Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Encyclopedia of Experiments
Encyclopedia of Experiments: Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Nematod Senkronizasyonu

 
Click here for the English version

Nematod Senkronizasyonu: Gelişimin Özdeş Aşamalarında Solucan Popülasyonlarını Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

-Kendi kendini dölleyen solucanları son larva evrelerine bakteriyel bir besin kaynağı ile tohumlanmış tabaklara yerleştirerek başlayın. Solucanların içinde bol miktarda yumurta olana ve tabaklara yatırılana kadar larvaların olgun yetişkinlere dönüşmesine izin verin. Yumurtaları ve solucanları toplamak için plakaları tamponla yıkayın.

Daha sonra, tamponu yetişkin solucanları çözen çamaşır suyu çözeltisi ile değiştirin. Yumurta kabuğu tarafından korunan embriyolar, gelişimin farklı aşamalarında olmalarına rağmen bu tedaviden sağ çıkacaktır. Daha sonra çamaşır suyunu tamponla değiştirin ve embriyoların gelişmesine izin verin. Larvalar yiyeceklerin yokluğunda yumurta kabuklarından çıktıkça, gelişim ilk larva aşamasında duraklayacaktır.

Larvaları gelişmeye devam etmek için yiyeceklerle tabaklara aktarın. Bu, kalan larva aşamalarında senkron ilerlemeyi teşvik edecektir.

Solucanlar son larva aşamasına ulaştığında, onları yiyecek ve yavruların üretimini engelleyen bir DNA sentez inhibitörü olan FUdR ile tabaklara taşıyın. FUdR varlığında devam eden gelişme, steril yetişkin solucan popülasyonu üretir. Bu deneyde, nematod C. eleganspopülasyonu senkronize edeceğiz.

-Başlamak için, istenen genetik geçmişlerin L4 larvalarını nematod büyüme ortamı veya NGM plakaları üzerinde taze tohumlu bir Escherichia coli çimine aktarın. Her suş için en az iki adet 100 milimetre veya üç adet 60 milimetre plaka kullanın.

Solucanları üç ila dört gün boyunca veya plakalar çok sayıda yumurta ve gravid solucanı ile konsantre olana kadar uygun büyüme sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Yumurtaları ve solucanları, 100 milimetrelik nematod tabağı başına yaklaşık altı mililitre M9 tamponu kullanarak tabaklardan yıkayın. Cam Pasteur pipetler kullanarak, yumurtaları ve solucanları her suş için ayrı ayrı 15 mililitre santrifüj tüplerine aktarın. Bu tüpleri 6,180 g'da üç dakika aşağı çevirin.

Santrifüjlemeden sonra, sadece hayvan ve yumurta peletini tutan M9 tamponunu epire edin. Her tüpe üç ila dört mililitre çamaşır suyu çözeltisi ekleyin ve altı dakika boyunca aralıklı girdap ekleyin.

Ardından her tüpü doldurmak için M9 tamponu ekleyin ve bir dakika boyunca 6.180 g'da döndürün. Süpernatantı aspire edin ve bu yıkamayı M9 ile üç kez tekrarlayın.

Yıkamadan sonra, yumurta peletini yaklaşık dokuz mililitre M9 tampon içeren taze bir 15 mililitrelik tüpe taşıyın. Taze yumurtadan çıkan solucanları 16 ila 48 saat boyunca 20 santigrat derecede fındık yaparak senkronize edin.

Bu tüpleri 1,5 dakika boyunca 6,180 g'da aşağı döndürdükten sonra, senkronize edilmiş L1 hayvanlarını tek tek NGM plakalarında taze tohumlanmış op50 çimlerine koyun. Hayvanlar yaklaşık 42 saat sonra L4 larva aşamasına ulaşana kadar plakaları 20 santigrat derecede tutun. Şu anda, L4 larvalarını, soy üretmelerini önlemek için mililitre FUdR başına 0,5 miligram içeren OP50 tohumlu NGM plakalarına taşımak için bir platin pick kullanın.

Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter