Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
-Börja med att placera självbefruktande maskar i deras sista larvstadium på tallrikar sådda med en bakteriell matkälla. Låt larverna utvecklas till mogna vuxna tills det finns ett överflöd av ägg i maskar och läggs på plattorna. Tvätta plattorna med buffert för att samla ägg och maskar.
Byt sedan ut bufferten mot blekmedelslösning som löser upp vuxna maskar. Skyddad av äggskalet kommer embryon att överleva denna behandling, även om de kommer att vara i olika utvecklingsstadier. Byt sedan ut blekmedlet mot buffert och låt embryona utvecklas. När larver kläcker från sina äggskal i avsaknad av mat, kommer utvecklingen att pausa vid det första larvstadiet.
Överför larverna till tallrikar med mat för att återuppta utvecklingen. Detta kommer att stimulera synkron progression genom de återstående larvstadierna.
När maskar når det sista larvstadiet, flytta dem till tallrikar med mat och FUdR, en DNA-synteshämmare som förhindrar produktion av avkommor. Fortsatt utveckling i närvaro av FUdR producerar en population av sterila vuxna maskar. I det här experimentet synkroniserar vi en population av nematoden C. elegans.
-Till att börja med, överför L4 larver av önskad genetisk bakgrund till en nysådd gräsmatta av Escherichia coli på nematodtillväxtmedier eller NGM-plattor. Använd minst två 100 millimeter eller tre 60 millimeters plattor för varje stam.
Inkubera maskarna vid lämplig tillväxttemperatur i tre till fyra dagar eller tills plattorna är koncentrerade med ett stort antal ägg och gravidmaskar. Tvätta bort ägg och maskar från plattorna med cirka sex milliliter M9-buffert per 100 millimeters tallrik nematoder. Använd pastörpipetter i glas och överför ägg och maskar till enskilda 15 milliliter centrifugerör för varje stam. Snurra ner rören i tre minuter till 6 180 g.
Efter centrifugation, aspirera ut M9-bufferten som behåller bara djuret och äggpelleten. Tillsätt tre till fyra milliliter blekmedel till varje rör och virvel i sex minuter.
Tillsätt sedan M9-buffert för att fylla varje rör och snurra på 6 180 g i en minut. Aspirera supernaten och upprepa denna tvätt med M9 tre gånger.
Efter tvätten, flytta äggpelleten till ett friskt 15 milliliter rör som innehåller cirka nio milliliter M9-buffert. Synkronisera de nykläckta maskarna genom att muttra vid 20 grader Celsius i 16 till 48 timmar.
Efter att ha snurrat ner dessa rör på 6 180 g i 1,5 minuter, lägg ner de synkroniserade L1-djuren på en nysådd gräsmatta av OP50 på enskilda NGM-plattor. Håll plattorna på 20 grader Celsius tills djuren når L4 larvstadiet efter cirka 42 timmar. Använd vid denna tidpunkt ett platinaplock för att flytta L4-larverna till OP50-sådda NGM-plattor som innehåller 0,5 milligram per milliliter FUdR för att förhindra att de producerar avkomma.
