma gota de 80 microlitros da solução de coloração recém-feita, que é composta de 1% de tâmara meli de amônio. Agora lave a grade de amostra baixando-a cuidadosamente nas duas gotas de PBS por um tempo total de um minuto.

Em seguida, use um pedaço de papel de filtro para retirar parte da solução de amostra da grade de amostra sem deixar a grade de amostra secar. Imediatamente após a absorção da última gota de tampão da grade da amostra, submergiu completamente a grade da amostra dentro da gota da mancha. E espere um minuto.

Após um minuto, use um novo pedaço de papel de filtro para remover completamente a solução de mancha da grade da amostra. Deixe a grade de amostras secar ao ar por vários minutos antes da observação. Sob um microscópio eletrônico de transmissão, aqui estão imagens representativas de microscopia eletrônica de transmissão de V nps coradas negativamente.

Como você pode ver aqui, o V NPS se assemelha a partículas em forma de bastonete com comprimento variável que têm aproximadamente 30 nanômetros a 120 nanômetros de comprimento. O NP oligomérico é organizado como uma cadeia de moléculas NP que é posteriormente dobrada em uma estrutura de repetição helicoidal dupla. Portanto, às vezes podem ser vistos laços em ambas as extremidades dessas partículas em forma de bastonete.

Acabamos de mostrar como purificar e visualizar a gripe. Um complexo de nucleoproteína de costela viral Ao fazer este procedimento. É importante não usar PBS ao diluir o mps VR se você estiver usando acetato de mictório para coloração negativa.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.